Celll Culture Master2 Lecture BIO UdM

CULTURE CELLULAIRE
ET MÉTHODES DE
BIOLOGIE
MOLÉCULAIRE
Simon N. FEWOU, PhD

Professeur adjoint de biochimie et
neurobiologie
Contour
• Introduction:
• Types de cellule culture
• Cellule techniques de culture, Équipement, et stérilisation
méthodologie.
• Établissement et entretien de primaire cultures
cellulaires d'adhérents et non-adhérent cellule lignes:
• Les fibroblastes
• Cellules endotheliales
• Embryonnaire cellule lignes et tige cellules.
• Création et maintenance de mammifère secondaire et
lignées cellulaires d'insectes
Qu'est-ce que la culture cellulaire
et tissulaire
• La culture tissulaire ou cellulaire est le nom général pour le
prélèvement de cellules, de tissus ou d'organes d'un animal ou d'une
plante et leur croissance dans des conditions contrôlées. Mais en
pratique, il se réfère à la culture de cellules dérivées d'animaux et
plante
• Cet environnement consiste généralement en un récipient de culture en

verre ou en plastique approprié contenant un milieu de support liquide
ou semi-solide qui fournit les nutriments essentiels à la survie et à la
croissance.
• Lorsque les cellules sont retirées des fragments d'organes, perturbant

ainsi leur relation normale avec les cellules voisines, on parle de culture
cellulaire
Désavantages
• Doit développer des techniques standardisées
afin de maintenir des cellules reproductibles
saines pour les expériences
• Il faut du temps pour apprendre la technique
aseptique
• La quantité de matériel est limitée
• La dé-différenciation et la sélection peuvent se
produire et de nombreux mécanismes
cellulaires d'origine peuvent être perdus
Terminologie
Culture d'orgue
• Une culture tridimensionnelle de non désagrégé tissu conservant
certaines ou toutes les caractéristiques du tissu in vivo
Culture de cellules
• Cellules uniques, ne sont plus organisées en tissus. Dérivé de cellules
dispersées prélevées sur le tissu d'origine
Culture cellulaire primaire

• Dérivé d'un explant, directement de l'animal
• Habituellement, ne survivent que pendant une période de temps finie
• Implique une perturbation enzymatique et / ou mécanique du tissu et
certaines étapes de sélection pour isoler les cellules d'intérêt d'une
population hétérogène
Terminologie
Cloner
• Une population issue d'une seule cellule
Sous-culture
• Transplantation de cellules d'un vaisseau à un autre
Lignées cellulaires établies ou continues

• Une culture primaire devenue immortelle en raison d'une transformation
• Le plus souvent, une tumeur dérivée ou transformée avec un virus tel
qu'Epstein-Barr
• Les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) sont l'une des cellules les
plus couramment utilisées.
• Les cellules SH-SY-5Y un humain neuroblastome lignée cellulaire dérivée
Numéro de passage
• Nombre de sous-cultures successives issues de la culture primaire
Sécurité en culture cellulaire
Substances dangereuses pour la santé
Cancérigène
• Une substance qui peut provoquer le cancer
Tératogène
• Une substance qui peut endommager le fœtus en
développement
Mutagène
• Une substance qui peut provoquer une mutation dans le matériel
génétique qui peut être transmise à la génération suivante
Gentamycine et Thapsigargin Possible Tératogènes

Hygromycine Cancérogène possible
Mutagène streptomycine
Sécurité…
Traitement des déchets
• Tous les déchets qui sont entrés en contact avec les cellules
doivent être autoclavé
• Les pipettes, flacons, autres récipients et gants sont placés dans
des sacs d'autoclave dans le bac sur le côté de l'armoire. Ne
laissez pas de liquides dans ces
• Les déchets liquides vont dans les bouteilles sur le chariot dans
la suite de culture cellulaire pour être autoclavés. Ces bouteilles
contiennent un désinfectant à base de chlore
• Ne remplissez pas excessivement les conteneurs de déchets car
cela pose des problèmes dans l'autoclave
• Les déchets de papier tels que les emballages de pipettes et de
flacons doivent aller dans les poubelles recouvertes de sacs noirs
Sécurité…
Utilisation des zones de culture cellulaire
• La zone de culture cellulaire, comme tout autre laboratoire, est
une zone de travail
• N'apportez pas votre copains avec toi
• Ne pas manger, boire ou fumer dans ces domaines
• N'utilisez pas de téléphone portable
• Portez un blouse de laboratoire à tout moment, que ce soit

dans une zone de culture cellulaire ou dans un laboratoire
• Portez des gants jetables, mais assurez-vous de les éliminer
de la bonne manière avant de quitter la zone
• Ne pas porter de jetable gants dans les couloirs ou dans les
zones de rédaction
Cellule Culture Laboratoire Équipement
• Laminaire-couler capuche
• Les hottes à flux laminaire ou les
enceintes de sécurité biologique offrent
un environnement de travail propre pour
éviter la contamination des cultures
cellulaires.
• Certaines hottes laminaires sont
équipées d'un UV-germicide lampe pour
stériliser le contenu à l'intérieur lorsqu'il
n'est pas utilisé.
• le La lampe UV doit être éteinte avant de
travailler dans la hotte pour éviter toute
exposition aux rayons UV dangereux.
• Inversé microscopes
• Des microscopes inversés
sont utilisés pour observer les
cellules dans culture.
• Inversé Les microscopes sont
un type de microscope avec
les lentilles d'objectif au-
dessous de la scène et la
source de lumière et le
condenseur au-dessus de la
scène.
Inversé microscopes
• Quand observer votre cellules:
• Essuyer la scène avec de l'alcool.
• Si vous devez nettoyer les
lentilles, utilisez uniquement du
papier pour objectif pour éviter de
rayer la lentille du microscope.
• Endroit votre assiette ou flacon de
cellules sur la scène.
• Tour sur la lumière.
• Tour la tourelle de l'objectif au
plus petit grossissement (4X).
• Quand observer votre cellules:…
• Regardez les cellules en utilisant les
lentilles oculaires tout en déplaçant
légèrement le ballon et en vous
concentrant pour trouver les cellules.
• Tournez la tourelle à un grossissement
plus élevé. Habituellement, 10X est
suffisant
• Ajustez les boutons de mise au point
pour obtenir la meilleure image
possible.
• Vous pouvez faire glisser un anneau de
phase dans le trajet de la lumière pour
une image plus claire. Pour observer
Clinique Centrifuger
• Centrifugeuses cliniques sont
utilisé pour concentrer les cellules
et pour séparer les cellules du
milieu ou d'autres réactifs.
• Vitesse lente une centrifugeuse
clinique doit être utilisée pour
éviter d'endommager les cellules.
• Pour rotation de routine des
cellules, une vitesse de 80-100g
(force gravitationnelle) est
suffisante.
• Plus haute les vitesses peuvent
endommager les cellules.
Incubateur
• Les incubateurs fournir
l'environnement approprié
pour la croissance des
cellules. Les incubateurs de
culture cellulaire ont trois
fonctions principales
• Constant Température- Pour
cellules de mammifères, la
température est maintenue à
• CO2 du gaz est nécessaire
37oC.
pour maintenir le pH équilibré;
• Humidité - pour éviter
c'est pourquoi la culture
l'évaporation du milieu de cellulaireincubateurs sont
culture cellulaire
• 37C eau une baignoire • Réfrigérateur et congélateurs
• Les milieux et la plupart des La plupart des réactifs et
solutions utilisées pour les solutions utilisés pour la culture
cultures cellulaires sont cellulaire sont conservés au
conservés au réfrigérateur à réfrigérateur pour une
4 ° C. Les cellules, conservation à court terme.
cependant, sont conservées Certains des réactifs peuvent
à 37 ° Cincubateur être conservés dans le
• Danger biologique déchets congélateur à -20 ° C pour un
conteneurs Les matières stockage à plus long terme. Les
potentiellement dangereuses installations de culture cellulaire
doivent être éliminées ont souvent un
correctement dans des • Congélateur -80oC pour le
conteneurs de déchets stockage de certains réactifs et
biologiques et stérilisées le stockage à court terme des
• Cellule culture navires La
plupart des cellules en
culture doivent se fixer à un
substrat pour se diviser et se
développer. Ces cellules
forment souvent
unmonocouche et couvrir la
surface à leur disposition
• Pipettes Les pipettes sont
utilisées pour le transfert de
volumes spécifiques de
liquide. Deux types de
pipettes sont couramment
utilisés danslaboratoires:
• Sérologique pipettes
• Micropipettes
Culture Navires
• Les récipients de culture fournissent une barrière
de contamination pour protéger les cultures de la
environnement tout en maintenir le bon interne
environnement
• Pour cellules dépendantes de l'ancrage, les
navires fournissent un adapté et cohérent surface
pour cellule attachement
• Autre les caractéristiques des navires
comprennent un accès facile la cultures et
surfaces de visualisation optiquement claires
Culture Navires
• Flacons
• Plastique les flacons sont disponibles avec une
gamme de zones de croissance, une variété de
formes, avec plusieurs cols différents dessins
• Surfaces de flacons sont spécialement traités
pour la croissance de cellules dépendantes de
l'ancrage
La description Zone de croissance Travail recommandé Rendement
(cm²) volume (mL) cellulaire *
T-25 25 5 - 10 2,5 x 106

T-75 75 15-25 7,5 x 106
T-150 150 30 - 50 15 x 106
T-175 175 35 - 60 17,5 x 106
T-225 225 45 - 75 22,5 x 106
* Dépend de la lignée cellulaire. Basé sur une densité de 1 × 10 ⁵ cellules / cm².

Navires de culture
• Culture de cellules vaisselle
• Les plats de culture cellulaire offrent la
meilleure économie et un accès à la
croissance surface
• Surfaces des boîtes de culture cellulaire
sont spécialement traité pour grandir
cellules dépendant de l'ancrage
La description Zone de croissance Travail recommandé Rendement

(cm²) volume (mL) cellulaire *
35 8 1-2 0,8 x 106

60 21 4-5 2,1 x 106
100 55 10 - 12 5,5 x 106
150 148 28 - 32 14,8 x 106
* Dépend de la lignée cellulaire. Basé sur une densité de 1 × 10 ⁵ cellules / cm².

Navires de culture
• Multiwell assiettes
• Multiwell les plaques offrent des économies
significatives d'espace, de support et de réactifs par
rapport à nombre de plats
Navires de culture
Revêtements de surface
• Plus le travail de culture tissulaire utilise du polystyrène jetable
navires
• le la surface du navire est traitée pour la rendre hydrophile
• Plus lignées cellulaires sont cultivées sur des surfaces en
plastique traitées vaisselle ou flacons
• Certains les lignées cellulaires exigeantes nécessitent un
traitement supplémentaire de la croissance surface avant qu'ils
ne s'attachent et proliférer
• Les techniques les plus courantes comprennent le revêtement
surface avec sérum, collagène, laminine, Gélatine, poly-L-
lysine, ou fibronectine
Cellule Les types
• Les cellules peuvent être divisées en
deux types principaux:
1- Culture cellulaire en suspension
(indépendante de l'ancrage)
• dérivé de cellules qui peuvent se diviser et
survivre sans être attachées à un substrat,
• par exemple des cellules de hémopoïétique
lignée
• Peut être conservé dans des récipients de
culture non traités par culture tissulaire,
• nécessite une agitation pour un échange
de gaz adéquat
• Plus facile à passer
Cellule Les types
2- Culture cellulaire adhérente
(dépendante de l'ancrage)
• doit adhérer à une surface pour survivre
• Forme monocouches
• par exemple, cellules dérivées de
différents tissus (sein, foie)
• La croissance est limitée par la
superficie
• Cessera de proliférer une fois qu'ils
deviennent confluents (couvrir
complètement la surface du récipient de
culture cellulaire)
• Les cellules sont dissociées
enzymatiquement ou mécaniquement à
partir de la surface
Cellule Culture Catégories
• Primunery des cultures • Établi Lignées
• Cellules tirée directement cellulaires
d'un tissu à une plat • Établi ou cellule immortelle
• Pouvez être des passages lignes
avec un nombre limité de • Cellules prélevé sur une
fois. Après la limite, la cellule culture primaire et passé
mourra.
• Cultures secondaires ou divisé in vitro.
• Pouvez grandir
• Ordinaire
indéfiniment culture
• Immortalisé
• Cellules d'ATCC et d'ETCC
• Spontané Transformation
• Transfection
• Fusion de cellules somatiques
(Hybridomes, Hybrides)
Primaire Culture
• Quand organes sont enlevés chirurgicalement d'un
organisme et placés dans un environnement de culture
approprié, ils vont attacher, diviser et grandir
• La plupart des cellules de culture primaires ont une
durée de vie finie de 5 à 10 divisions (passages) dans
vitro
• En raison de leur durée de vie limitée, on ne peut pas
faire d'expériences à long terme avec ces cellules
• Les cellules primaires sont considérées par de
nombreux chercheurs comme étant physiologiquement
plus similaires aux cellules in vivo
Culture primaire:
 Il fait référence au stade de la culture après que
les cellules ont été isolées du tissu et ont proliféré
dans des conditions appropriées jusqu'à ce
qu'elles occupent tout le substrat disponible,
c'est-à-dire atteignent la confluence
 Il y a quatre étapes:
1. Acquisition de l'échantillon
2. Isolement du tissu
3. Dissection et désagrégation
4. Culture après semis en
le récipient de culture
Étapes impliquées dans l'établissement de
la culture primaire:
• Préparation des tissus d'un jeune animal, ou
isolement de les cellules du sang, intrapéritonéale
fluide, organe, etc.
1. Isolement d'explant.
2. Désagrégation des tissus
3. Média culturel
4. Conditions physiologiques
5. Sous-culture
Isolement d'explant:
• Les questions éthiques doivent être prises en compte
lors de la collecte des explants.
• Les protocoles doivent être suivis pour éviter la

contamination.
• Les explants doivent être exempts de contamination.
• La manipulation doit être effectuée dans des conditions

aseptiques
• Les explants humains ne doivent être recueillis qu'après

le consentement du donneur et de ses proches.
Désagrégation des tissus
Les cultures cellulaires sont généralement démarrées à
partir d'explants désagrégés, les tissus peuvent être
désagrégés par les méthodes suivantes:
1. Désagrégation mécanique:
 Le tissu est soigneusement haché ou tranché en petits
morceaux en appuyant sur le tissu disséqué à travers une
série de tamis.
 Alternativement forcer le tissu à travers une seringue
 Les cellules se développent à partir de morceaux de tissu,
qui sont alors sous-cultivé.
 Donne la suspension cellulaire plus rapidement
 Cause des dommages mécaniques
 Les tissus mous répondent bien à cette technique, par
exemple le foie embryonnaire, la rate, etc.
Culture d'explants
• Il existe deux méthodes de base

pour obtenir une culture primaire:
1. Cultures d'explants:
• De petits morceaux de tissu sont
attachés (à l'aide de caillots de plasma
ou de fibrinogène) à un récipient de
culture en verre ou en plastique traité et
immergés dans un milieu de culture
• Après quelques jours, les cellules
individuelles passeront de l'explant de
tissu à la surface du récipient de culture
ou au substrat où elles commenceront à
se diviser et à se développer.
Désagrégation enzymatique
2. Désagrégation enzymatique:
 La matrice intercellulaire et les membranes basales contiennent
des glycoprotéines comme fibronectine qui sont sensibles aux
protéases, de sorte que les enzymes peuvent être utilisées pour
désagréger les cellules des tissus.
 Les enzymes couramment utilisées sont
 Trypsine
 Collagénase
 Héparinase
 Hyluronidases
 Pronases
 dispase, etc.
 La trypsine brute est de loin l'enzyme la plus couramment
utilisée car elle est assez bien tolérée par de nombreuses
cellules et est efficace pour de nombreux tissus.
Chaud Trypsinisation Méthode
• Dans cette méthode, l'exposition des cellules à la trypsine
active à 37 ° C est minimisée pour préserver la viabilité
maximale, par conséquent les cellules dissociées sont
collectées toutes les demi-heures.
• La trypsine est éliminée par centrifugation et neutralisée
avec du sérum en milieu.
• Ne fonctionne pas aussi bien avec les tissus adultes
contenant beaucoup de tissus conjonctifs fibreux.
• L'agitation mécanique peut endommager certains types
de cellules plus sensibles tels que épithilium
• Le temps requis est jusqu'à 4 heures.
• Le nombre de cellules viables est inférieur.
Du froid Trypsinisation Méthode :
• C'est une méthode simple pour minimiser les
dommages aux cellules lors de l'exposition à la
trypsine
• Le tissu est imbibé de trypsine à 4° C de 6 à 18
heures pour permettre la pénétration de l'enzyme
avec peu Tryptique activité.
• Suivi par désagrégation à 37 ° C pendant 20-30
minutes.
• Cette méthode donne un rendement plus élevé de
cellules viables.
• C'est plus pratique car aucune agitation n'est
nécessaire et l'incubation à 4 ° C peut être effectuée
Traitement EDTA:
 L'adhésion de cellule à cellule est médiée par
l'interaction glycopeptides ou communément
appelées molécules d'adhésion cellulaire (CAM).
 Certaines de ces molécules d'adhésion sont
dépendantes du calcium et donc sensibles aux
agents chélateurs comme l'EDTA.
 Tissus comme épithilium nécessitent Ca2+ pour
leur intégrité et peuvent donc être facilement
désagrégés par traitement avec de l'EDTA préparé
dans une solution saline équilibrée.
Désagrégation enzymatique
• En plus de la trypsine, les autres enzymes utilisées
pour la dissociation tissulaire sont:
• Collagénase
• Élastase
• Pronase
• Papaïne
• Dispase
• Dnase
• Hyaluronidase
• Ces enzymes sont utilisées seules ou dans divers
combinaison
Cont…
• Tel que : Élastase & Dnase pour isolement de

cellules alvéolaires de type II collagénase avec
Dispase et collagénase avec hyaluronidase .
• Il existe d'autres enzymes non mammifères,

telles que trypsine, TrypLE(Invitrogen),
microbienne recombinante, et Accutase et
Accumax (Innovative Cell Technologies),
également disponible pour la désagrégation
primaire.
Cont.
Les préparations brutes sont souvent plus efficaces que les
préparations enzymatiques purifiées, parce que les
premières contiennent d'autres protéases en tant que
contaminations, bien que les dernières soient généralement
moins toxiques et plus spécifiques dans leur action.
Trypsine et pronase donnent la désagrégation la plus

complète, mais peuvent endommager les cellules.
Collagénase et dispase, d'autre part, donnent une

désagrégation incomplète, mais sont moins nuisibles.
Cont.
• Hyaluronidase peut être utilisé avec collagénase
digérer la matrice intracellulaire, et Dnaseest
utilisé pour disperser l'ADN libéré des cellules
lysées; L'ADN a tendance à altérer la protéolyse
et à favoriser la réagrégation.
Étapes de l'établissement de la culture primaire:
Culture de Établi Lignées
cellulaires
• Les cellules peuvent être cultivées à partir de
deux sources:
• À partir d'une aliquote cellulaire stockée dans l'azote
liquide
• Cellules adhérentes déjà en culture: cellules de
passage
cellulaires
• De liquide azote stocké cellule
• Le flacon d'azote liquide est placé dans un bain-marie à 37 ° C, agitez le
flacon en continu jusqu'à ce que le milieu soit décongelé
• Centrifuger le flacon pour 5 minutes à 1000 tr / min à température

ambiante, essuyez le haut du flacon avec de l'éthanol à 70% et jetez le
surnageant
• Re-suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet avec 20% de

FBS et transférer sur une plaque de culture correctement étiquetée
contenant la quantité appropriée de moyen
• Vérifiez les cultures après 24 heures pour s'assurer qu'ils sont attachés au
assiette
• Changer de support comme Couleur changements, utilisez 20% de FBS

jusqu'à ce que les cellules soient établies
cellulaires
• Cellules adhérentes déjà en culture: passage cellules
• Les cellules sont lavées avec du PBS (sans Californie & Mg ) Solution
• Ajouter assez de trypsine / EDTA pour couvrir monocouche
• Incuber la plaque à 37 C pour 1-2 minutes
• Robinet le navire sur les côtés pour déloger le cellules
• Ajouter milieu complet pour dissocier et déloger le cellules
• Avec l'aide de pipettes qui sont restées à être adhérent
• Ajouter le support complet dépend du sous-culture
• Exigence soit à flacon de 75 cm ou 175 cm

Compter les cellules dans un Hémocytomètre
• 1. Nettoyer la chambre et la lamelle avec de l'alcool.
Sécher et fixer la lamelle dansposition
• 2. Récoltez les cellules. Ajouter 10μL des cellules au
hémacytomètre. Ne pas trop remplir.
• 3. Placez la chambre dans le microscope inversé sous
un objectif 10X. Utilisez le contraste de phase pour
distinguercellules.
• 4. Comptez les cellules dans le grand carré quadrillé
central (1 mm2) ou dans les quatre carrés d'angle.
Déterminez la moyenne et multipliez-la par 104 pour
estimer le nombre de cellules par mL. Préparer
dupliquer ou tripler échantillons et faire la moyenne du
Compter les cellules dans un Hémocytomètre
DF X 25 X dix4
= 0,50 x 106 cellules

/ mL
Viabilité cellulaire
• La viabilité cellulaire est déterminée en colorant les
cellules avec trypan bleu
• Comme trypan le colorant bleu est perméable aux cellules

non viables ou aux cellules mortelles alors qu'il est
imperméable à ce colorant
• Colorez les cellules avec trypan teindre et charger

hémocytomètre et calculer le% de cellules viables
-% de cellules viables = Nu. de cellules non colorées x 100
total nu. de cellules
Gelé cellules pour espace de
rangement
• Retirer le milieu de croissance, laver les cellules par PBS et
éliminer le PBS par aspiration
• Déloger les cellules par trypsine-EDTA
• Diluer les cellules avec du milieu de croissance
• Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml,
centrifuger à 200 g pendant 5 minutes à température ambiante et
retirer le milieu de croissance par aspiration
• Remettre les cellules en suspension dans 1 à 2 ml de milieu de
congélation (milieu DMEM complet complété avec 10 à 20% de
FBS et 5 à 10% de DMSO. Diluez le tout à une concentration finale
entredix6 et 10sept
• Transférer les cellules vers cryotubes, incuber le cryotubes à -80 C
pendant la nuit
• Transfert le lendemain cryotubes à Azote liquide
Culture de cellules Environnement
 Physico-environnement chimique
• Milieux de croissance (pH, pression osmotique, O2 et
Cie2 tension)
• Température
 Environnement physiologique
Culture de cellules Médias
• Les milieux utilisés pour la culture des tissus doivent

pouvoir soutenir leur survie et leur croissance.
• Le choix du milieu dépend du type de cellules à
cultiver.
• Les cellules normales et les cultures primaires de
tissus sains nécessitent des quantités définies de
protéines, de facteurs de croissance et d'hormones.
• Les cellules transformées peuvent synthétiser leurs
propres facteurs de croissance.
• Les différents types de supports sont généralement
classés comme supports naturels et supports
artificiels.
 Le milieu de culture est le composant le plus
important de l'environnement culturel, car il
fournit:
 Nutriments nécessaires
 Facteurs de croissance
 Hormones pour la croissance cellulaire
 Régulation du pH de la culture
 Pression osmotique de la culture

Milieu de culture cellulaire
1- Le divers nutriments nécessaires sont:
• glucose,
• les graisses et acides gras,
• lipides, phospholipides et sulfolipides,
• ATP et acides aminés
• Vitamines
• Minéraux
2- Sérum:
• Le sérum peut fournir divers facteurs de croissance,
hormones et d'autres facteurs nécessaires à la plupart des
cellules de mammifères pour leur long terme croissance et
métabolisme
Milieu de culture cellulaire
• L-Glutamine
• L-Glutamine est un acide aminé essentiel requis par
pratiquement tous les mammifères cellules Cultivé en
culture
• Il est utilisé pour la production de protéines, comme
source d'énergie et dans l'acide nucléique métabolisme
• Il est également plus labile dans les milieux de culture
de cellules liquides que les autres amino les acides
• le taux et étendue de la L-glutamine dégradation sont
liés aux températures de stockage, à l'âge du produit et
pH
Tampon en culture cellulaire
• Un indicateur de pH peut être inclus dans la formulation
originale pour permettre l'observation directe du pH du milieu
• PH optimal entre 7,2 à 7.4 est généralement nécessaire pour
les mammifères cellules
Tampon en culture cellulaire
• Généralement dans l'indicateur de pH du
milieu de culture cellulaire, généralement
phénol rouge est utilisé pour analyser le
pH de l'environnement dans lequel les
cellules sont croissance
• Phénol rouge est:
• Jaune en milieu acide (pH 6.8),
• tomate rouge à pH neutre (7,0),
• rouge à pH alcalin (7.4)
• et bleu à augmenté basicité (pH 7,6)
• et enfin violet en haut pH
Suppléments à Milieu: Antibiotiques
• Prévention de la contamination par les différents microorganismes
(bactéries, mycoplasmes et champignons) est la partie la plus
importante de tous animal cellule culture
• le le risque de contamination pendant la culture peut être évité en
ajoutant différents antibiotiques, tels comme:
• pénicilline (100 U / ml) pour les bactéries,
• streptomycine (100 mg / ml) pour les bactéries,
• ou gentamycine (50 mg / ml) pour les bactéries,
• et nystatine (50 mg / ml) pour les champignons et Levure
• le utilisation courante de antibiotiques n'est généralement pas

recommandé car:
• il peut conduire à un relâchement de l'asepsie technique
• résistant les micro-organismes peuvent développer
• microbien la croissance peut être contrôlée mais biochimique la modification peut
être produit
 Les trois classes de base de médias sont:
a. Médias basaux
b. Milieux à sérum réduit
c. Milieux sans sérum

 Médias basaux
• Contient acides aminés, vitamines, sels inorganiques,
et un source de carbone comme le glucose.
• Formulations de milieux basaux doit être en outre
complété par sérum.

 Milieux à sérum réduit
• Basal formulations de milieux enrichis en nutriments et
en facteurs d'origine animale avec quantité réduite de
sérum
 Médias sans sérum

• Formulations nutritionnelles et hormonales appropriées
remplace complètement le sérum
• Le milieu sans sérum associé à des facteurs de

croissance a la capacité de milieu sélectif pour la
culture cellulaire primaire.
Achevée Croissance Médias
• En plus des nutriments, le milieu aide à maintenir le
pH et l'osmolalité dans un système de culture.
• le Le pH est maintenu par un ou plusieurs systèmes
tampons; CO₂ / bicarbonate de sodium, phosphate
et HEPES sont les plus courants.
• Sera mettra également en mémoire tampon un
support complet. Le rouge de phénol, un indicateur
de pH, est ajouté au milieu pourcolorimétriquement
surveiller les changements dans pH.
• Les milieux de culture couramment utilisés sont les
suivants:
• Milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM) Il est
formulé avec une concentration réduite en
bicarbonate de sodium (1 500 mg / l) pour une
utilisation avec 5% de CO₂ (voir Bicarbonate de
sodium et tamponnage, page 14).
• Parce que l'EMEM est un milieu simple, il est
souvent enrichi de suppléments supplémentaires ou
de niveaux plus élevés de sérum. Dulbecco
• Médium d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) a
environ deux fois la concentration d'acides aminés
et quatre fois la quantité de vitamines que l'EMEM,
ainsi que le nitrate ferrique, le pyruvate de sodium
et certains acides aminés supplémentaires (mais
pas tous les acides aminés non essentiels).
• le la formulation originale contenait 1 000 mg / L de
glucose, mais dans les variations les plus
couramment utilisées, cette quantité était
augmentée à 4 500 mg / L.
• Iscove Modifié Dulbecco Moyen (IMDM) était
formulé pour croissance des lymphocytes et
hybridomes. Par rapport au DMEM, il a Additionnel
aminé les acides, vitamines et inorganique sels.
• Potassium nitrate était substitué pour ferrique
nitrate.
• Il aussi contient HEPES et sélénium. ATCC IMDM
(ATCC® n ° 30-2005) dispose d'unréduit
concentration de bicarbonate de sodium (1500 mg /
L) à utiliser avec 5% CO₂.
• Hybri-Care moyen (ATCC® n ° 46-X) est une
combinaison et une modification de milieu DMEM et
NCTC 135 supplémenté en insuline,
oxalacétiqueacide et HEPES. Il est basé sur la
formulation utilisée par David H.
• Sachs et collaborateurs pour la propagation de
hybridomes et d'autres lignées cellulaires
fastidieuses.
• Le 5A et le RPMI-1640 de McCoy ont été
développés au Roswell Park Memorial Institute
(RPMI) à Buffalo, New York.
• McCoy's 5A (ATCC® n ° 30-2007) était à l'origine
utilisé pour cultiver Novikoff hépatome cellules et
soutiendra la croissance des cultures primaires.
• Les mélanges nutritifs de jambon ont été
développés à l'origine pour soutenir la croissance
clonale des cellules d'ovaire de hamster chinois
(CHO) (ATCC® CCL-61 ™).
• Comme avec EMEM, de nombreuses modifications
ont été apportées à la formulation originale, y
compris le milieu F-12 de Ham, une formulation plus
complexe que le F-10 original adapté à une
propagation sans sérum
• Le milieu DMEM / F12 est un mélange 1: 1 d'EMEM
modifié de Dulbecco et de F-12 de Ham.
• Il est un milieu extrêmement riche et complexe et
soutiendra la croissance d'un large éventail de types
cellulaires dans le sérum et sans sérum
formulations.
• Leibovitz Le milieu L-15 (ATCC® n ° 30-2008) est
formulé pour une utilisation sans incubation au CO₂
• le le système tampon standard de bicarbonate de
sodium / CO₂ est remplacé par une combinaison de
tampons phosphate, d'acides aminés à base libre, de
niveaux plus élevés de pyruvate de sodium et
galactose.
• Cellule les cultures peuvent être cultivées dans des
incubateurs à CO₂ avec du milieu L-15 à condition qu'il
n'y ait pas d'échange entre l'air du récipient de culture
et celui de l'incubateur (c'est-à-dire que les bouchons
des flacons sont bien fermés).
Exigences de base pour une culture
cellulaire réussie
1. La première nécessité est une installation de culture cellulaire
bien établie et correctement équipée. Toutes les installations
doivent être équipées des éléments suivants:
• UNE poste de sécurité biologique certifié
• protège à la fois les cellules en culture et le travailleur des contaminants biologiques
• Une centrifugeuse, de préférence capable de réfrigération

• Un microscope pour l'examen des cultures cellulaires et pour le
comptage des cellules
• Et un incubateur humidifié réglé à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans les
airs
• Un bain-marie à 37 ° C rempli d'eau contenant des inhibiteurs de la
croissance bactérienne et fongique peut également être utile si le
réchauffement du milieu avant l'utilisation est souhaité.
Exigences de base pour une culture cellulaire
réussie
2. La deuxième condition pour une culture cellulaire réussie est la
pratique de la technique stérile
• Avant de commencer tout travail, l'enceinte de sécurité biologique doit être
allumée et autorisée à fonctionner pendant au moins 15 min pour purger
l'air contaminé
• Toutes les surfaces de travail à l'intérieur de l'armoire doivent être
décontaminées avec une solution appropriée;
• 70% d'éthanol ou d'isopropanol sont couramment utilisés à cette fin
• Tout matériel requis pour la procédure doit être décontaminé de la même

manière et placé dans ou près de l'armoire
• Ceci est particulièrement important si les solutions ont été réchauffées
dans un bain-marie avant utilisation
• Le travailleur doit porter un équipement de protection individuelle approprié
pour le type de cellule en question
réussie
• Les mains gantées doivent être aspergées de

décontaminant avant de les mettre dans l'armoire et les
gants doivent être changés régulièrement si quelque
chose à l'extérieur de l'armoire est touché
• Il faut veiller à ce que tout ce qui entre en contact avec
les cellules d'intérêt, ou les réactifs nécessaires à leur
culture et à leur passage, soit stérile (soit autoclavé, soit
stérilisé par filtre)
réussie
3. Une troisième nécessité pour une culture cellulaire réussie
est des réactifs et des fournitures appropriés et de qualité
contrôlée
• Il existe de nombreux fournisseurs de milieux de culture tissulaire et
de suppléments
• Les exemples comprennent:
• Invitrogen (www.invitrogen.com),
• Sigma – Aldrich (www.sigmaaldrich.com),
• BioWhittaker (www.cambrex.com),
• et Cellule souche Technologies Inc. (www.stemcell.com).
• De même, il existe de nombreux fournisseurs de articles en plastique

nécessaire pour la plupart des applications de culture cellulaire (c.-à-
d. boîtes de culture et / ou flacons, tubes, pipettes jetables)
réussie
4. La dernière nécessité pour une culture cellulaire réussie est la
connaissance et la pratique des techniques fondamentales impliquées
dans la croissance du type cellulaire d'intérêt
• La majorité de la culture cellulaire réalisée par les chercheurs implique l'utilisation
de diverses lignées cellulaires non adhérentes ou adhérentes à croissance
continue
• Ces lignées cellulaires peuvent être obtenues auprès de fournisseurs réputés tels
que:
• l'American Tissue Type Collection (ATCC; www.atcc.org)
• ou DSMZ (Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires) (
www.dsmz.de/mutz/mutzhome.html)
• Alternativement, ils peuvent être obtenus auprès de collaborateurs
• Quelle que soit la source des cellules, il est conseillé de vérifier l'identité de la
lignée cellulaire et de s'assurer qu'elle est exempte de contamination
mycoplasique
réussie
• Préparation du Milieu de culture cellulaire
• Bien que certains milieux sans sérum sont
disponibles et certaines lignées cellulaires ont été
adaptées à la croissance dans un tel milieu, la
plupart des lignées cellulaires nécessitent l'ajout
de 5 à 10% de sérum comme supplément pour
favoriser la multiplication cellulaire
• Le sérum fœtal bovin (FBS) est souvent le
meilleur à utiliser
• L-glutamine
• Pénicilline/streptomicine
Cycle de croissance dans la culture de
l'attachement
• Les cellules eucaryotes en culture d'attachement
ont un cycle de croissance caractéristique
similaire à les bactéries
• le le cycle de croissance est généralement divisé
en trois phases:
1- Phase de retard
• C'est le temps qui suit la sous-culture et le
réensemencement pendant lequel Là est peu de preuves
d'une augmentation de la cellule nombre
• Il est une période d'adaptation pendant laquelle la cellule
remplace éléments perdus pendant trypsinisation, attache
à la surface, et se propage en dehors
l'attachement
2- Phase du journal
• C'est la période d'augmentation exponentielle du nombre de cellules
• le la longueur de la phase log dépend de la densité de semis, du
taux de croissance du cellules
• Il est le moment optimal pour l'échantillonnage puisque la population
est la plus uniforme et la viabilité est haute
3- Phase du plateau
• Vers la fin de la phase log, la culture devient confluente
• Toute la surface de croissance disponible est occupée et toutes les
cellules sont en contact avec les cellules environnantes
• Après la confluence, le taux de croissance de la culture est réduit et,
dans certains cas, la prolifération cellulaire cesse presque
complètement
• A ce stade, la culture entre dans la phase plateau (ou stationnaire) et
la fraction de croissance diminue
l'attachement
Morphologie des cellules
• Les cellules cultivées sont généralement
décrites en fonction de leur morphologie
(forme et apparence), il existe deux
morphologies de base: Cellules épithéliales conjonctivales
humaines (HConEpiC) - Contraste de
1. De type épithélial: phase, 100x.
• cellules qui semblent aplaties et de forme

polygonale
2. De type fibroblaste:
• cellules qui apparaissent mince et allongé
• Les conditions de culture jouent un rôle
important dans la détermination de la
forme et de nombreuses cultures
cellulaires sont capables de présenter
de multiples morphologies
Homo sapiens, humain, prépuce
Température et humidité
• Température
• Température optimale est également nécessaire pour la
bonne croissance de la cellule
• L'optimum température de mammifère est 37oC
• Humidité
• Une bonne humidité est également essentielle pour la
croissance cellulaire car l'humidité Distribution
indirectement a également un effet sur Température
• Pour cellule croissance 100% d'humidité est essentielle
à réduire évaporation
Stockage du support
• Une fois préparé, le milieu de culture cellulaire
doit être correctement conservé
• Pour un stockage à long terme, il doit être
congelé sans NaHCO3
• À court terme, le milieu doit être conservé à 4 ° C
et réchauffé à 37 ° C uniquement pendant le
temps nécessaire à la réalisation d'une
expérience donnée
Contamination
• Minimisez le risque !!!
Sources de contamination
• Les bactéries
• Champignons
• Moule
• Levure
• Mycoplasme
• Autres types de cellules
• Organismes libres, particules de poussière ou

aérosols
• Surfaces ou équipements
Classe II
Biologique
sécurité
Cabinet
Protection de
• personnel
• environnement
• produit
Armoires de classe 1
protéger le
produit seulement
Classe II Ventilateur
Biologique d'extraction
Échappement
sécurité Filtre HEPA
Cabinet Écoulement laminaire

Ventilateur
Filtres HEPA Laminaire

Filtre HEPA
Laminaire couler
Pare-air Verticale
Flux d'air laminaire
Technique aseptique 1
• Environnement contrôlé
• Trafic, flux d'air
• Milieux et réactifs stériles
• Évite la contamination aérienne des solutions
• Évite la contamination manuelle de l'équipement

• Minimisez le trafic
• Espace de travail dégagé
• Écouvillon d'éthanol 70%
• Minimiser la zone de travail (champ de vision)
• Gardez la zone de travail propre
• Ne vous penchez pas sur des récipients ouverts
• Irradiation UV avant et après
• N'utilisez l'équipement jetable qu'une seule fois
• Minimisez l'exposition à l'air
• Flame bouteilles si sur un banc ouvert
• Évitez l'ouverture répétée des bouteilles
• Évitez l'accumulation de liquide autour du col et
des lèvres des bouteilles
• Évitez une agitation excessive
• Un seul type de cellule à la fois
• Ne pas ouvrir les solutions contaminées
• Pas de brûleur dans la hotte
Méthodes dans Cellule La biologie
Technique de génération de
lignées cellulaires
• La transfection
• Méthode pour introduire des séquences d'acide
nucléique exogènes chez des mammifères cellules
• Technique largement utilisée qui a rendu l'expression
de l'ADN ou de l'ARN dans la plupart des types de
cellules relativement facile
• Une variété d'approches ont été développées pour
une utilisation dans une gamme de applications
• Aucune approche unique ne fonctionnera pour toutes
les conditions / types de cellules / applications
• Facteurs affectant la transfection
• Cellule hôte
• Santé cellulaire
• Les cellules doivent être cultivées dans un milieu approprié
avec tous les facteurs nécessaires
• Les cellules doivent être exemptes de contamination
• Un milieu frais doit être utilisé s'il contient des composants
chimiquement instables, tels que la thiamine
• Les cellules doivent être incubées à 37 ° C avec du CO2 fourni
au pourcentage correct (5-I0%) et 100% d'humidité relative
• Les cellules doivent être maintenues en phase de croissance
logarithmique
• Cellule hôte
• Culture culture (confluence et phase de croissance)
• La cellule doit être transfectée à 40-80% confluence
• Trop peu de cellules entraînent une mauvaise croissance de la culture
cellulaire sans contact de cellule à cellule
• Un trop grand nombre entraîne une inhibition de contact rendant les
cellules résistantes à l'absorption d'ADN
• Les cellules en division active absorbent mieux l'ADN que les cellules
quiescentes
• Nombre de passages pour la culture primaire
• Le nombre de passage doit être faible (moins de 50)
• Les cellules peuvent ne pas répondre aux mêmes conditions de
transfection après un passage répété
• Matériel génétique
• Qualité et quantité de l'ADN
• Utilisez un ADN plasmidique de haute qualité sans protéines,
ARN et produits chimiques pour la transfection; l'élimination des
endotoxines doit faire partie de la procédure de préparation
• Généralement, l'ADN est mis en suspension dans de l'eau stérile

ou du tampon TE jusqu'à un une concentration de 0,2 à 1 mg /
ml.
• La quantité optimale d'ADN utilisée dans la transfection variera

largement en fonction du type d'ADN, du réactif / méthode de
transfection, de la lignée cellulaire cible, du nombre de cellules
• Méthodes de transfection
• Lipide
• Facile, méthode la plus courante
• Variable efficacité
• Volonté ne fonctionne pas avec toutes les cellules les types
• Viral
• Volonté transfect non divisant cellules
• Techniquement difficile, coûteux
• sécurité problèmes, réponse immunitaire, mutagenèse
• Électroporation
• A besoin équipement spécialisé
• Cellules doit être en suspension
• Toxicité peut être un problème
• Méthodes de transfection
• Physique
• Techniquement difficile, cher
• A besoin équipement spécialisé
• Travaux avec des acides non nucléiques; transfection
monocellulaireViral
• Autres utilisations
• Phosphate de calcium
• Polymères cationiques
• DEAE-dextran
• Activé dendrimères
• Perles magnétiques
• Nanoparticules / laser / ultrasons
Phosphate de calcium
• le un précipité de phosphate de calcium insoluble avec
l'ADN attaché adhère à la surface cellulaire et est
introduit dans les cellules par endocytose.
• Calcium la transfection de phosphate peut entraîner une

expression transitoire de l'ADN délivré dans la cellule
cible, ou l'établissement de lignées cellulaires stables
(cette dernière nécessite un processus de sélection de
médicament).
• Efficacité de transfection peut être proche de 100% selon

les lignées cellulaires utilisé
• Procédure
• Préparer 2 M de CaCl2 solution dans l'eau, stériliser
par filtre et conserver dans la pièce Température
• Préparez le 2x HBS tampon
• Porter des cellules dans Eagle's Minimum Essential
Medium avec 10% de FBS.
• 24 h avant la transfection, trypsiniser et
réensemencer les cellules en phase log dans des
boîtes de culture tissulaire de 35 mm. Pour
ensemencement densité, cellules devrait atteindre
60 à 70% de confluence pour la transfection.
• Procédure
• Remarque: la meilleure confluence pour différentes lignées
cellulaires diffère. Pour les cellules HEK-293, une confluence de
60 à 70% est suggérée.
• 3 h avant la transfection, reconstituer les cellules avec du
milieu frais.
• Pour chaque transfection d'ADN, préparer les mélanges dans
deux tubes séparés (Solution-A et Solution-B)
• Ajouter Solution-B lentement (goutte à goutte) dans la
solution-A tout en mélangeant la solution-A.
• Remarque: Il s'agit de l'étape la plus importante pour la formation d'un
coprécipité ADN / phosphate de calcium. Mélanger doucement mais
• Procédure
• Après mélanger les deux solutions, incuber à température ambiante
pendant 20-30 min (un temps d'incubation plus court peut être utilisé
pour différents types de cellules; veuillez déterminer empiriquement).
La solution deviendra opaque pendant la formation de précipités.
• Doucement appuyez sur le mélange. Ajouter le mélange directement
aux cellules en égouttant lentement et uniformément dans le milieu
(une bonne façon est de laisser la pointe toucher la surface
moyenne).
• Doucement inclinez la plaque d'avant en arrière plusieurs fois pour
permettre une distribution uniforme du précipité ajouté sur la surface
de la cellule.
• Incuber les cellules à 37 ºC avec 5% de CO 2 pendant 24 h, puis
reconstituer le milieu.
Transfection médiée par le DEAE dextran
• DEAE-Dextran (diméthyl aminoéthyl dextran) est
un hydrosoluble et polycationiquequi a plusieurs
charges positives. Il est ajouté à la solution de
transfection contenant l'ADN.
• Interaction du DEAE avec les molécules d'ADN à
charge négative et avec les composants de la
surface des cellules. Le DEAE-dextran provoque
l'absorption d'ADN par les cellules par
endocytose.
• Cette procédure est parfaitement adaptée à la
transfection transitoire qui est utilisée pour
diverses études de biologie moléculaire, en
particulier en utilisant cos mais n'est pas efficace
pour produire une transfection stable.
Transfection médiée par le DEAE dextran
DEAE-dextran est un hydrosoluble et
polycationique qui a de multiples charges
positives
Il est ajouté à la solution de transfection contenant

l'ADN
Interaction du DEAE avec les molécules d'ADN

chargées négativement et avec les composants
de la surface des cellules.
Le DEAE dextran entraîne l'absorption d'ADN par

les cellules par endocytose
ÉLECTROPORATION
• Le mélange de transfection contenant des cellules
et de l'ADN est exposé pendant une très brève
période (quelques millisecondes) à un gradient de
tension très élevé (par exemple 4000-8000 V / cm).
• L'électroporation se fait à température ambiante.
Mais les cellules sont ensuite conservées sur de la
glace pour permettre aux pores de la membrane de
rester ouverts plus longtemps.
• Cela induit des pores transitoires dans la membrane
cellulaire à travers lesquels l'ADN semble pénétrer
dans les cellules.
ÉLECTROPORATION
• Le traitement des cellules avec du colcémide avant
leur électroporation augmente la fréquence de
transfection.
• L'ADN linéarisé est beaucoup plus efficace dans la
transfection que l'ADN superenroulé circulaire en
raison d'une fréquence plus élevée d'intégration de
l'ADN linéaire dans le génome.
• Avantages: - de nombreux types de cellules
animales qui n'ont pas pu être transfectées par
d'autres approches ont été transfectées avec
succès par cette approche.
Infection rétrovirale
• Les rétrovirus recombinants produisent des virions,
qui sont utilisés pour infecter les cellules animales
et les embryons de souris. En général, des
enbryos précoces de 4 à 16 cellules sont utilisés.
Mais lorsque des embryons au-delà du stade 4-16
cellules sont utilisés, souvent toutes les cellules
d'un embryon peuvent ne pas être infectées par le
rétrovirus, ce qui donne des souris chimériques.
• Une chimère est un individu qui a dans son corps
des cellules de deux génotypes ou plus.
• Le génome ARN du rétrovirus recombinant est
copié par la transcriptase inverse pour produire
une copie d'ADN (transcription inverse), qui
s'intègre dans le génome de la cellule.
Infection rétrovirale
• La transcriptase inverse est codée par le rétrovirus
et est produite immédiatement après l'infection.
Cependant, la RT ne peut se produire que dans
les cellules qui passent par la phase S, c'est-à-dire
qu'elles sont actives sur le plan mitotique.
• Le principal avantage de cette méthode de
transfection est sa simplicité technique.
• Ses principales limites, cependant, sont les
suivantes: 1) les étapes supplémentaires
nécessaires à la construction de rétrovirus
recombinants
2) limites de la taille de l'insert d'ADN
3) masaïcisme des animaux récupérés.
Protéomique
• UNE «Protéome» est l'ensemble des protéines codées par un gène
• Identifier la protéomique toutes les protéines produites par une
cellule, un tissu ou organisme
• Déterminer comment le réseau de protéines parmi se
• Découverte des structures 3D précises des protéines
• Protéines plus complexe que les gènes
• ADN: 4 bases, protéines: 20 acides aminés
• Même avec la séquence d'une protéine, sa fonction et ses réseaux inconnue
• 3D forme de protéine pliée difficile à prédire
• Tout les cellules humaines ont le même génome, mais diffèrent quant aux
gènes actifs et aux protéines fait
• ~40000 gènes humains, chaque gène peut coder pour plusieurs protéines
(une cellule typique produit 100000 protéines)
Protéine extraction
Lyse tampon
• lyse tampon est une solution tampon utilisée dans le but de
casser des cellules ouvertes pour une utilisation dans biologie et
expériences biochimiques qui analysent les composés des
cellules (par exemple occidental tache, ELISA,
coimmunopresipitation…)
• Plus lyse les tampons contiennent des sels (par ex. Tris-HCl ou
EDTA) pour réguler l'acidité et osmolarité du lysat.
• quelquefois détergents (tels que Triton X-100 ou FDS) sont

ajoutés pour briser les structures membranaires. Lyse le tampon
peut être utilisé sur les cellules de tissus animaux et végétaux
Choisir une Lyse tampon
• L'objectif principal de lyse tampon isole les composés d'intérêt et
les maintient dans un environnement stable.
• Pour protéines, pour certaines expériences, les protéines cibles
doivent être complètement dénaturées, tandis que dans certaines
autres expériences, la protéine cible doit rester fonctionnelle.
• Différent les protéines ont également des propriétés différentes et
se trouvent dans différents environnements cellulaires.
• Donc, il est essentiel de choisir le meilleur tampon en fonction de
l'objectif et de la conception des expériences.
• le les facteurs importants à prendre en compte sont: le pH, la
force ionique, l'utilisation de détergent, les mesures
préventives protéolytique processus
Composant d'un Lyse tampon
• Le tampon crée un environnement pour les protéines
isolées. Chaque choix de tampon a une plage de pH
spécifique, donc le tampon doit être choisi en fonction
du fait que votre protéine cible est stable sous un
certainpH
• De plus, pour les tampons avec des plages de pH
similaires, il est important de déterminer si le tampon
est compatible avec votre cible protéine
Tampon Gamme de pH
Phosphate monosodique /
5,8 - 8,0
hydrogénophosphate disodique
Tris - HCl 7,0 - 9,0
HEPES - NaOH 7,2 - 8,2
• Additifs
• Sels: Lyse le tampon contient généralement un ou plusieurs
sels. La fonction des sels danslysetampon consiste à établir
une force ionique dans la solution tampon. Certains des sels
les plus couramment utilisés sontNaCl, KCl, et (NH4)2DONC4.
Ils sont généralement utilisés avec une concentration comprise
entre 50 et 150 mM
Extraction de protéines
• Additifs
• Détergent: Détergents sont des tensioactifs organiques
amphipathiques (à queue hydrophobe et tête hydrophile). Ils sont
utilisés pour séparer les protéines membranaires demembrane.
Détergentssont souvent classés comme non ionique, anionique,
cationique ou zwitterionique, en fonction de leur groupe de tête
hydrophile fonctionnalité.
• Détergents non ioniques comme Triton X-100 et zwitterionique
détergents comme CHAPS (3 - [(3-
cholamidopropyl)diméthylammonio] -1-propanesulfonate) sont
non dénaturant (ne perturbera pas les fonctions protéiques).
• Ionique détergents comme le dodécyl sulfate de sodium (SDS)
et détergents cationiques comme l'éthyle triméthyl bromure
d'ammonium dénaturent (perturberont les protéines les fonctions)
Tampons couramment utilisés
• NP-40 lyse tamponle l'agent solubilisant est le
NP-40, qui peut être remplacé par d'autres
détergents à différentes concentrations. Le
NP-40 est un non ionique détergent
• Recette:
• 150 mM NaCl
• 1,0% Nonidet P-40 (NP-40)
• 50 mM Tris-Cl
• Régler pH à 7,4
• RIPA (RadioImmunoPrécipitation Essai) lyse tampon: RIPA le
tampon est un lyse tampon pour immunoprécipitationet l'extraction
générale de protéines à partir de cellules et de tissus. Le tampon
peut être conservé sans vanadate à 4 ° C jusqu'à 1 an. Le tampon
RIPA libère les protéines des cellules et perturbe la plupart des
interactions faibles entre protéines
• Recette:
• 1% (poids / poids) Nonidet P-40 (NP-40)
• 1% (p / v) de sodium désoxycholate
• 0,1% (p / v) SDS
• 0,15 M NaCl
• Phosphate de sodium 0,01 M, pH 7,2
• 2 mM EDTA
• 50 mM sodium fluorure (NaF)
• 0,2 mM sodium frais orthovanadate (N / a3VO4.2H2O, il a une fonction d'inhibiteur de la phosphatase
car il imite phosphate)
• 100 U / ml d'inhibiteur de protéase, tel que aprotinine
• SDS (dodécyl sulfate de sodium) lyse
tampon est un détergent dénaturant ionique.
Le tampon SDS chaud est souvent utilisé
lorsque les protéines doivent être
complètement solubilisées et dénaturées.
• Recette:
• 0,5% (p / v) de SDS
• 0,05 M Tris⋅Cl
• Régler pH à 8,0
• Ajouter 1 mM Frais dithiothréitol (TNT)
• Lyse ACK (chlorure d'ammonium-
potassium) tampon est utilisé pour lyse de
des globules rouges dans des échantillons
biologiques où d'autres cellules telles que
globules blancs sont de plus grande l'intérêt
• Recette:
• 150 mM ammonium chlorure
• 10 mM bicarbonate de potassium
• 0,1 mM EDTA
• Régler pH à 7,2-7,4
• Lyse tampon dans les études d'ADN et d'ARN
• Dans des études comme la prise d'empreintes ADN, lysele
tampon est utilisé pour l'isolement de l'ADN. Le savon à
vaisselle peut être utilisé à la rigueur pour briser les
membranes cellulaires et nucléaires, permettant ainsi à l'ADN
d'être libéré. Autre tellyse les tampons incluent le propriétaire
Qiagen produit Buffer P2.
SPECTROPHOTOMÉTRIE
• La spectrophotométrie est un outil d'analyse
polyvalent.
• Le principe sous-jacent de la spectrophotométrie est
pour éclairer un échantillon et analyser comment
l'échantillon affecte la lumière.
• Les avantages de la spectrophotométrie sont:
• Il est souvent non destructif (c.-à-d. peut mesurer et
récupérer échantillon)
• Il est sélectif (souvent un composé particulier dans un
mélange peut être mesuré sans techniques de séparation),
• Il a un court intervalle de temps de mesure (10-14
secondes).
SPECTROPHOTOMÉTRIE
• APPLICATIONS DE SPECTROPHOTOMÉTRIE
• La détermination de la concentration de substances en
solution est l'utilisation la plus courante le
spectrophotomètre.
• Exact les concentrations peuvent être déterminées

dans les cas où ε sont connus et la mesure est
effectuée selon les conditions
• La spectrophotométrie est également une méthode

pratique pour mesurer l'activité enzymatique dans cas
où le substrat et le produit présentent des λmax.
IMMUNOESSAIS
• En raison de leur affinité spécifique et élevée interactions
avec épitopes, les anticorps sont de puissants réactifs pour
l'analyse de protéines ou autres antigènes
• Immunoessais sont utilisé pour détecter, quantifier et
caractériser les antigènes. Les tests peuvent également être
utilisés pour détecteret quantifier anticorps.
• Plus souvent, bien que, anticorps sont utilisés dans divers
tests analytiques. Ceux-ci inclus
• Enzymatique immunosorbant essai (ELISA),
• Radioimmunosorbant essai (RIA),
• Immunofluorescence (SI UN),
• Immunoblotting (également appelé Western blotting)
• Immunoprécipitation
IMMUNOESSAIS
• La procédure générale utilisée dans tous immunoessais
est
• 1) pour permettre le complexe anticorps-antigène formation
• 2) détection du complexe anticorps-antigène.
• Complexes antigène-anticorps sont formés en incubant
l'anticorps avec un extrait contenant l'antigène.
• Alternativement, l'antigène est absorbé ou fixé sur un
support solide puis l'anticorps se lie à l'antigène
immobilisé.
• La détection du complexe dépendra du test étant
effectuer (Boîte)
• directement étiquette 1er anticorps
• anti-anticorps (2e Un B)
• protéine A ou protéine G
IMMUNOESSAIS
IMMUNOPRECIPITATION
• Immunoprécipitation implique la purification de complexes
antigène-anticorps, qui sont puis analysé par
électrophorèse sur gel.
• Une première étape typique dans immunoprécipitation est
de radiomarquer la ou les protéines.
• Ce est facilement accompli en situations où la culture
cellulaire in vitro est possible en marquant
métaboliquement la protéine avec radioactif acides
aminés.
• Protéines peut également être étiqueté par des moyens
chimiques tels que l'iodation tant que le traitement n'affecte
pas défavorablement les épitopes reconnus par les
anticorps.
IMMUNOESSAIS
IMMUNOPRECIPITATION
• Les protéines sont ensuite solubilisées dans des conditions qui
n'affectent pas la capacité du anticorps à reconnaître la épitope
• Généralement, non-ionique détergents (par exemple., Triton X-
100) ne nuisent pas affecter la immunoprécipitation essai.
• En général, la formation de complexes antigène-anticorps est
rapide et les incubations de 30-60 minutes suffisent pour une
récupération maximale.
• Plus long des incubations peuvent être nécessaires pour
faibles concentrations de la protéine cible.
• Protéolyse peut également être un problème pendant la étape
d'incubation.
• Protéase des inhibiteurs doivent être ajoutés et les incubations
effectuées sur de la glace pour minimiser pertes.
IMMUNOESSAIS
IMMUNOPRECIPITATION
• L'isolement du complexe antigène-anticorps est
accompli par une purification d'affinité avec la protéine
A ou protéine G conjugué à agarose perles.
• Historiquement, fixe intact Staphylocoque areus des
bactéries ont été utilisées pour isoler Ag- Un B
complexes
• La protéine A et la protéine G se lient à la région Fc de
IgG avec un haut affinité
• Les complexes antigène-anticorps liés à la protéine A
(ou G) sont collectés par centrifugation et lavé
plusieurs fois pour éliminer les protéines
contaminantes.
IMMUNOESSAIS
• IMMUNOPRECIPITATION
• Antigène-anticorps complexes sont puis éluée de
la matrice d'affinité en faisant bouillir le agarose
perles dans échantillon d'électrophorèse tampon
contenant SDS et β-mercaptoéthanol.
• Lié les protéines peuvent également être éluées
avec faible pH et neutralisé rapidement si des
protéines non dénaturées sont nécessaires
subséquent analyses.
• le échantillon est ensuite soumis à une
électrophorèse sur gel SDS et immunoprécipité
protéines sont détectés par autoradiographie ou
fluorographie selon l'isotope
IMMUNOESSAIS
IMMUNOFLUORESCENCE
• L'immunofluorescence est utilisée pour localiser les
antigènes à spécifique types de cellules ou
compartiments subcellulaires.
• Le test peut être également adapté pour la détection et
la quantification de anticorps.
• La procédure générale consiste à incuber des cellules
ou des tissus avec l'anticorps primaire et détecter le
complexe antigène-anticorps avec un anticorps
secondaire conjugué à un fluorochrome.
• Fluorescéine et rhodamine, qui fluorescent
respectivement vert et rouge sont deux commun
conjugués.
IMMUNOESSAIS
IMMUNOFLUORESCENCE
• La préparation des cellules ou des tissus pour
immunofluorescence est une étape cruciale ça dépend sur le
type de cellules analysées et sur le application
• La procédure de fixation ne doit pas affecter la capacité de
l'anticorps à reconnaître l'antigène.
• Biologique solvants, tels que l'éthanol, le méthanol et l'acétone,
ou le paraformaldéhyde sont régulièrement utilisé.
• Glutaraldéhyde n'est pas un bon fixateur puisque les liaisons
formées par le réticulation de glutaraldéhyde présentent une
forte fluorescence endogène.
• Fixation aussi perméabilise la cellule donc que l'anticorps a
accès aux structures cellulaires internes.
• le la perméabilité peut être amélioré par traitement avec un
détergent après la fixation
IMMUNOESSAIS
IMMUNOFLUORESCENCE
Autre méthodes
• IMMUNOBLOTTE
• MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE
IMMUNOGOLD
• ELISA (ET RIA)
• DIRECT VS. INDIRECT
• HYBRIDATION ET BLOTTING TECHNIQUES
• CHAÎNE POLYMÉRASE RÉACTION
• ADN SÉQUENCE
• ÉLECTROPHORÈSE
M
er
ci

Celll Culture Master2 Lecture BIO UdM

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CULTURE CELLULAIRE

Simon N. FEWOU, PhD

• Cet environnement consiste généralement en un récipient de culture en

• Lorsque les cellules sont retirées des fragments d'organes, perturbant

Culture cellulaire primaire

Lignées cellulaires établies ou continues

Gentamycine et Thapsigargin Possible Tératogènes

• Ne pas manger, boire ou fumer dans ces domaines

• N'utilisez pas de téléphone portable

• Portez un blouse de laboratoire à tout moment, que ce soit

T-25 25 5 - 10 2,5 x 106

* Dépend de la lignée cellulaire. Basé sur une densité de 1 × 10 ⁵ cellules / cm².

La description Zone de croissance Travail recommandé Rendement

35 8 1-2 0,8 x 106

* Dépend de la lignée cellulaire. Basé sur une densité de 1 × 10 ⁵ cellules / cm².

• Les protocoles doivent être suivis pour éviter la

• Les explants doivent être exempts de contamination.

• La manipulation doit être effectuée dans des conditions

• Les explants humains ne doivent être recueillis qu'après

• Il existe deux méthodes de base

• Tel que : Élastase & Dnase pour isolement de

• Il existe d'autres enzymes non mammifères,

Trypsine et pronase donnent la désagrégation la plus

Collagénase et dispase, d'autre part, donnent une

• Centrifuger le flacon pour 5 minutes à 1000 tr / min à température

• Re-suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet avec 20% de

• Changer de support comme Couleur changements, utilisez 20% de FBS

• Ajouter assez de trypsine / EDTA pour couvrir monocouche

• Incuber la plaque à 37 C pour 1-2 minutes

• Robinet le navire sur les côtés pour déloger le cellules

• Ajouter milieu complet pour dissocier et déloger le cellules

• Avec l'aide de pipettes qui sont restées à être adhérent

• Ajouter le support complet dépend du sous-culture

• Exigence soit à flacon de 75 cm ou 175 cm

= 0,50 x 106 cellules

• Comme trypan le colorant bleu est perméable aux cellules

• Colorez les cellules avec trypan teindre et charger

• Milieux de croissance (pH, pression osmotique, O2 et

• Les milieux utilisés pour la culture des tissus doivent

 Hormones pour la croissance cellulaire

 Pression osmotique de la culture

• le utilisation courante de antibiotiques n'est généralement pas

b. Milieux à sérum réduit

c. Milieux sans sérum

• Contient acides aminés, vitamines, sels inorganiques,

et un source de carbone comme le glucose.

• Formulations de milieux basaux doit être en outre

complété par sérum.

 Milieux à sérum réduit

• Basal formulations de milieux enrichis en nutriments et

en facteurs d'origine animale avec quantité réduite de

 Médias sans sérum

• Le milieu sans sérum associé à des facteurs de

• Une centrifugeuse, de préférence capable de réfrigération

• Tout matériel requis pour la procédure doit être décontaminé de la même

• Les mains gantées doivent être aspergées de

• De même, il existe de nombreux fournisseurs de articles en plastique

• cellules qui semblent aplaties et de forme

• Organismes libres, particules de poussière ou

Cabinet Écoulement laminaire

Filtres HEPA Laminaire

• Milieux et réactifs stériles

• Évite la contamination aérienne des solutions