CULTURES IN VITRO VEGETALES

Pourquoi ?

- Les producteurs recherchent sans cesse de nouvelles plantes « idéales » leur

permettant des meilleurs rendements, en vendant mieux le produit mais à un
coût moindre.
- Ce sont les biotechnologies qui permettent par le biais de la culture in vitro de créer,
d’améliorer ou de multiplier une plantule ou semence car de façon « classique », il
faudrait compter de 8 à 15 ans selon l'espèce.
- C'est très long, d'autant que les objectifs de sélection peuvent évoluer avec le temps:
goût du consommateur, contraintes industrielles, etc.

APPLICATIONS

De nombreuses variétés de plantes horticoles et maraîchères de grand intérêt, anciennes ou

nouvelles, ont été sauvées de la menace de disparition

On a créé des banques de conservation , par culture in vitro, des variétés anciennes et
menacées de disparition. C'est un moyen de sauvegarder la biodiversité des espèces
sauvages et les espèces rares ou difficiles à multiplier naturellement (peu de graines ou de
rejets).

Enfin, les cultures in vitro permettent de mettre plus rapidement sur le marché les plants
certifiés, ou encore d'assainir des collections.

DEFINITION :
 Les cultures in vitro végétales sont des cultures d' explants de plantes, sur un milieu
synthétique, dans des conditions stériles, dans un environnement contrôlé et dans un espace
réduit.
 Les explants peuvent être des parties d'organes ou des organes entiers, (tige, feuille,
racine, fleurs, etc.), des tissus, des pièces florales, des graines ou des embryons, des
bourgeons ou des apex ou des méristèmes, des cellules somatiques ou sexuelles, des
protoplastes. Le choix de l'explant sera en fonction de la technique utilisée, de l'objectif et
de l'espèce travaillée.

 Le milieu synthétique est adapté dans sa composition à la technique, l'explant, l'objectif et

l'espèce. Il est en général composé d'eau, de macro et de micro-éléments, (sels minéraux), de
substances de croissance: phytohormones et vitamines, de sucre et d'un agent gélifiant
pour les milieux solides. Le pH est ajusté le plus souvent entre 5 et 6. On modifie le milieu
au cours des différentes étapes de production, on doit utiliser un milieu neuf toutes les 3 ou 4
semaines en général.

 Les conditions stériles sont obtenues par une désinfection des explants, une stérilisation
du milieu de culture et des flacons ou tubes de culture. Les différentes opérations de mise
en culture sont réalisées dans un environnement stérile:
 Les conditions stériles sont primordiales à obtenir afin qu'aucun champignon ou bactérie
ne vienne coloniser les milieux de culture, très favorables à leur prolifération, sous peine de
nécrose de l'explant.
 L'environnement contrôlé concerne notamment deux paramètres: la température de
culture, et l'éclairement: intensité et longueur du jour. Ils sont obtenus artificiellement. Leurs
valeurs dépendent de l'espèce travaillée ainsi que de la technique utilisée.

LE MILIEU DE CULTURE
Entreront dans la composition du milieu de culture, des éléments minéraux ainsi
que des éléments organiques et éventuellement des régulateurs de croissance
(hormones).

Tout d’abord, l’explant doit être le plus sain possible pour que la plante
pousse sans facteur limitant et ne soit pas malade. Il doit être stérilisé pour éviter
toute contamination.

Un milieu de culture adéquat stérilisé est également nécessaire. Celui-ci est

très important car ce sera le milieu de vie de la plante. Le plus utilisé est le milieu
Murashige et Skoog (MS). Il est utilisable pour toutes les cultures in vitro. Il doit
répondre aux besoins essentiels de l’explant qui y sera repiqué et permettra à
celui-ci de se développer.

A) LES ÉLÉMENTS MINÉRAUX :

 1- Les macroéléments : Les macroéléments : Ce sont des éléments présents

en grande quantité tels que l’azote, l’hydrogène ou encore le calcium et le
chlorure. Le phosphore (P) est utilisé par la plante. Chaque macroélément à un
rôle particulier pour le développement de la plante comme par exemple le
calcium qui permet la solidité de la paroi pectocellulosique*.

 2- Les microéléments: Ce sont des oligoéléments présents en petite quantité

utilisés dans des réactions chimiques telles que l’oxydoréduction*. Ils servent
aussi de catalyseurs*.

:
Les principaux d'entre eux sont le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le
manganèse (Mn), le molybdène (Mo), le bore (B) et le chlore (Cl), le cobalt
(Co), le nickel (Ni), etc...

B) LES ÉLÉMENTS ORGANIQUES :

1- Les sucres :
Dans le cas de tissus végétaux placés en culture in vitro, l'assimilation
 chlorophyllienne est nulle ou insuffisante pour assurer la survie et le
développement de l'explant.
Dès lors, on ajoute des sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de
culture pour fournir à l'explant une source de carbone. Dans la nature, les sucres
sont photosynthétisés à partir du gaz carbonique atmosphérique et de l'eau du
sol.
2- Les vitamines :
L'emploi de diverses vitamines favorise fréquemment le développement des
cultures in vitro .
Ce sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles
sont particulièrement utiles en micro propagation lorsque seul un fragment de la
plante est utilisé pour générer une plante entière

 L’agar-agar : C’est une gélatine à base d'algues qui permet de solidifier le

 L’eau et un pH légèrement acide pour éviter la croissance des micro-

organismes et permet l’absorption des nutriments. (5.2~5.8)

3- Les acides aminés :

Il a parfois été observé que l'apport d'acides aminés favorisait la prolifération.
C) LES RÉGULATEURS DE CROISSANCE.
Appelés généralement hormones végétales, ils induisent les phénomènes de
croissance et de néoformation des organes.
On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes les plantes;
cependant, on a pu synthétiser artificiellement des molécules possédant les
mêmes propriétés.
Les hormones utilisées sont principalement :
- les auxines,
- les cytokinines,
Ces hormones sont capables d’orienter les explants vers la formation de
nouveaux organes.
Les milieux ainsi constitués sont liquides. Il est nécessaire de les solidifier par

L’auxine :

 Stimule la croissance
 Régule la division et différenciation cellulaire
 Favorise la rhizogenèse* et l’élongation cellulaire

Les cytokinines :
 Stimule la division cellulaire
 Favorise la croissance cellulaire
 Régule la différenciation cellulaire (bourgeons et racines)
 Active de la production de
chlorophylle
 Inhibe la sénescence* des feuilles

Le développement des différentes parties d’une plante en culture in vitro est

lié aux concentrations en auxine et cytokinine. Ceci est appelé la balance
hormonale. Si les concentrations d’auxine sont plus élevées que celles de la
cytokinine, cela va favoriser la rhizogénèse (racines). En revanche, si les
concentrations d’auxine sont moins élevées que celle de la cytokinine, l’explant va
évoluer vers une fonction caulogène* (bourgeons). Enfin, si les concentrations en
auxine et en cytokinine sont équivalentes, l’explant a un comportement
calogène* (cal).

Le développement du végétal est influencé par la répartition des facteurs de croissance

et les conditions du milieu de culture. En général :
Quand le rapport Auxines/Cytokinines >1, la rhizogénèse est stimulée.
Quand le rapport Auxines/Cytokinines <1, le bourgeonnement est stimulé.

1. Constitution du milieu de culture

Tout d’abord, l’explant doit être le plus sain possible pour que la plante
pousse sans facteur limitant et ne soit pas malade. Il doit être stérilisé pour éviter
toute contamination.

Un milieu de culture adéquat stérilisé est également nécessaire. Celui-ci est

très important car ce sera le milieu de vie de la plante. Le plus utilisé est le milieu
Murashige et Skoog (MS). Il est utilisable pour toutes les cultures in vitro. Il doit
répondre aux besoins essentiels de l’explant qui y sera repiqué et permettra à
celui-ci de se développer.
2. Conditions de travail

La culture in vitro nécessite des conditions d’asepsie. Tout le matériel

nécessaire doit être libéré de tous germes et micro-organismes. Pour cela on utilise
du matériel stérile comme des tubes en verre, scalpels ou boîtes de Pétri. Il est
aussi nécessaire de se laver régulièrement les mains avec de l’alcool. On doit
travailler sous hotte vertical à flux laminaire stérilisée au préalable avec de
l’alcool ou près d’un bec bunsen.

Pour stériliser le matériel on utilise un autoclave mais aussi un mini-four à billes à

250°C dans lequel on met les outils après chaque étape de la mise en culture. Une
fois que les explants sont placés dans leurs tubes stériles ils sont placés dans une
chambre de culture climatisée avec une température d’environ 22°C, une humidité
maintenue à 50-60% et une photopériode* de 16 heures de lumière et de 8 heures
d’obscurité.
 Les conditions stériles sont obtenues par une désinfectiondes explants,
une stérilisation du milieu de culture et des flacons ou tubes de culture . Les
différentes opérations de mise en culture sont réalisées dans un
environnement stérile obtenu par une hotte à flux laminaire horizontal: de l'air
stérile est propulsé vers le vitroculteur.

Les conditions stériles sont primordiales à obtenir afin

qu'aucun champignon ou bactérie ne viennent coloniser les milieux de
culture, très favorables à leur prolifération, sous peine de nécrose de
l'explant.

L'environnement contrôléconcerne notamment deux paramètres: la

températurede culture, et l'éclairement: intensité et longueur du jour. Ils sont
obtenus artificiellement. Leurs valeurs dépendent de l'espèce travaillée ainsi que
de la technique utilisée.

L'espace est réduit car les plantes sont miniaturisées, cultivées dans des
récipients tenant sur des étagères éclairées, ce qui permet d'avoir la possibilité
de replanter des hectares de terrain à partir de plants cultivés sur quelques
mètres carrés. On peut également conserver d'innombrables variétés à l'abri des
parasites et indéfiniment sur une petite surface au sol.

PRINCIPE DE BASE :

Les techniques de culture in vitro végétales utilisent la propriété de totipotence des cellules
végétales mise en évidence en 1902 par Haberlandt : en théorie il est possible de régénérer
une plante entière à partir de n'importe quelle cellule d'une plante donneuse.

En général il y a 4 étapes de culture:

- la mise en place des cultures (la plus délicate et difficile) ou initiation
- la multiplication
- l'enracinement ou rhizogénèse
- le sevrage ou acclimatation

I) Mise au point sur les méristèmes

1) Définition
 Le méristème est une zone conservant un caractère embryonnaire, indifférencié (ou peu
différencié), tout au long de la vie du végétal . Les cellules méristématiques subissent des
mitoses nombreuses et peuvent se différencier en tissus, organes (du moins les cellules
dérivées de ces méristèmes).
Les méristèmes se présentent sous différentes formes, en différents lieux de la plante et ont
des fonctions variées.

2) Présentation des différents méristèmes

- méristèmes primaires : situés à l’apex (extrémité) des « axes » et produisant une croissance
« primaire » en longueur ou hauteur des plantes et responsables de la mise en place des
nouveaux organes.
Les cellules de ces méristèmes présentent une petite taille, rapport nucléocytoplasmique élevé,
nucléoles de grande taille, organites peu structurés, vacuoles réduites, densité en ribosomes
élevée et parois minces.
- méristèmes secondaires responsables d’une croissance secondaire permettant
l’épaississement des organes (important pour les espèces ligneuses) : il s’agit du cambium (à
la périphérie des tiges et racines).

3) Approfondissement sur les méristèmes primaires

On distingue le méristème racinaire et le méristème caulinaire (tige):
a) méristème apical des racines formé durant l'embryogenèse. Il élabore les tissus de
la racine et la coiffe: il est uniquement histogène. Il ne produit pas d'organes latéraux
et n'est donc pas organogène. Les racines latérales se forment de manière endogène à
quelque distance de l'apex. L'ensemble des méristèmes racinaires édifie les organes
souterrains de la plante constituant le système racinaire.
b) méristème caulinaire
produit la majorité des organes aériens : feuilles, entrenoeuds (qui constituent la tige) ainsi
que les méristèmes axillaires situés à l'aisselle des feuilles. Il édifie également les structures
reproductrices : inflorescence et/ou fleur. Il possède donc de grandes capacités organogènes
et histogènes.
Selon leur position, on distingue différents types de méristèmes caulinaires.
 le méristème caulinaire apical est formé au cours de l'embryogenèse. Voir planche.
Il est stratifié en couches cellulaires superposées reconnues .

II) Culture des méristèmes

En 1950, les travaux de Limasset et Cornuet ont montré que les méristèmes étaient
indemnes de virus.
1) Technique
- Des boutures contenant un bourgeon végétatif sont prélevées sur les variétés à assainir, ces
explants sont
stérilisés puis disséqués stérilement sous hotte à flux laminaire (culture aseptique), sous une
loupe binoculaire,
afin d'extraire le méristème de l'apex (dôme apical sans feuilles), qui mesure 0,2-0,3 mm. Ce
méristème est
rapidement déposé dans un tube de culture contenant un gel nutritif. Progressivement, les
cellules vont se
diviser, des feuilles vont se former, au bout d'un mois, cette pousse devra être repiquée sur un
nouveau milieu
pour parfaire sa croissance, puis un mois plus tard il faudra multiplier ou cloner les pousses
afin d'obtenir le
nombre voulu de plantes saines.
- La technique peut être associée à de la thermothérapie: culture à température élevée, pour
favoriser
l'élimination des virus.
- Enfin, il faudra une étape complémentaire pour enraciner les futures plantes avant qu'elles
soient acclimatées
en serre pour finalement servir de pied-mère pour le prélèvement de boutures saines. mais
préalablement il
faudra vérifier que les plantes obtenues sont bien indemnes de virus, en leur faisant subir un
test
immunologique: test E.L.I.S.A. prouvant l'absence totale de particules virales.
- Une partie des plantes assainies peut être conservée au laboratoire, à l'abri des
pathogènes, afin de produire
régulièrement, à la demande du producteur et sans contingence de saison ou de surface, des
pieds mères sains,
sans repasser par la phase du méristème.

2) Objectif
 C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

La source des explants :

Mis a part tous les adjuvants que l’on peut apporter aux milieux de culture, l’origine des explants joue un role
considérable quant a leur réactivité in vitro. Il est d’abord important de distinguer les explants juvéniles des
explants adultes, les premiers étant systématiquement beaucoup plus réactifs in vitro.