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LE GENIE GENETIQUE

Depuis les années 70 grâce aux progrès de la génétique microbienne

(découverte de la polymérase, 1957 ; les enzymes de restrictions

1962, la ligase, 1967 ; la transcriptase reverse ; le clonage, 1973), et

de la biologie moléculaire (hybridation, 1975 ; séquençage, 1977 ;

amplification en chaîne PCR, 1985), les expériences de manipulation

de la molécule de l’ADN sont devenues communes. Actuellement la

technologie de l’ADN recombinant permet :

 Le clonage de l’ADN et l’amplification des gènes clonés.

 Le clivage de l’ADN par les endonucléases de restriction et

l’établissement des cartes de restriction des gènes isolés.

 L’hybridation des molécules d’ADN afin d’identifier les

séquences spécifiques d’ADN ou ARN selon leur spécificité à se

lier à une séquence d’acide nucléique complémentaire.

 Le séquençage rapide de tous les nucléotides d’un fragment

d’ADN purifié afin de déterminer, les limites précise d’un gène

et la séquence des acides aminés pour laquelle il code.

 La fabrication et la modification des gènes et leur réinsertion

dans les cellules ou les organismes par utilisation des techniques

de génie génétique.
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Construction d’une banque génomique

Une banque d’ADN correspond à un grand nombre de clones obtenus à

partir de l’ADN total d’un orgiasme procaryote ou eucaryote. Il

existe deux types de banques celle obtenue à partir de l’ADN

génomique est celle obtenu à partir de l’ADNc synthétisé à partir de

l’ARNm.

La construction d’une banque génomique nécessite :

-Extraction de l’ADN de l’organisme donneur qui peut être d’origine

eucaryote (Animale ou végétale) ou procaryote (Bactéries) ou ADNc.

- Un Vecteur qui doit présenter plusieurs propriétés :

 Etre facile à manipuler,

 Sa réplication doit être efficace à l’intérieur d’une cellule

vivante.

 Doit contenir un ou plusieurs sites de restriction par les

endonucléases.

 Doit posséder un ou plusieurs gènes de résistance aux

antibiotiques.

 Doit être facile à amplifier.

Deux types de vecteurs répondent à ces exigences à savoir les

plasmides et les bactériophages. Cependant les fragments d’ADN que

l’on peut cloner avec les plasmides ne dépassent guère 6 kilobases

alors que les bactériophages peuvent insérer des molécules d’ADN

dont la taille avoisine les 20 kilobases.

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- Construction de l’ADN recombinant par utilisation des enzymes de

restriction et des ligases.

-Utilisation de bactéries transformables.

Construction de l’ADN recombinant

L’ADN recombinant est constitué de deux fragments de Molécules

d’ADN liés entre elles. L’un provient du génome d’un organisme

donneur et l’autre de nature plasmidique ou phagique joue le rôle du

vecteur. Cet ADN recombinant est utilisé pour transformer ou

infecter des cellules bactériennes. Chaque cellule bactérienne

obtenue portant le vecteur recombinant, donne une colonie qui

contient un nombre important de cellules portant chacune un insert

d’ADN recombinant identique. Cet ensemble de cellules identiques

constitue ce qu’on appelle un Clone.

EXTRACTION DE L’ADN

Extraction de l’ADN bactériens

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L’ADN total d’une bactérie est extrait après éclatement des cellules

suivi d’une centrifugation pour éliminer les débris cellulaires. Après

élimination des protéines et précipitation par l’alcool l’ADN purifié

Culture bactérienne + centrifugation ----- culot + addition de

lysozyme ou SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) ------éclatement des

cellules + centrifugation + élimination des débris + deproteinisation

en présence de Chloroforme phénol + centrifugation--- élimination de

la bande blanche (riche en protéines) x 3 ----- récupération du

surnagent qui contient les filaments d’ADN + isopropanol +

centrifugation – culot d’ADN dissolution dans une solution tempon.

Purification de l’ADN par ultra cenrifugation dans un gradiant de

Chlorure de Cesium en présence du bromure d’ethidium---- Bande

blanche sous éclairement par les UV. ---récupération par une

seringue.

Extraction de l'ADN plasmidique

La préparation d'ADN plasmidique à partir de bactéries est l'une des

techniques les plus courantes de la biologie moléculaire. Le principe

de l'extraction est connu sous le nom de lyse alcaline1. Cette

méthode permet de préparer sélectivement l'ADN du plasmide

contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome

bactérien.

Culture bactérienne avec plasmide en fin phase exponentielle +

augmentation importante d’antibiotique dans le milieu + incubation

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avec agitation ----- augmentation du nombre de copies du plasmide

dans chaque bactérie + centrifugation ----culot +lysozyme ou SDS ---

-éclatement des CB + centrifugation +chloroforme phénol +

centrifugation ---- élimination du précipité blanc qui contient les

protéines X trois fois + Rnase pour éliminer les ARN.

Purification de l’ADN par ultra cenrifugation dans un gradiant de

Chlorure de Cesium en présence du bromure d’ethidium---- 2 Bandes

blanche sous éclairement par les UV. ---récupération par une

seringue de la bande correspondant à l’ADN plasmidique plus dense.

Mini préparation : Le principe de cette méthode consiste à

effectuer la lyse des cellules au moyen d'un détergent (dodécyl

sulfate de sodium) en présence de soude, à pH 13. À ce pH très

alcalin, l'ADN est dénaturé, c’est-à-dire que les deux brins de la

double-hélice sont séparés. On neutralise ensuite rapidement la

solution, ce qui provoque la renaturation brutale (réappariement des

brins du duplex d'ADN). L'ADN chromosomique, très long (~10⁶

paires de base), ne parvient pas à se réapparier complètement et

forme des enchevêtrements insolubles. L'ADN plasmidique, court

(~10³ paires de base), parvient à se réassocier complètement et

reste en solution. On sépare alors les espèces par centrifugation. Les

protéines précipitées, sont également éliminées avec le détergent et

l'ADN chromosomique. L'ADN plasmique, resté en solution, est alors

concentré par précipitation à l'alcool.

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- Isolement et purification de l’ADN des cellules animales

On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus,

consistant éventuellement en un broyage, suivi d'une extraction par

des détergents, qui vont disperser les bicouches lipidiques des

membranes et dénaturer les protéines, et en particulier celles qui

sont associées à l'ADN dans la chromatine. La solution obtenue est

en général très visqueuse, car l'ADN ainsi libéré forme de très longs

filaments qui s'opposent aux écoulements hydrodynamiques.

L'étape suivante est la déprotéinisation de la solution qui se fait par

une extraction au moyen de solvants organiques, en général du phénol

additionné de plus ou moins de chloroforme. Les protéines

dénaturées forment un précipité à l'interface phénol-eau, tandis que

l'ADN reste en solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par

décantation ou par centrifugation.

L'ADN est ensuite précipité par addition d'éthanol ou d'isopropanol

dans la phase aqueuse, collecté par centrifugation et dissout dans du

tampon. Pour éliminer les traces de phénol et d'autres contaminants,

on peut enfin pratiquer une dialyse ou une étape de purification par

chromatographie préparative.

Extraction d’ADN à partir de tissus et cellules végétales.

Les étapes de base de l’isolation d’ADN doivent être modifiées pour

prendre en compte les caractéristiques des tissus et cellules de

végétaux utilisés. Le contenu biochimique des cellules végétales est

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très différent de celui des microorganismes et des cellules animales.

Les cellules de plantes présentent un contenu élevé en

polysaccharides et polyphénols qui ne peuvent pas être éliminés par

l’extraction au phénol (contrairement aux microbes). Toutes les

membranes biologiques ont une structure générale commune

comprenant des molécules de lipide et de protéines maintenues

ensemble par des interactions non covalentes. Une des méthodes est

d’utiliser un détergent appelé cetyltrimethylammonium bromide

(CTAB) qui forme un complexe insoluble avec les acides nucléiques et

précipite l’ADN sélectivement, en laissant en solution les

carbohydrates, protéines et autres composants contaminants. Le

précipité contenant l’ADN est décomplexé par dissolution dans une

solution de NaCl 1N.

Contrôle de l'extraction

Analyse sur gel d'agarose révélée au bromure d'éthidium

 Par électrophorèse sur gel d'agarose, on peut analyser la

présence et la taille des acides nucléiques contenus dans la

préparation. Ceux-ci sont révélés par le bromure d'éthidium, un

colorant dont la fluorescence augmente très sensiblement

quand il interagit avec l'ADN. Dans le cas d'ADN

chromosomique, on observe un continuum de bandes,

correspondant aux fragments d'ADN issus de la coupure

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statistique du chromosome résultant des traitements

mécaniques lors de l'extraction de L'ADN. Dans le cas d'une

préparation d'ADN plasmidique, on observe sous UV une ou

plusieurs bandes colorées discrètes dans le gel, correspondant

à l'ADN du plasmide.

Synthèse de l’ADNc

L’ADNc ou ADN complémentaire est synthétisé à partir de l’ARNm à

l’aide d’une enzyme appelée transcriptase inverse extraite à partir

d’un rétrovirus. En utilisant l’ARNm comme matrice, cette enzyme

synthétise une molécule d’ADN simple brin qui sert à son tour de

matrice pour la synthèse d’un ADN double brin.

Les fragments d’ADN du donneur et celui du vecteur sont soumis à

une digestion partielle par les mêmes enzymes de restriction.

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Les enzymes de restrictions sont extraites et purifiées à partir des

bactéries. Ces enzymes coupent les molécules d’ADN double brin en

des sites spécifiques reconnus par chaque enzyme. Pour la plupart

d’entres elles, leur action génère deux fragments d’ADN aux

extrémités complémentaires ou cohésives et dans quelques cas on

obtient des bouts francs.

UTILISATION DES PLASMIDES COMME VECTEUR

Exemple : le plasmide PBR 322 d’E. coli (4,4 kb)

Le plasmide est amplifié dans une bactérie (addition de conc elevé

d’ampicilline dans le milieu de culture) puis extrait de celle-ci par

centrifugation différentielle en gradient de chlorure de césium.

Le plasmide est coupé par l’endonuclease Ecor1 qui possède un site de

restriction au niveau du gène de la résistance à la tétracycline.

L’ADN du donneur est coupé avec le même enzyme.

En présence de la ligase, les fragments d’ADN du donneur et celui du

vecteur se lient niveau des extrémités complémentaires et forment

un vecteur hybride.
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Après ligation on obtient trois types de

fragments d’ADN

- Le plasmide vecteur PBR 322 Ampr Tetr

Le plasmide recombinant PBR 322 Ampr

Tets

- Fragments d’ADN du donneur

On procède ensuite à la transformation

des souches bactériennes de E.coli en

présence d’ampicilline et on sélectionne les clone ampicilline

résistants. Ces mêmes clones, sont répliqués sur un milieu avec la

tétracycline. Les clones qui sont tétracycline sensible donc qui ont

été transformés par le plasmide recombinants sont gardés et

constituent ainsi une banque génomique de l’organisme donneur.

UTILISATION DU PHAGE Λ COMME VECTEUR

Chez ce phage, la taille de son Chromosome est de 45 kb. La partie

centrale du génome de 15 kb qui n’est pas nécessaire à la réplication

et à l’empaquetage peut être éliminée et remplacée par l’ADN du

donneur de 10 à 20 kb après coupure par les enzymes de restriction.

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L’ADN hybride obtenu est

mis en présence des

protéines de la capside.

L’ADN pénètre dans la

capside et forme une

particule phagique qui va

servir à infecter des souches d’E. coli. Les plages de lyse obtenues

correspondent chacun à un clone de phage portant un insert de l’ADN

du donneur.

SELECTION DU CLONE RECHERCHE

Chez les eucaryotes, pour sélectionner un clone portant le gène

recherché, on utilise en général une sonde construite avec le même

gène cloné provenant d’un autre organisme. Chez les procaryotes le

criblage s’effectue par transformation des souches auxotrophes pour

le gène recherché après extraction de l’ADN des plasmides hybrides.

Préparation d’une sonde d’hybridation.

Construction d’une sonde

Lorsqu’une solution contenant des molécules d’ADN est chauffée à

100°c ou exposée à un ph élevé (pH ≥ 13) les liaisons entre les bases

des acides nucléiques sont rompues et la double hélice se dissocie

rapidement en deux chaines monocaténaires. Toutefois si ces deux

brins sont remis dans des conditions de renaturation (Température

de 65°c), on assiste à l’appariement des bases complémentaire et

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formation des molécules d’ADN du départ. Ce phénomène est appelé

hybridation. Cette propriété est mise à profit pour synthétiser des

sondes radioactives afin de détecter et de caractériser des

séquences spécifiques dans un ADN ou un ARN.

ADN monobrin + nucléotides radioactifs (dXTP*) + polymérase -----

ADN * bicaténaire + dénaturation ----- ADN*monobrin

Hybridation de l’ADN *monobrin de la sonde avec l’ADN du clone

simple brin dénaturé transféré sur un filtre de nitrocellulose. -----

révélation sur film sensible.

Une fois le clone recherché est identifié. L’ADN correspondant au

gène peut être récupérer par électrophorèse après digestion du

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vecteur hybride avec le même enzyme qui a été utilisée pour la

construction de la banque génomique. Ce fragment d’ADN est

amplifier dans une PCR et les millions de copies obtenues sont

soumises à des analyses en particulier l’établissement de la carte

restriction et la détermination de séquence des acides nucléiques.

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La méthode de séquençage est basée sur la propriété de migration

d’une molécule d’ADN sur un gel d’acrylamide ayant integrée à son

extrémité 5’un nucléotide radiactive (ddXTP*) de déterminaison de

fin de synthèse.