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Biologie médicale
[90-10-0005]

Acides aminés

Philippe Parvy : C adre supérieur médicotechnique.

Daniel Rabier : Docteur.

Laboratoire de biochimie B, hôpital Necker-Enfants-Malades, 145, rue de Sèvres, 75743 Paris cedex
15 France

Résumé
Les acides aminés sont présents dans de nombreux liquides physiologiques (sang, urine, liquide
céphalorachidien, liquide amniotique). Leur concentration dans ces divers liquides biologiques
rend compte de leur métabolisme (production et utilisation) dans l'organisme. Les variations de
concentration sont corrélées aux variations (physiologiques ou pathologiques) du flux à travers
les voies métaboliques impliquées. L'analyse des acides aminés est réalisée par
chromatographie d'échange d'ions avec coloration postcolonne à la ninhydrine. Le système
analytique utilisé doit permettre de séparer et quantifier environ 50 composés ninhydrine
positifs. Ce type d'analyse permet de diagnostiquer ou de suspecter de nombreuses
aminoacidopathies et d'en suivre le traitement diététique.

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INTÉRÊT PHYSIOPATHOLOGIQUE

Dans les organismes vivants, les acides aminés ont une triple fonction : éléments constitutifs
des protéines, éléments du métabolisme intermédiaire et précurseurs des amines biogéniques.
Certains acides aminés ne sont pas des éléments constitutifs des protéines et n'existent dans
les organismes que sous forme libre. On distingue les acides aminés indispensables qui doivent
obligatoirement être fournis à l'organisme par l'alimentation car celui-ci est incapable de les
synthétiser et les acides aminés non indispensables que l'organisme est capable de synthétiser
à partir de précurseurs azotés et carbonés grâce à des systèmes enzymatiques appropriés. La
concentration des acides aminés dans les liquides biologiques résulte :

de l'apport alimentaire et du catabolisme protéique endogène, d'une part;

de leur utilisation pour la synthèse protéique et le métabolisme oxydatif tissulaire,
d'autre part.

L'analyse des acides aminés dans les liquides biologiques présente un intérêt diagnostique
pour la plupart des aminoacidopathies, qu'elles soient liées à des anomalies de transport
membranaire ou à des enzymopathies affectant leur catabolisme. Elle est l'outil indispensable
au suivi thérapeutique de ces patients. À travers les nombreuses anomalies secondaires qui
peuvent être mises en évidence, elle est informative pour de nombreuses autres pathologies et
dysfonctionnements d'organes et permet d'orienter les investigations complémentaires. Enfin,
elle est largement utilisée dans le domaine nutritionnel.

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ÉTAPE PRÉANALYTIQUE

Milieux biologiques et modalités de recueil

Les échantillons le plus souvent utilisés sont le plasma et l'urine, plus rarement le liquide
céphalorachidien. L'association de l'analyse des acides aminés urinaires et plasmatiques
prélevés concomitamment apporte des informations pertinentes.

Sang veineux
Le prélèvement sanguin (au pli du coude) est effectué le matin à jeun après une nuit de jeûne
physiologique ou, lorsqu'il s'agit d'un nourrisson, le plus éloigné possible de la prise du biberon.
Le sang (3 mL), est recueilli sur héparine sèche. L'échantillon est soit transmis à +4 °C au
laboratoire dans la demi-heure qui suit, soit centrifugé à +4 °C. Le plasma est alors
immédiatement décanté et congelé à -20 °C (ou mieux à -80 °C).

Sang capillaire
Comme dans la phénylcétonurie, un prélèvement de quelques gouttes de sang capillaire
déposées sur papier «Guthrie» peut aussi être utilisé pour le suivi thérapeutique des patients
atteints de leucinose et de tyrosinémie de type II.

Urines
Un échantillon urinaire (10 mL) de la première miction matinale correspondant à la totalité des
urines de la nuit qui précède est recueilli. S'il existe des mictions nocturnes, elles sont
conservées au réfrigérateur à +4 °C puis soigneusement mélangées. L'échantillon est soit
transmis rapidement dans la glace au laboratoire soit congelé à -20 °C (ou mieux à -80 °C).
Dans certaines situations particulières, il peut être nécessaire de quantifier une élimination
journalière (suivi thérapeutique d'une cystinurie par exemple). Dans ce cas, les mictions du
nycthémère sont conservées au réfrigérateur à +4 °C, puis mélangées. Le volume total est noté
et un échantillon d'environ 10 mL prélevé puis transporté au laboratoire dans la glace.

En cas de décompensation, le recueil des urines correspondant à cette période est souhaitable.

Liquide céphalorachidien
Un volume de 0,5 mL non hémorragique est recueilli dans un tube sec. Les conditions de
transport au laboratoire sont identiques à celles du plasma.

Liquide amniotique
Le dosage des acides aminés du liquide amniotique peut aussi être effectué comme aide au
diagnostic prénatal des déficits en argininosuccinate synthétase, argininosuccinate lyase et
sulfite oxydase.

Le respect scrupuleux des instructions définies permet d'éviter la transformation des acides
aminés instables ainsi que la disparition des acides aminés soufrés [2].

Prétraitement des échantillons

Les échantillons sont immédiatement après décongélation, déprotéinisés. La méthode le plus

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largement répandue utilise l'acide sulfosalicylique à la concentration finale de 30 mg/mL
d'échantillon (plasma, urine, liquide céphalorachidien, liquide amniotique). Le surnageant peut
être congelé à - 20 °C (ou mieux à -80 °C). À -20 °C, en dehors du tryptophane qui est instable
et de la glutamine dont la stabilité est inférieure à 1 mois (transformation en acide glutamique),
tous les autres acides aminés peuvent être conservés pendant au moins 1 an [4].

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TECHNIQUES DE DOSAGE ET PERFORMANCES DES TECHNIQUES

Technique chromatographique d'échange d'ions couplée à une détection

colorimétrique à deux longueurs d'onde (570 et 440 nm) après réaction avec la
ninhydrine [9]
Les acides aminés sont séparés en faisant appel à une colonne de résine synthétique
échangeuse de cations (polystyrène sulfoné). Cette résine est équilibrée avec une solution
d'hydroxyde de lithium de façon à ce que les groupements acides sulfoniques soient sous forme
de sels de lithium. L'échantillon à analyser, dans lequel ont été ajoutés un ou deux étalons
internes, est ajusté à pH 2,2 puis injecté au sommet de la colonne. Les aminoacides, sous forme
cationique, déplacent les ions Li+de la résine et s'y fixent plus ou moins solidement en fonction
de leur degré d'ionisation. En augmentant progressivement le pH, les concentrations salines
des solutions d'élution ainsi que la température de la colonne, les aminoacides migrent à des
vitesses différentes. Les aminoacides développent avec la ninhydrine, une coloration violette
(détectée à 570 nm), sauf la proline et l'hydroxyproline qui fournissent une coloration jaune
(détectée à 440 nm). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'acide aminé
présente dans le milieu réactionnel. L'étalonnage s'effectue avec des solutions étalons du
commerce qui regroupent les principaux acides aminés. Certaines solutions (sulfocystéine, acide
pipécolique, allo-isoleucine par exemple) doivent être préparées au laboratoire, car elles
n'existent pas dans le commerce. Dans des conditions déterminées, le rapport des absorbances
570 nm/440 nm est caractéristique de chaque acide aminé. Sa mesure peut aider à mettre en
évidence la présence de substances autres que des acides aminés dans l'échantillon analysé.
La sensibilité de cette réaction varie de 10 à 50 picomoles selon les acides aminés. Cette
méthode permet la séparation et la quantification d'environ 50 composés, acides aminés et
dérivés ninhydrine positifs. En fonction des appareillages aujourd'hui disponibles et à sélectivité
comparable, la durée de l'analyse varie de 80 à 180 minutes. La liste des acides aminés et
dérivés d'intérêt physiopathologique détectables dans les liquides physiologiques par cette
technique est rapportée dans le tableau I.

C'est actuellement la technique de choix pour l'analyse des acides aminés.

Autres techniques
Des techniques de chromatographie en phase gazeuse et de chromatographie en phase
inverse avec dérivation précolonne des acides aminés ont aussi été développées. Elles ont
démontré leurs performances dans de nombreuses applications, en particulier pour le dosage
des acides aminés des hydrolysats de protéines nécessitant une grande sensibilité de détection
(<1 pmole). Elles sont aussi utilisées pour doser un acide aminé ou groupe d'acides aminés
(acides aminés ramifiés ou tyrosine-phénylalanine) dans des milieux peu complexes [9].

D'apparition plus récente, la spectrométrie de masse en tandem permet l'analyse de plusieurs

acides aminés sans séparation préalable et peut être utilisée pour analyser des échantillons de
sang prélevés sur papier type «Guthrie». C'est une technique très rapide (3 minutes) qui
présente l'avantage de permettre le dosage d'un grand nombre de molécules à partir d'une
seule analyse et d'en effectuer l'identification formelle.

Des développements sont en cours pour adapter cette technique à la quantification dans les
liquides biologiques de l'ensemble des acides aminés qui présentent un intérêt diagnostique.

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INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS

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L'interprétation des résultats ne peut intervenir qu'après une très rigoureuse validation
analytique. Cette validation n'est pas automatisée. Avec les données des échantillons de
contrôle, elle repose sur l'analyse visuelle des chromatogrammes, des temps de rétention, des
surfaces, des modes d'intégration, des rapports d'absorbance 570/440 nm, des étalons
internes et de chacun des autres pics présents. Les variations de concentration d'un ou de
quelques acides aminés n'ont de sens qu'en regard de la concentration des autres acides
aminés des deux milieux biologiques étudiés (plasma et urine) [1, 6].

Les causes des variations de concentration des acides aminés sont multiples et les résultats
plasmatique et urinaire sont complémentaires pour en effectuer une interprétation. Le
laboratoire doit disposer de valeurs usuelles en fonction de l'âge déterminées dans les
conditions physiologiques et analytiques retenues. Comme cette mesure correspond à un
équilibre, le laboratoire doit aussi obligatoirement disposer des informations cliniques,
diététiques et thérapeutiques susceptibles de le modifier [3, 7].

Variations physiologiques
La durée du jeûne, la nature, la quantité et la qualité de l'alimentation, son mode d'apport ainsi
que l'âge du patient sont les principaux facteurs de variations physiologiques. Des variations
néonatales transitoires dues à l'immaturité de certains systèmes enzymatiques du catabolisme
et du transport membranaire des acides aminés peuvent être présentes : hypertyrosinémie,
hyperhydroxyprolinémie, iminoglycinurie, cystinurie-lysinurie par exemple. Des variations en
fonction du sexe ainsi que des variations nycthémérales ont été mises en évidence mais restent
limitées. Des valeurs de référence pour les différents milieux biologiques sont disponibles [1, 9],
y compris pour un régime normoprotidique de type hospitalier et dans les conditions définies
plus haut [2, 5].

Variations observées dans les pathologies les plus fréquemment rencontrées [8]

Les variations pour lesquelles le diagnostic peut être affirmé sont rassemblées dans le tableau
II.

Les variations à valeur indicative sont rapportées dans le tableau III.

Enfin, les autres causes de variations physiopathologiques figurent dans le tableau IV [1, 6].

Références

[1] Bremer HJ, Duran M, Kamerling JP, Przyrembel H, Wadman SK Disturbances of aminoacid
metabolism: C linical chemistry and diagnosis. Baltimore: Urban and Schwarzenberg1981
[2] Kamoun P, Parvy P, Rabier D Indications et interprétation de la chromatographie des acides
aminés pour le diagnostic des maladies métaboliques. In: Paris: Doin (Ed.) : 1991; 1-13.
[3] Parvy P Modifications des acides aminés plasmatiques et urinaires induites par des
thérapeutiques. Ann Biol Clin 1982 ; 40 : 23-29
[4] Parvy P, Bardet J, Gasquet M, Rabier D, Kamoun P Stability of free amino acids in sulfosalicylic
filtrates. Clin Chem 1995 ; 41 : 145-146
[5] Parvy P, Bardet J, Rabier D, Kamoun P Age related reference values for free aminoacids in first
morning urine specimens. Clin Chem 1988 ; 34 : 2092-2095
[6] Parvy P, Bardet J, Rabier D, Kamoun P A scheme for the interpretation of primary and secondary
disturbances of plasma and urinary amino acid profiles. A possible way to an expert system. Clin
Chim Acta 1995 ; 235 : 1-10 [crossref]
[7] Parvy P, Bardet J, Rabier DM, Saudubray JM, Kamoun PP Ion-exchange chromatography and
clinical criteria in the screening of the aminoacidopathies. Clin Chim Acta 1988 ; 176 : 269-278
[8] Scriver C R, Beaudet AL, Sly WS, Valle D The metabolic basis of inherited disease. New York:
McGraw Hill1989
[9] Slocum RH, C ummings JG Amino acid analysis of physiological samples. In: New York: Wiley-
Liss (Ed.) : 1991; 87-126.

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Tableaux
Tableau I
Tableau I - Acides aminés et dérivés ninhydrine positifs détectables par chromatographie d'échange d'ions
(abréviations usuelles).

Sulfocystéine C ystathionine Hcy(Ala)]

Acide L-cystéine sulfinique Isoleucine (Ile)*
Phosphosérine (Pps) Leucine (Leu)*
Taurine (Tau) Acide argininosuccinique (AAS)
Phosphoéthanolamine (Pea) Tyrosine (Tyr)
Acide - carboxyglutamique C ystéinylglycine (C ys-Gly)
Glycylproline (Gly-Pro)
Aspartylglucosamine (Glc-Nac-Asn)
Disulfure cystéine-homocystéine (C ys-Hcy)
Urée
Prolylglycine (Pro-Gly)
Hawkinsine
Phénylalanine (Phe)*
Acide D- glucosaminique**
Alanylproline (Ala-Pro)
- aspartylglycine
- aspartylalanine N - acétyllysine
C ystéinylglycine (C ys-Gly)
Acide aspartique (Asp) Valylproline (Val-Pro)
Glutathion (forme réduite)
- alanine ( -Ala)
Hydroxyproline (Hyp)
Méthionine sulfoxyde (Met SO) Acide - aminolévulinique (DALA)
Thréonine (Thr)*
Leucylproline (Leu-Pro)
Sérine (Ser)
Asparagine (ASN) Acide - amino-isobutyrique ( -AIB)
Acide glutamique (Glu) Acide argininosuccinique anhydride II
Homosérine Acide - aminobutyrique (GABA)
Glutamine (Gln)
Prolylleucine (Pro-Leu)
Glutathion (forme oxydée)
Homocystine (Hcy)2
Sarcosine (Sar)
3 ÂÂ� hydroxycynurénine
Acide - 1 ÂÂ� pyrroline carboxylique
C ynurénine
Acide - aminoadipique (Aaa) Acide argininosuccinique anhydride I
C ystéine (C ys) Éthanolamine (Etn)
Proline (Pro) Ammoniaque
Glycine (Gly) Aminoéthylcystéine**
Alanine (Ala) Hydroxylysine (Hyl)
Acide formiminoglutamique (FIGLU) Ornithine (Orn)
C itrulline (C it) 1 - méthylhistidine His ( Me)]
N - acétyllysine Histidine (His)*
Lysine (Lys)*
Acide - aminobutyrique (Abu) Tryptophane (Trp)*
Valine (Val)*
3 - méthylhistidine His ( Me)]
Saccharopine (Sac)
C ystine (C ys)2 Ansérine (Ans)
Homocystéine (Hcy) C arnosine (C ar)
Acide pipécolique (Pip) NG ÂÂ� NG -diméthylarginine
Prolylhydroxyproline (Pro-Hyp) NG ÂÂ� NÂÂ}G - diméthylarginine
3,4 ÂÂ� dihydroxyphénylalanine (DOPA) Homocarnosine (Hca)
Méthionine (Met)* Arginine (Arg)
Homocitrulline (Hci) NG - monométhylarginine
Allo-isoleucine (Aile) Homoarginine (Har)

* = acides aminés indispensables ; ** = étalons internes.

Tableau II
Tableau II - Modifications des acides aminés caractéristiques d'aminoacidopathies.

Aminoacidopathie (déficit enzymatique) Anomalies des acides aminés P=plasma, U=urine,

L=leucocytes,
LC R=liquide
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céphalorachidien

Anomalies du cycle de l'urée Augmentation de Arg P+U

Hyperargininémie (arginase) Parfois augmentation de (C ys)2 , U
Acidurie argininosuccinique (argininosuccinate Lys, Orn P+U
lyase) Présence anormale de ASA P+U
Augmentation de C it, Glu+Gln, P
Ala, Lys
Diminution de Arg

C itrullinémie (argininosuccinate synthétase)

Augmentation de C it P+U
Augmentation variable de P+U
Glu+Gln, Ala, Lys P
Diminution de Arg, Orn

Syndrome triple H : hyperammoniémie,

hyperornithinémie, homocitrullinurie (transport de Augmentation de Orn P+U
Orn à travers la membrane mitochondriale) Augmentation variable de P+U
Glu+Gln, Ala, Lys U
Présence anormale de HC i U
Parfois augmentation de (C ys)2 ,
Arg

Anomalies du métabolisme des acides aminés Augmentation de Val, Ile, Leu P+U
ramifiés Présence de aIle P+U
Leucinose (déshydrogénase des cétoacides
ramifiés)

Anomalies du métabolisme des acides aminés Augmentation de (Hcy)2 P+U

soufrés Met augmentée ou normale P+U
Homocystinurie (cystathionine b-synthase) Présence de (C ys-Hcy) P+U
Diminution de (C ys)2 P+U

Homocystinurie (N5-méthylène tétrahydrofolate,

réductase) (N5-méthylène tétrahydrofolate Augmentation de (Hcy)2 P+U
homocystéine méthyltransférase) Met diminuée ou normale P+U
Présence de (C ys-Hcy) P+U
Diminution de (C ys)2 P+U

Déficit en sulfite oxydase (sulfite oxydase)

Présence anormale de P+U
sulfocystéine P+U
Diminution de (C ys)2 ;
augmentation de Tau

Autres enzymopathies Augmentation de Gly P+U+LC R

Hyperglycinémie sans cétose (clivage de la glycine) Augmentation de Tyr P+U
Tyrosinémie type II (tyrosine aminotransférase)

Aspartylglucosaminurie Aucune ou présence anormale de P+U

(Aspartylglucosylaminidase) 2-acétamido-1-L-aspartamido-1,
2-didésoxy D-glucose

Hyperornithinémie (ornithine aminotransférase)

Augmentation de Orn P+U
Augmentation de Orn ; parfois U
augmentation de (C ys)2 , Lys et
Arg

Augmentation de Pro P+U

Hyperprolinémies, type I (proline oxydase) et
type II (pyrroline 5 carboxylate déshydrogénase)

helene.univ-reims.fr:2153/module/displayarticle/article/61007/impression/vue5 6/8
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Anomalies de transport Diminution de Lys, Orn, Arg P
Intolérance familiale aux protéines avec lysinurie Augmentation variable de P
Glu+Gln, Ala, C it, Gly U
Augmentation de Lys U
Augmentation variable de Orn,
Arg, (C ys)2 , C it, HC i, Glu+Gln

C ystinurie Aucune P
Forme homozygote ou hétérozygote composite Augmentation de (C ys)2 , Orn, U
Forme hétérozygote type II ou III Lys, Arg P
Aucune U
Augmentation de (C ys)2 et Lys

C ystinose (trouble de transport lysosomial de la

cystéine) Aucune ou profil insuffisance P+U
rénale ÂÂ� Tubulopathie L
Augmentation de la cystine

Tableau III
Tableau III - Modifications des acides aminés pouvant permettre une orientation diagnostique.

Anomalies des acides aminés Orientations diagnostiques

Plasma Urine

- Déficits en phénylalanine
Augmentation de Phe hydroxylase
- Déficits du métabolisme des
bioptérines

Pas dÂÂ}anomalies ou augmentation

Augmentation de Tyr
Augmentation variable de Met
Diminution variable des
acides aminés ramifiés.
Autres acides
aminés normaux ou
augmentés
modérée de Tyr ou hyperaminoacidurie - Tyrosinémie type I
généralisée - Galactosémie
- Intolérance au fructose
- Atteintes hépatocellulaires
sévères

Gly normale ou augmentée Augmentation de Gly - Acidémies propioniques

Gln normale ou augmentée
Lys normale ou augmentée
Augmentation variable de Gln et Lys
- Acidémies méthylmaloniques
- Acidémies isovalériques
- Glucoglycinurie familiale
- Hyperglycinuries isolées diverses
- Thérapeutiques en particulier
Dépakine   � et Aspégic  �

Augmentation variable de Gln, Augmentations variables de Gln, Ala, Lys - Déficit en N-acétylglutamate
Ala, Lys synthétase
Diminution variable de C it, - Déficits en carbamylphosphate
Orn et Arg synthétase
ou si hyperaminoacidurie généralisée - Déficit en ornithine
carbamyltransférase

- Dysfonctionnements de la chaîne
respiratoire

Aucune Présence anormale de di- et tripeptides à

proline et hydroxyproline - Iminodipeptidurie
- Atteintes osseuses sévères

Augmentation de PEA
- Hypophosphatasie
- Maladies osseuses

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- Désordres endocriniens

Augmentation de Pip
- Acidémie pipécolique
- Maladies peroxysomales

Augmentation de Pro et Ala Augmentation variable de Pro et Ala ou

Gln normale ou augmentée Hyperaminoacidurie généralisée - Hyperlactacidémies congénitales
- Dysfonctionnements de la chaîne
respiratoire

Hypoaminoacidémie majeure Aucune

généralisée - Glucagonome
- Perfusion de glucosé (et
prélèvement à proximité dÂÂ}une
perfusion)

Tableau IV
Tableau IV - Principales causes d'anomalies secondaires des acides aminés.

Hyperammoniémie
Augmentation de Gln
Augmentation variable de Ala et Lys

Hyperlactacidémie
Augmentation de Ala
Augmentation variable de Pro

Atteinte rénale Augmentation de C it, C ys, 3 MeHis

Atteinte hépatique
Augmentation variable de Tyr et Met
Diminution des acides aminés ramifiés
Autres acides aminés normaux ou augmentés

Tubulopathies (syndrome de Fanconi) Hyperaminoacidurie généralisée

Jeûne prolongé
Diminution de Ala
Augmentation des acides aminés ramifiés

Dénutrition; régime hypoprotidique

Hypoaminoacidémie prédominant sur les
acides aminés indispensables

Hyperinsulinisme Diminution des acides aminés ramifiés

Hyperaminoacidémie généralisée
Hypercatabolisme
Souffrance cellulaire

8/8