Chapitre V

GENOME ET
BIOTECHNOLOGIE

Biologie Cellulaire : Eléments de génétique 1

 GENOME ET BIOTECHNOLOGIE
V.1. Généralités
V.1.1. Définition
V.1.2. Principe
V.1.3. La cellule hôte
V.1.4. Les vecteurs
V.1.5. Les enzymes de restriction
V.2. Clonage
V.2.1. Clonage d’un gène humain dans un plasmide
bactérien
V.2.2. Caractérisation d’un gène
V.2.3. Applications
V.2.4. Ethique
V.3. Les cellules souches
V.3.1. Définition
V.3.2. Types de cellules souches
V.3.3. Types de cellules pluripotentes
2
 V.1. Généralités
V.1.1, Définition
La thérapie génétique consiste en la modification d'organismes vivants
de manière à ce qu'ils acquièrent des caractéristiques utiles à l'homme
Il s’agit de mettre au point un traitement par modification génétique de
cellules somatiques en introduisant un gène d'intérêt “étranger” qui, une
fois exprimé, engendrera la modification souhaitée.
V.1.2. Principe
Il s'agit d'introduire dans une cellule hôte un gène d'intérêt étranger qui,
une fois exprimé, engendrera la modification souhaitée.
V.1.3. Les cellules hôtes
Les premiers organismes a avoir été transformés sont les procaryotes et
les levures, Actuellement on clone couramment l’ADN eucaryote en
utilisant comme cellules hôtes des cellules de mammifères en culture.
V.1.4. Les vecteurs
Le vecteur transporte l’ADN recombinant (c’est-à-dire l’ADN transformé),
Il doit être capable de pénétrer dans la cellule hôte et s’y répliquer,

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 3

 V.1.4.1. Les plasmides (clonage d’inserts d’ADN
jusqu’à 10 kb)

(A) Plasmide R largement

répandu, RK2
(B) Plasmide pCG86 d'un
E.coli pathogène

Ce vecteur doit avoir une origine

de réplication indépendant du
chromosome chez E.coli et un
marqueur de sélection
généralement de résistance aux
antibiotiques pour pouvoir survivre
sur milieu sélectif.
Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 4
 V.1.4.2. Les phages (clonage d’inserts d’ADN jusqu’à
40 kb)

La plupart des
phages vecteurs
dérivent du virus
bactériophage
lambda.

Ils sont surtout utilisés pour les

banques d’ADNc (collection
d’ADN complémentaire de
l’ADN étudié).

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 5

V.1.5. Les enzymes de restriction
Site de restriction
Extrémité
cohésive
La coupure de l’ADN peut se faire au
même niveau sur les deux brins
d’ADN = coupure franche (= bout
franc) ou décalée (= bout collant)
dans les deux brins constituant les
extrémités adhésives.
Les enzymes de restriciton
reconnaîssent une courte
séquence particulière de
l’ADN appelée “site de
restriction” et coupe les
deux brins de l’ADN à des
points précis. La plupart
des sites de restriction
sont symétriques; ce sont
des palindrome.
6
 Ligases

Les plasmides recombinés sont ensuite reproduits par les

bactéries. On obtient ainsi un grand nombre de copies du
gène d'intérêt étranger = gène cloné.

Si le gène s’exprime, il produira la protéine attendue en grande quantité

7
Leroy Francis « Atlas international d’illustrations en Biologie » Sordalab Editions
 V.2. Le clonage

Leroy Francis « Atlas international d’illustrations en Biologie » Sordalab Editions

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 8

 V.2.1. Clonage d’un gène humain dans un
plasmide bactérien
Etape préalable
1. Choisir le plasmide bactérien
Plasmide provenant d’E coli contenant
le gène ampR (résistance à
l’ampicilline) et le gène lacZ (code pour
Site de restriction la β-galactosidase qui hydrolyse un
analogue moléculaire du lactose (X-
gal) pour former un produit bleu
Gène
de lacZ gène ampR

2. Choisir l’enzyme de restriction

La même pour les deux échantillons d’ADN 9
Etape 1 : scission de l’ADN

Etape 2 : production de l’ADN recombinant

Mélanger les deux (2) (4)

ADN
types d’ADN en
recombinant
présence de ligase (1)
(3) et plasmides

Gène lacZ non fonctionnel 10

Etape 3 : Transformation des bactéries
(par choc thermique ou choc électrique)

= insertion des plasmides dans les bactéries

Etape 4 : mise en culture et clonage

(1) (2) (3) (4)

11

Les clones sont criblés pour le gène d’intérêt

 Comment reconnaître les clones
Etape 5 : criblage cellulaires qui portent des plasmides
recombinés ?

Etape préliminaire : indentification des clones recombinants

1. Elimination des
bactéries sans plasmide
car elles n’ont pas le
gène ampR

2. Coloration blanche
des colonies si l’ADN
d’intérêt a été inséré
dans le lacZ

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 12

Raven, Johnson, Losos et Singer « Biologie » 7ième édition
Etape 6 : caractérisation de l’ADN
Amplification du fragment d’ADN d’intérêt

La réaction en chaîne de polymérase

(PCR) permet de produire un grand
nombre de copie d’un segment d’ADN
donné. . Elle se déroule entièrement in
vitro.
Identification de l’ADN

Fragments d’ADN extraits de 9 plasmides clones digérés par une

endonucléase de restriction séparés par électrophorèse
 Identification du gène d’intérêt par hybridation

5. Comparaison du film impressionné

1. Mise en culture des colonies par la radioactivité avec la plaque
contenant le plasmide originelle pour identifier la colonie
contenant le gène
2. Application d’un papier
filtre sur les colonies. Des
cellules des différentes
colonies y adhèrent.

3. Rinçage du filtre par une solution 4. Application du filtre sur un

dénaturant l’ADN et contenant une
sonde marquée par radioactivité.
Celle-ci va s’hybrider aux séquences
de nucléotides complémentaires du
gène d’intérêt
film d’autoradiographie.
Raven, Johnson, Losos et Singer « Biologie » 7ième édition
14
 Principe de l’hybridation

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 15

 V.2.2. Applications
❑ ALIMENTATION : Améliorer les élevages
❑ PALEONTOLOGIE : faire revivre une espèce
disparue
❑ VIE QUOTIDIENNE : Cloner son chien ou son
chat
❑ BIOCHIMIE : → Production de millions de
protéines identiques :
❑ MEDECINE : → Création par clonage d’un
animal qui exprime le gène « pathologique »

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 16

 Améliorer les élevages
O Clonage d’un reproducteur au patrimoine
génétique exceptionnel
O Le clonage d’un animal reste une méthode
complexe avec un taux de réussite très
faible

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 17

Clonage d’un veau par exemple

Stade 1
O Prélèvement des cellules de l’animal à
cloner
O Prélèvement des ovocytes dont on enlève le
noyau
O Fusion par choc électrique

Ecueil 1
Enlever le noyau d’un ovocyte puis fusionner cet ovocyte avec
une autre cellule sont des opérations qui le mette à rude
épreuve. La fusion échoue dans 20% des cas. 18
Clonage d’un veau par exemple

Stade 2
O « Reprogrammation » de l’ADN grâce au
cytoplasme de l’ovocyte.

→ Cellule totipotente
Ecueil 2
Un embryon sur deux dégénère avant de parvenir au stade de
blastomère soit un taux équivalent à celui d’une fécondation
in vitro classique; division cellulaire trop lente ou inadéquate ? 19
Clonage d’un veau par exemple

Stade 3
O La cellule nouvellement formée entame ses
premières divisions…

→ Trophoblaste et
bourgeon embryonnaire
Ecueil 3
L’implantation, la nidification de l’œuf, la mise en place des
échanges avec la mère porteuse est une étape cruciale. Dans
un tiers des cas l’embryon est rejeté 20
Clonage d’un veau par exemple

Stade 4
O Embryon implanté dans l’utérus

→ Développement du placenta
et des tissus embryonnaires
Ecueil 4
Les fœtus clonés tendent à être un peu plus gros que la
normale avec malformations et accumulation excessive de
liquides. Dans 10% à 80% des cas (selon l’ADN de la cellule
clonée initiale), il faut interrompre la gestation. 21
Clonage d’un veau par exemple

Stade 5
O Gestation

Ecueil 5
Dans les premières semaines suivant la naissance, un tiers
des veaux présentent des anomalies trop importantes pour
survivre, sans doute liées à des erreurs de
« reprogrammations ». 22
 Clonage d’un veau par exemple

Stade 6
O Naissance

Le veau est né. Il doit désormais survivre par ses propres

moyens, hors de l’utérus protecteur de sa « mère
gestationnelle »

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 23

 Clonage d’un veau par exemple

Stade 7
O Croissance du clone

Marquage épigénétique

Jamais totalement
identique

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 24

 Stratégie pour la production d’un vaccin sous-
unitaire contre le virus de l’herpès ou de l’hépatite

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie Raven, Johnson, Losos et Singer « Biologie » 7ième édition 25
La myopathie de Duchenne
résulte de l’absence d’une
protéine, la dystrophine.

On a fabriqué ce modèle de souris

transgénique MDX en y insérant
dans son matériel génétique le
gène déficient (DMD) afin
d’étudier la maladie. Certaines
molécules sont testées sur ces
modèles pour restaurer
l’expression de la dystrophine.
26
 Modèles animaux : corrélation à l’homme ?
Impossible de corréler précisément un modèle animal
à ce qui va se passer chez l’homme !
Donne des indications sur la possibilité de la thérapie
Même si le transfert de gène est efficace
dans des espèces non humaines, il ne le sera pas forcément
chez l’homme. Par ailleurs, la fonction des gènes peut
évoluer selon les espèces.
 V.2.3. La thérapie génique
humaine

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 28

La thérapie génique humaine

Première expérience de
thérapie génique (1990)
dans un cas de SCID
(severe combined
immunodeficiency) chez
une fillette de 4 ans. Les
résultats cliniques à cette
époque n’ont pas
démontré l’efficacité du
traitement, actuellement
les chances de réussite
sont de plus en plus
convaincantes mais
place à la thérapie
cellulaire… 29
 Thérapies géniques in vivo et ex-vivo
Administration des vecteurs : Pour information
➢in vivo : cellules modifiées in situ
➢ex vivo : par l’utilisation de cellules autologues
+ « transgène », sélection et amplification des cellules
corrigées

Human molecular genetics 2 Figure 22.3

En fonction du vecteur : l’ADN thérapeutique
- s’intègre dans l’ADN chromosomique de l’hôte
- reste sous forme épisomique Pour information

Forme intégrée Forme épisomique

idéal dans cellules souches adultes intéressant si le but est
mais d’induire la mort de la cellule
! insertion au hasard
 La thérapie génique n’offre pas toujours un
succès total et soulève plusieurs questions :
✓ Comment ajuster l’activité du gène transféré
afin qu’il synthétise la protéine en quantité
adéquate, au bon moment, au bon endroit ?
✓ Comment être certain que l’insertion du
gène n’entrave pas d’autres fonctions
cellulaires ?
✓ Comment contrôler le lieu d’insertion des
vecteurs ? …
→ Importance de comprendre les mécanismes
très complexes d’interactions entre les gènes !
Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 32
 CRISPR-Cas9, un outil qui
révolutionne la génétique
CRISPR = Courtes Répétitions
Palindromiques groupées et
régulièrement espacées

2011 : Découverte de séquences génétiques (CRISPR) comprenant des fragments

d’ADN répétés à intervalles réguliers dans le génome de bactéries et d’archées. Ces
séquences répétées constituent une sorte de mémoire des agressions virales subies
par les bactéries et contiennent aussi des gènes qui codent pour des enzymes
appelées Cas.
- Cas9 peut à elle seule reconnaître et couper spécifiquement un ADN étranger si
la cellule dispose d’une copie de cette séquence dans son site CRISPR
- Cas9 ne fonctionne qu’en présence d’un petit ARN nommé « tracr »
Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 33
 2015 : perspectives en thérapie génique

2015 : L’arme développé par les bactéries, CRISPR-Cas9 contre les invasions virales a
été détourné par des biologistes pour en faire des « ciseaux moléculaires » capables de
couper l’ADN à un endroit ciblé. Les méthodes utilisées jusque maintenant pour
modifier le génome nécessitent des enzymes spécifiques à chaque situation.
L’outil CRISP-Cas9 utilise une même protéine, la Cas9 pour toutes les situations. Le
seul élément spécifique à produire est une séquence (ARNguide) qui guide l’enzyme
vers différents lieux de coupure d’un ADN cible.
Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 34
 Gène sain
Le gène s’insère
au hasard dans
le génome

Gène défectueux

Cas9 guidée par CRISPR …ce qui permet son

Actuellement en thérapie génique, il est
comprenant l’ARN guide remplacement
impossible de contrôler précisément le coupe le gène défectueux
point d’insertion d’un ou d’inactiver un
gène défectueux. L’outil CRISPR-Cas9 Le gène
s’insère à la
permet de cibler précisément le gène place du
voire de le remplacer par sa version gène
saine. défectueux

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie Infographie ©Betty Lafon/Sciences et Avenir 35

 Construction génétique composée de trois éléments : Cas9, Crispr, Tracr
Tracr Cas9 Crispr
ADN Répétition Guide Répétition
Les constructions génétiques Crispr/Cas9 sont réalisées dans les bactéries et ensuite sont intégrées dans une cellule
Crispr
Cette construction
génétique utilise ensuite ARN Tracr Protéine
la machinerie cellulaire + Cas9 + ARN Guide
de production de
protéines pour remplir
son rôle.
Complexe ARN Trart,
Cas9, CRISP contenant
ARNguide

- Injection du complexe Séquence cible

dans la cellule Génome à modifier
- Cas9 ouvre l’ADN
- Cas 9 recherche la
séquence cible grâce à
l’ARN guide
- L’ARN guide s’hybride
sur le fragment d’ADN Génome coupé
cible
- Cas9 sectionne l’ADN
Soit la cellule répare l’ADN et le gène Soit on introduit un
cible muté devient inopérant nouveau fragment d’ADN
Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 36
 V.2.4. Ethique
Grands principes
Le clonage « reproductif »
Le clonage « thérapeutique »

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 37

 Voie de recherche alternative
O Clonage reproductif = fantasme
O Clonage thérapeutique = thérapie génique =
soulève plusieurs questions. Découverte du
CRISPR-Cas9 !
O Création de cellules « souches artificielles »
à partir de cellules de peau = thérapie
cellulaire

➢ Reprogrammation par iPS

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 38

 V.3. Les cellules souches
Thérapie cellulaire

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 39

Types de cellules souches

http://www.hinnovic.org/les-cellules-souches/

40
 Les cellules pluripotentes
O Cellules souches embryonnaires (CSE)
= masse cellulaire interne du blastocyste.
O Cellules souches pluripotentes induites
(iPS) = cellules reprogrammées (Yamanaka,
2007) .
O Cellules MUSE (Multilineage-differentiating
Stress Enduring), dans la peau et la moelle
osseuse des adultes (± 1/5000).
La pluripotence est la faculté de certaines cellules à se
différencier en tout type cellulaire d'un organisme 41
 Les cellules pluripotentes induites iPS
« induced pluripotent stem »
Yamanaka, 2007

Insérer dans le noyau de cellules adultes (issues de la peau par exemple),

quatre gènes qui ne s'expriment normalement qu'au stade embryonnaire
→ cellules capables de donner naissance à tous les tissus et organes du
corps humain = iPS → orientées in vitro vers différents types cellulaires →
greffer ces nouveaux tissus sur le patient-donneur sans aucun risque de
rejet.

Review : Mol Brain. 2014 Mar 31;7:22. doi:

10.1186/1756-6606-7-22.
42
 Cellules Souches
Hématopoiétiques (HSC)
 Cellules Souches
Mésenchymateuses
(MSC)
 Cellules Souches
Neurales (NSC)

La multipotence est la faculté de certaines cellules à

43
produire plus d’un type de cellules spécialisées.
 Cellules Souches Hématopoiétiques (HSPCs)
Les enfants bulles
élimination des progéniteurs
de la moëlle osseuse
pour favoriser la greffe des
cellules transplantées

HSC
HPC
HPC lymphoïde
myéloïde

44
Naldini, Nature reviews/genetics 2011 vol 12:301-315
 Cellules Stromales Mésenchymateuses (CSM)
O Les MSC proviennent du mésoderme de l’embryon.
On peut en trouver dans le tissu adipeux ou la moelle
osseuse de l’organisme adulte.
O Les MSC peuvent se différencier – ou se spécialiser
– en chondrocytes, ostéocytes, adipocytes, myocyte.

Cellules spécialisées des tissus squelettique et musculaire

Adipocytes, Chondrocytes, Ostéocytes, Myocytes

http://www.eurostemcell.org/fr/factsheet/les-cellules-souches-m%C3%A9senchymateuses-les- 45
%E2%80%9Cautres%E2%80%9D-cellules-souches-de-moelle-osseuse
 Des cellules souches dans le
cerveau
O Des cellules souches donnent naissance à de
tout nouveaux neurones tout au long de la
vie.
➢ Neurogénèse
O Elles sont particulièrement présentent dans
le gyrus denté de l’hippocampe
O Ce phénomène favorise l’apprentissage et la
mémorisation tout au long de la vie mais
ralentit avec l’âge.
Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 46
Risques cliniques associés aux produits de
thérapie génique et cellulaire
Thérapie Genique Thérapie cellulaire
O effets directs sur le O différentiation in vivo en types
génome du receveur : de cellules non désirées ou en
activation d’oncogène, tumeurs
inactivation d’anti-
O acheminement vers des sites
oncogène, insertion dans
la partie codante d’un distants de l’emplacement
gène essentiel à la vie, désiré
insertion dans O induction d’une réponse
l’hétérochromatine… immunitaire aux cellules
O Perspective CRISPR-Cas9 greffées
Atténuer ces risques dans les essais cliniques réalisés pour la première fois sur
l’homme dépend substantiellement des données générées par les études 47
précliniques effectuées sur les animaux.
 Où trouver les cellules souches ?
Ainsi, en théorie, les cellules souches peuvent
être obtenues à partir de :
- embryons surnuméraires obtenus par
fécondation in vitro et non transférés (SE)
- tissus d’un adulte (iPS, multipotentes)
- clonage d’une cellule d’adulte
- prélèvement de sang de cordon ombilical.

Il est possible aujourd’hui de prélever le sang de cordon ombilical

immédiatement après l’accouchement, de le congeler et de le garder
dans une banque spécialisée (cryoconservation).

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 48

Utilisation des cellules souches (1)

Cellules Cellules
pluripotentes multipotentes

49
Campbell et Reece « Biologie » 7ième édition
 Utilisation des cellules souches (2)
Des injections de cellules souches embryonnaires animales ont
permis de restaurer la fonction musculaire chez des souris
transgéniques atteintes d'une maladie similaire à la Myopathie
de Duchenne humaine, selon une étude publiée dans Nature
Medicine. Ces résultats ouvrent la voie à une possible thérapie
cellulaire pour traiter les dystrophies musculaires.

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 50

 Utilisation des cellules souches (3)
Des chercheurs de l’ULB ont réussi à fabriquer chez la
souris une thyroïde à partir de cellules souches

O Les chercheurs sont parvenus à différencier

in vitro des cellules souches embryonnaires
en tissu thyroïdien produisant des
hormones.
O Transplanté à des souris dépourvues de
thyroïde, le tissu fabriqué a produit des
hormones thyroïdiennes de façon définitive.

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 51

 Utilisation des cellules souches (4)
Des chercheurs de l’ULB ont découvert un gène
(BCL6) qui transforme la cellule souche en neurone

• Ce gène BCL6 agit par répression

épigénétique d’une voie de signalisation
essentielle pour le maintien indifférencié de la
plupart des cellules souches, même non-
neurales.
Cellules souches neurales + neurones corticaux
- BCL6 + BCL6

Moins de neurones Plus de neurones

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 52
 Thèmes à consulter via le lien internet
(à titre informatif)

Introduction à la génétique
Trouvez les gènes associés à une maladie
Génétique des troubles complexes courants
Génétique et médecine
O http://www.roche.com/pages/genedcd6/French/Menu/GenMenu.ht
ml
O http://www.dailymotion.com/video/xcs7oi_cellules-souches-une-
recherche-entr_news
O http://www.dailymotion.com/video/xcw9ag_transfert-de-cellules-
souches-clerm_news

Biologie Cellulaire : Génome et Biotechnologie 53