Université de Tunis El Manar

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique 2ème Année de mastère de recherche en nutrition
Ecole Supérieure des Sciences et Techniques de la Santé de Tunis

Les acteurs du clonage

moléculaire
27-10-2021

Elaboré par: Dr. Asma TAJOURI, PhD Année universitaire: 2021-2022

1
• Evaluation des pré-acquis:

Quelle est la définition d’un gène?

2
Rappel

3
 Ensemble de
techniques de
biologie
moléculaire

Mieux
Isoler et
comprendre le
reconstruire
développement
des gènes
de maladies
spécifiques
génétiques Génie
génétique

Etudier la Moyen efficace

régulation de de produire des
l’expression protéines
des gènes spécifiques en
grande quantité

4
Le clonage moléculaire
- Définition
Le clonage moléculaire est un ensemble de méthodes expérimentales en
biologie moléculaire qui sont utilisées pour assembler des molécules d'ADN
recombinant et diriger leur réplication au sein des organismes hôtes.

5
Le clonage moléculaire
- Historique
Le premier clonage fut réalisé en 1972 par Paul Berg qui partagea le prix
Nobel de chimie en 1980 avec Walter Gilbert et Frederick Sanger.

En 1977, le premier gène humain, codant pour la somatostatine, est cloné

permettant ainsi aux bactéries de produire des protéines humaines.

L’ère du génie génétique et des biotechnologies venait alors de démarrer.

6
Le clonage moléculaire
- Principe
Une des bases du génie génétique.

Insérer le gène d’intérêt (dénommé insert) dans un

vecteur approprié comme un plasmide par
exemple.

Le nouveau plasmide ainsi créé sera ensuite

introduit dans une cellule hôte, en générale la
bactérie Escherichia coli. Celle-ci sera alors
sélectionnée et multipliée afin d’obtenir une
grande quantité du plasmide d’intérêt.

7
- Les acteurs du clonage
ADN à
cloner

Les
La cellule vecteurs
hôte Clonage de
clonage

Les
enzymes

8
- Les acteurs du clonage
1- Les enzymes
Différents types d’enzymes sont nécessaires pour le clonage:

A- Enzymes de restriction.

B- Enzymes modifiant les extrémités de l’ADN: phosphatases.

C- Enzymes de ligature de l’ADN: ligases.

9
A- Les enzymes de restriction
• Enzymes qui coupent un ADN double brin en un point précis.

• Mises en évidence chez les bactéries et leur nom évoque le microorganisme dont
elles sont extraites : EcoRI vient d'Escherichia coli souche R, 1ère enzyme isolée
dans cette souche.

• Naturellement produites par les bactéries pour se défendre contre l’infection

virale.

• Une enzyme de restriction est caractérisée par la séquence du site reconnu et la

position de la coupure. 10
 Mode de coupure de l’ADN par les enzymes de restriction

- Coupure à bouts francs

- Coupure à bouts cohésifs ou collants

- Coupure à bouts cohésifs ou collants

11
12
B- Les enzymes modifiant les extrémités de l’ADN:
phosphatases

• Les phosphatases = enzymes de déphosphorylation (extraites des bactéries

ou des animaux).

• Utilisées pour préparer de l’ADN recombinant. Exemple : la phosphatase

alcaline (active à pH alcalin) qui retire le groupement phosphate en 5’ sur
l’ADN et l’ARN. Cette enzyme est surtout utilisée pour déphosphoryler un
vecteur qu’on vient d’ouvrir pour éviter sa refermeture.

13
C- Les enzymes de ligature de l’ADN: ligases
• Enzymes de ligature de l’ADN = ligases (Extraites de bactéries).

• Assurent la soudure entre 2 fragments d’ADN par établissement de liaisons

phosphodiesters entre une extrémité 3’OH libre et une extrémité 5’P libre en présence
d’ATP.

• Elles peuvent effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN à bouts francs ou à bouts
cohésifs  la ligase utilisée dépend donc des extrémités de l’ADN.

• La ligase E. Coli : ne peut lier que 2 fragments d’ADN à extrémité cohésives.

• La ligase T4 = T4 DNA ligase : est capable d’assurer la ligature des 2 types d’extrémités.
14
- Les acteurs du clonage
2- L’ADN à cloner

• Un gène déjà isolé.

• Un fragment d’ADN à cloner déjà amplifié par PCR.

15
- Les acteurs du clonage
3- Les vecteurs de clonage

Les vecteurs de clonage

Plasmidiques: Viraux: Les

Leur ADN est bactériophages Les
bicaténaire, L’ADN du phage est Les vecteurs
circulaire avec un Cosmides chromosomes
linéaire double brin navettes
nombre de de 48,5 Kb de taille artificiels
nucléotides
inférieur à 10kb

16
A- Les vecteurs de clonage plasmidiques
- Propriétés
Pouvoir se répliquer d’une manière active et autonome dans la
bactérie.

Posséder des sites de restriction permettant d'introduire le fragment

d'ADN à cloner.

Posséder des marqueurs de sélection.

Sa présence ne doit pas perturber la physiologie de la cellule hôte et

vice versa.

Facile à isoler sous forme purifiée.

17
- Les vecteurs de clonage plasmidiques: 1ère génération
Le plasmide pBR 322:
• L’un des 1ers plasmides artificiels utilisés comme vecteur de clonage.
• 4361 pb.
• Possède 2 gènes de résistance aux antibiotiques : Tétracycline et Ampicilline.
• Possède une origine de réplication, plusieurs sites de restriction ainsi que des sites
uniques de restriction parmi lesquels BamH I et Pst I sont respectivement localisés
au niveau des gènes de résistance à la Tétracycline et à l’Ampicilline. L’introduction
d’un ADN étranger dans l’un de ces sites  perte de la résistance à l’ATB
correspondant.
18
Carte de restriction du plasmide pBR322 (1ère génération)
19
- Les vecteurs de clonage plasmidiques: 2ème génération

• Ce sont des plasmides puissants bien construits.

• Sont constitués de 2 familles : pUC (plasmid of University of California) et blueskript.

• Ces plasmides présentent un autre gène « lacZ » qui code pour l’extrémité NH2 de la
β-galactosidase. Au sein de ce gène est placée une région renfermant des sites de
clonage multiple (MCS) ou site polylinker (site d’insertion de l’ADN étranger).
L’interruption de ce gène (par insertion de l’ADN étranger) entraîne une perte de
l’activité de la protéine.

20
Carte de restriction des plasmides (2ème génération) pUC18/19 (a) et pBluescript (b)

21
B- Les vecteurs de clonage viraux: Les phages

• Un bactériophage, ou phage, est un virus qui infecte les bactéries.

• Le terme de bactériophage provient du grec et signifie « mangeur de bactéries ».

• Mis en évidence par le Britannique Frederick Twort en 1915 et le franco-

canadien Félix d’Hérelle en 1917.

22
La structure d’un bactériophage
23
On distingue deux sortes de bactériophages :

• Les phages lytiques, qui infectent la bactérie, détournent la machinerie cellulaire

pour se reproduire et détruisent la cellule en libérant des dizaines de nouveaux
phages. Exemple: le phage T4.

• Les phages lysogènes, ou tempérés, qui insèrent leur ADN dans celui de la bactérie
sous la forme d'un prophage, et peuvent lui conférer de nouvelles propriétés
(fabrication de toxines...). Exemple: le phage Lambda (2 modes de multiplication).

24
Les cycles de multiplication du bactériophage 25
 Vecteur de clonage: cycle lytique ou bien lysogénique?

 C’est le cycle lytique qui nous intéresse puisqu’il entraîne la production d’un grand
nombre de nouveaux phages qui vont à leur tour infecter d’autres bactéries et ainsi
de suite.

26
- Les vecteurs phagiques les plus connus et les plus utilisés pour le clonage sont dérivés
du phage lambda.

Carte génétique du bactériophage λ 27

 Les phages
Avantages
- Capacité d’insérer jusqu’à 25 Kb
d’insert (soit le 1/3 de l’ADN du
phage peut être remplacé par un
ADN étranger).
- Leur multiplication est rapide et le
nombre de copies / cellule est élevé.
- Le rendement d’une infection
phagique est supérieur à ce qui est
obtenu lors de la transformation par
un plasmide.
Inconvénients
L’utilisation de phage λ non modifié
présente des problèmes tel que
l’existence de plusieurs sites de
restriction pour des enzymes
identiques  nécessité de
construire des phages modifiés
possédant un seul site de restriction
 l’insertion de l’ADN étranger se
fait à un endroit précis du génome
du vecteur.
28
C- Les vecteurs de clonage: Les cosmides
- Propriétés
Vecteurs artificiels hybrides: phage lambda-plasmides.

Constitués de molécules d’ADN circulaires qui combinent à la fois les

avantages des plasmides et des phages.

Constitués d’un plasmide classique auquel on a ajouté les extrémités cos du

phage λ.

Possèdent: une origine de réplication plasmidique, un ou plusieurs

marqueurs de sélection, une région MCS et un site cos (pour l’encapsidation
in vitro de grands fragments d’ADN).

Permettent l’insertion de grands fragments d’ADN allant jusqu’à 45 Kb.

29
 Les cosmides

Avantages Inconvénient

- La taille des fragments - Obligation d’empaqueter

insérables peut atteindre l’ADN.
50 kb.
- Leur incorporation dans
les bactéries
(transformation) est plus
efficace que pour les
plasmides.
30
D- Les vecteurs de clonage: Les chromosomes artificiels
- Propriétés
Minichromosomes qui copient les chromosomes de la cellule hôte eucaryote et
se répartissent régulièrement lors des divisions, comme les chromosomes
naturels.

Le plus utilisé est le pYAC (Yeast Artificial Chromosome) construit à partir des
levures.

Capable d’insérer de grands fragments d’ADN de 140 à 1000 Kb (exemple YAC2

qui fait 11,2 Kb de taille).

Il possède une origine de réplication (ORI), une région centromérique (CEN) qui
assure la migration correcte du minichromosome, un site unique de clonage
(EcoR I) et un ou plusieurs marqueurs de sélection (A et B).

31
E- Les vecteurs de clonage: Les vecteurs navettes
- Propriétés
Vecteurs artificiels.

Peuvent se répliquer chez les procaryotes et les eucaryotes.

Peuvent se déplacer d’un hôte à l’autre même s’ils sont différents.

Utilisés lorsqu’un un gène eucaryote est cloné dans un vecteur procaryote.

Il est donc obligatoire de leur ajouter une séquence eucaryote spécifique qui
servira d’origine de réplication à ces vecteurs.
32
Exemple : Vecteur navette bactérie-levure :

Possède:

 Deux origines de réplication : une reconnue par la machinerie de réplication

de E. coli (ori) et l’autre reconnue par la machinerie de la levure S. cerevisiæ
(ori 2 μm).

 Deux gènes de sélection : l’un est utilisé chez la bactérie (AmpR) et l’autre
chez la levure (le marqueur nutritionnel URA3; le milieu de sélection
correspondant sera un milieu sans uracile).

 Un seul site de clonage multiple.

33
 4- La cellule hôte

• Pour se répliquer, un vecteur doit être incorporé dans une cellule hôte spécifique de
chaque type de vecteur.

• Exemple : si le vecteur est un plasmide, la cellule hôte est une bactérie.

• La cellule hôte ne doit pas modifier ou détruire l’ADN recombiné qui y a été introduit.

34
2 catégories d’hôtes :

• Les hôtes bactériens.

• Les hôtes eucaryotes.

35
 Les hôtes bactériens
Avantages
- Les hôtes les plus utilisées.
- Se multiplient rapidement.
- Faible coût de production.
- Faciles à manipuler.
- Les bactéries utilisées ne
sont pas pathogènes.
- Modifiées afin de diminuer
les risques de dissémination
accidentelle.
 Bactérie de choix: E.Coli
VS
Inconvénients
- Formation des corps
d’inclusion.
- Leur système biochimique
n’effectue pas toutes les
modifications post-
traductionnelles.
- Faible production de
protéines.
Les hôtes eucaryotes
Avantages Inconvénients
- Leur système - Leur manipulation est
biochimique est coûteuse.
capable d’effectuer
toutes les modifications
post-traductionnelles.
- Forte production de
protéines.
- Cellules animales,
humaines, plantes,
levures
36