TP de génétique microbienne

Extraction d’ADN bactérien

Il y a quatre étapes principales pour extraire les acides
nucléiques
 La lyse des cellules
 La dénaturation des protéines et des complexes
nucléoprotéiques
 L’inactivation des nucléases
 La purification des acides nucléiques (ADN ou ARN)
• Les cellules peuvent être lysées par des méthodes chimiques (à
l’aide de détergents comme le CTAB, SDS, etc.) enzymatiques
(ex. protéinase K, lysozyme, zymolase, etc.),
• Après la lyse, les protéines et les complexes nucléoprotéiques
sont dénaturés par des détergents ioniques (ex. SDS). La
protéinase K peut être également utilisée pour la digestion des
protéines.
• Les nucléases sont ensuite inactivées par les agents chélateurs
comme l’EDTA souvent inclus dans les tampons de lyse.
• A l’issue des trois premières étapes, les acides nucléiques sont
dans un mélange (ou un lysat de cellules) incluant des débris
cellulaires, tels que les protéines, les lipides, les polysaccharides,
etc. Ces impuretés inhibent généralement les réactions
enzymatiques (qPCR, RT-qPCR, séquençage, méthylation, etc). Il
est donc essentiel d’éliminer ces impuretés pour obtenir les ADN
ou les ARN dans une préparation pure.
• Purification par solvant organique

Les ADN sont des molécules chargées négativement en raison des

groupements phosphate dans leur squelette.
Ils sont insolubles dans les solvants organiques hydrophobes et
solubles dans les solutions aqueuses hydrophiles.

Les ADN peuvent être isolés avec un mélange contenant du phénol,

du chloroforme et de l’alcool.
Après la centrifugation, les ADN se trouvent dans la phase aqueuse
supérieure et sont précipités avec de l’éthanol en présence d’acétate
de sodium.
• Cette méthode douce permet de conserver l’intégrité des ADN
et reste une méthode de choix pour isoler des ADN de grande
taille (jusqu’à 1 Mbp). Mais, les solvants organiques sont
toxiques et le protocole est long.
• La méthode de purification utilisant des solvants organiques
est couramment utilisée car la lyse est efficace et les nucléases
sont inactivées (car les protéines sont dénaturées par le
phénol). Cette approche permet également de co-purifier les
ADN, les ARN et les protéines à partir d’un même échantillon.