1.

Introduction

- Présentation générale du sujet

- Importance et utilité de l'étude du milieu de culture des micro-organismes

2. Définitions et concepts de base

3. Composants d'un milieu de culture

4. Facteurs influençant la croissance des micro-organismes

5. Techniques de préparation et de stérilisation des milieux de culture

6. Exemples d'application et de types de milieux de culture spécifiques

7. Conclusion
1. Introduction

A. Présentation du sujet général

L'étude de milieu de culture des micro-organismes est un ensemble des processus

ayant pour objectif la description des différentes méthodes aboutissant à la
croissance, la survie, la nutrition et le développement de ces micro-organismes ,
permettant ainsi une étude aisé sur ces êtres microscopiques.

B. Importance et utilité de l'étude du milieu de culture des micro-organismes

Les milieux de culture servent de support pour la croissance de micro-organismes

(bactéries, levures et moisissures) en leur apportant les éléments essentiels à leur bon
développement.

Ils sont principalement utilisés en microbiologie alimentaire, dans les industries

agroalimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques mais aussi dans l’environnement, la
recherche et l’enseignement; Les milieux de culture peuvent être utilisés par des
techniciens de laboratoire, des techniciens préleveurs ou encore des opérateurs sur
chaîne de production.

2. Définitions et concepts de base

A. Milieu de culture

Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de bactéries, de

levures, de moisissures afin de permettre leur étude.

B. Micro-organisme

Les microorganismes, font référence à des organismes vivants de taille

microscopique qui sont principalement constitués d'une seule cellule.

C. Agar : L'agar est un polymère extrait d'algues marines utilisé comme agent
gélifiant dans les milieux de culture solides. Il permet de solidifier le milieu, ce
qui facilite l'isolement et la manipulation des colonies bactériennes.

D. Stérilité :en microbiologie, la stérilité désigne l'absence de tout micro-organisme

viable, y compris les bactéries, les virus, les champignons et les spores, dans un
environnement spécifique. Cela peut inclure des surfaces, des milieux de culture,
des instruments ou des produits pharmaceutiques.

E. Exigence du choix du milieu de culture : Pour permettre le développement des

microbes le milieu doit : contenir tous les aliments nécessaires en quantité
suffisante et en proportion relative convenable : le milieu doit être nutritif et équilibré.
 avoir un pH, une pression osmotique, une viscosité des caractéristiques
physicochimiques compatibles avec la vie microbienne. Comme les besoins
nutritionnels des microorganismes et les conditions de leurs développements sont
très variés il n'existe évidemment aucun milieu universel sur lequel tous les
microbes soient capables de se multiplier.Toutefois, certains milieux conviennent
au développement d'une grande variété de germes microbiens ; le choix de tels
milieux repose sur la connaissance de l'habitat naturel et de la physiologie
alimentaire du groupe de germes que l'on désire cultiver.

3. Composants d'un milieu de culture

Un milieu de culture est rendu sélectif pour une espèce microbienne lorsque sont seules
satisfaites les exigences nutritives et les conditions de développement particulières à
cette espèce Les principaux facteurs de sélection microbienne utilisés seuls ou en
association sont :

a. la température d’incubation

b. Le pH du milieu

c. La faculté d’utiliser une source nutritive déterminée (carbone, azote).

d. La résistance à l’action bactéricide d’un antiseptique ou d’un antibiotique

4. Facteurs influençant la croissance des micro-organismes

Un certains nombre de facteurs physique externes peuvent intervenir dans le développement

des microorganisme. La variation de certains entre eux (pH du milieu, la température, la
pression osmotique etc.…) peut accélérer, retarder, ou arrêter la croissance microbienne. Nous
étudions dans cette séance l’influence de la variation de température. Variation de la
températurePour chaque microorganisme, on définit une température optimale de croissance
pour laquelle le développement est maximal, une température minimale en deçà de laquelle
il n’y a plus de croissance et une température maximale au déla de laquelle le développement
est stoppé.

A. Acidité (pH)

Chaque espèce se développe dans une certaine gamme de pH et a un pH optimal pour sa

croissance. En fonction du pH optimal, les micro-organismes peuvent être classés comme suit :

– Acidophile : plage de croissance approximative entre 0 et 5,5 pH.

– Neutrophiles : fourchette approximative entre 5’5-8.

– Alcalophiles : fourchette approximative entre 8 et 11’5.

Tous les microbes ont un pH minimum et maximum de développement. Une façon d’arrêter
leur développement est de l’élever ou de l’abaisser.

En général, les bactéries sont celles qui se développent le mieux à un pH proche de la neutralité
; cependant, la plupart des levures se développent à un pH plus acide (entre 4,0 et 4,5). Les
moisissures, quant à elles, se développent dans une gamme de pH plus large, ce qui explique
leur présence dans la plupart des aliments.

B. Température

La plupart des micro-organismes dans les aliments se développent à des températures

comprises entre 5ºC et 60ºC.

Chaque microbe ne se développe qu’entre une température minimale et une température

maximale, la température de croissance optimale (celle à laquelle le taux de croissance est le
plus élevé) étant proche de la température maximale.

Les microbes sont classés comme « psychrophiles », ceux dont la température optimale se
situe autour de 15ºC ; « mésophiles », dont la température optimale se situe entre 20 et 40ºC
et thermophiles, dont la température optimale se situe autour de 55ºC.

C. Humidité

La plupart des micro-organismes ont besoin d’eau à l’intérieur du bocal pour se développer.

L’attaque de micro-organismes est la principale cause d’altération et leur croissance est liée à la
quantité d’eau contenue dans les aliments.

L’activité de l’eau (aw) est la quantité d’eau libre dans l’aliment, c’est-à-dire l’eau disponible
dans l’aliment pour la croissance des micro-organismes. Il a une valeur maximale de 1 et une
valeur minimale de 0. Plus cette valeur est faible, plus le produit se conserve bien. L’activité
de l’eau est liée à la texture de l’aliment : plus l’activité est élevée, plus la texture est juteuse
et tendre ; cependant, le produit s’altère plus facilement et il faut faire plus attention.

En général, les bactéries ont besoin d’une plus grande activité de l’eau pour se développer que
les levures et les moisissures.

D. Alimentation

Les micro-organismes ont besoin de nutriments pour se développer, notamment de

protéines et de glucides.

Bien qu’il faille noter que chaque micro-organisme a des besoins nutritionnels
spécifiques, il existe des espèces qui, étant peu exigeantes, peuvent se développer sur
une grande variété de substrats et d’autres, au contraire, ont besoin de vitamines,
d’acides aminés, etc. pour croître et se développer.
 E. Oxygène

Tous les micro-organismes n’ont pas besoin d’oxygène, mais beaucoup d’autres en ont
besoin.

1 - Les bactéries aérobies strictes ne se développent qu'en présence d'air. Leur source
principale d'énergie est la respiration. L'oxygène moléculaire, ultime accepteur d'électron,
est réduit en eau (Pseudomonas, Acinetobacter, Neisseria).

2 - Les bactéries microaérophiles se développent mieux ou exclusivement lorsque la

pression partielle d'oxygène est inférieure à celle de l'air (Campylobacter,
Mycobacteriaceae).

3 - Les bactéries aéro-anaérobies facultatives se développent avec ou sans air. C'est le cas de
la majorité des bactéries rencontrées en pathologie médicale : les entérobactéries
(Escherichia, Salmonella), les streptocoques, les staphylocoques. L'énergie provient de
l'oxydation des substrats et de la voie fermentaire.

4 - Les bactéries anaérobies strictes ne se développent qu'en absence totale ou presque

d'oxygène qui est le plus souvent toxique. Ces bactéries doivent se cultiver sous
atmosphère réductrice. La totalité de l'énergie est produite par fermentation.

C'est le cas des bactéries intestinales (Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium) et de

nombreuses bactéries présentes dans les flores normales de l'organisme. La toxicité de
l'oxygène s'explique par la production de radicaux superoxydes que les bactéries anaérobies
ne peuvent pas détruire (absence de superoxyde dismutase) et/ou par l'absence d'une activité
enzymatique à type de catalases et de peroxydases.

Mode d'action de la superoxide dismutase, de la catalase et de la peroxydase

Exemple : Etuve avec culture de bactéries anaérobies stricts en jarre Autre exemple : culture
de bactéries anaérobies stricts en sachet plastique et en atmosphère contrôlée.

Autres facteurs de croissance

L'incorporation de facteurs de croissance est utilisée pour enrichir les milieux de culture pour
réussir la culture des micro-organisme exigeants. Le plus souvent, des mélanges de facteurs de
croissance sont utilisés dans les milieux microbiologiques :

Ezoic

Hydrolysats : ce sont des peptones obtenues par une action inorganique (Acide chlorhydrique)
sur des protéines. Exemple : hydrolysat acide de caséine.

Extraits de levures : L'extrait autolytique de levure est considéré comme le principal facteur
d'enrichissement des milieux de culture.Elle est préparé sous forme d'extrait hydrosoluble de
cellules de levure Saccharomyces cerevisiae autolysées. Au cours de l'autolyse, les enzymes
digestives endogènes des levures décomposent la teneur en protéines. De plus, l'extrait de
levure fournit une source essentielle de vitamines du complexe B hydrosolubles, de glucides et
d'acide glutamque libre.

En raison de sa teneur en glucides, il ne doit pas être utilisé dans les milieux destinés à
l'étude des fermentations sucrées.

Produits biologiques : De nombreux milieux, en particulier ceux utilisés en laboratoire clinique,

contiennent des produits biologique qui servent de nutriments essentiels pour les micro-
organismes exigeants.

Exemple : Sang ou des composants sanguins, oeufs, lait de vache écrémé, sérum de cheval ou
de bœuf .

La sélectivité : Les milieux de culture peuvent contenir des composants sélectifs qui inhibent la
croissance de micro-organismes non ciblés. Ces milieux sont particulièrement utilisés pour
l'isolement de micro-organismes spécifiques à partir de populations mixtes.

Plusieurs techniques sont utilisées pour rendre le milieux sélective :

En ajoutant un composant toxique : sels biliaires, le sélénite, des concentrations élevées de

chlorure.

En ajoutant d'antibiotiques : le cycloheximide, la gentamicine, l'acide nalidixique, la

vancomycine. En utilisant une seule source d’énergie.

La différenciation : Les milieux différentiels permettent de distinguer un type de micro-

organisme d'un autre se développant sur le même milieu. ils contiennent des composés qui
permettent de distinguer visuellement des groupes de micro-organismes par l'apparence de la
colonie ou du milieu environnant, Ezoic

Certains milieux comprennent des indicateurs qui permettent la détection visuelle des
changements suite à la production d'acide à partir de divers glucides et d'autres sources de
carbone ou sur la décarboxylation d'acides aminés.

D'autre milieux comprennent des colorants chromogéniques qui changent de couleur lorsque
des réactions enzymatiques spécifiques se produisent.

5. Gélose ou Agar-agar

C’est un extrait d’algues rouges (rhodophycées) appartenant aux genres Gelidium et Gracilaria,
récoltées dans les mers du Japon ou de Nouvelle-Zélande.

Chimiquement, la gélose est un mélange de deux groupes de polysaccharides dont l’un,

dominant, est l’agarose : peu ou pas sulfaté, il a une propriété gélifiante.
La gélose se dissout dans l’eau vers 90°C, reste en surfusion jusqu’à 45°C ; puis à température
basse, elle forme un gel transparent plus ou moins solide selon sa concentration dans l’eau.
Elle n’est pas dégradée généralement par les micro-organismes (sauf rares bactéries et
champignons).

Pour plus d'informations sur la gélose (Agar-agar) Ezoic

6. Exemples d'application et de types de milieux de culture spécifiques

Il existe une grande variété de milieux de culture , selon leur composition chimique, leur nature
physique, leur utilisation ou la méthode de préparation, les milieux de culture peuvent être
classés en plusieurs groupes Classification des milieux de culture.

Classification des milieux de culture

◉ . Classification des milieux de culture selon leur composition chimique

1. Milieu de culture empirique / Complexe / indéfini

De composition connue seulement avec approximation , le milieu empirique contient des

ingrédients complexes, tels que l'extrait de levure ou l'hydrolysat de caséine, dans des
proportions inconnues.

Exemple : Bouillon LB, gélose Columbia , gélose Gassner, gélose Tryptycase soja

Ezoic

2. Milieu de culture synthétique / défini

Composition exactement connue, qualitativement et quantativement. Ce sont des milieux

chimiquement définis préparés à partir de substances chimiques pures. Un milieu
synthétiques est entièrement exempt de composants d'origine animale (y compris les
composants d'origine microbienne tels que l'extrait de levure). Ces milieux sont très utiles pour
étudier la physiologie, la nature métabolique et les besoins nutritionnels des bacteries.

Exemple : Gélose citrate de Simons , milieu de glucose minéral.

◉ . Classification des milieux de culture selon leur nature physique

1. Milieu de culture liquide

L'agar n'est pas ajouté lors de la préparation du milieu, la croissance se traduit par un
trouble, un dépôt ou une voile superficielle. La présence de plus d'un type de bactéries ne
peut pas être détectée et les cultures mixtes ne peuvent pas être séparés.

Exemple : bouillon nutritif, bouillon trypticase soja.

2. Milieu de culture semi-solide

Contenant 0.5-0.75 % d’agar de consistance molle, il est utilisé pour démontrer la motilité
bactérienne.

Exemple: Milieu mannitol mobilité.

3. Milieu de culture solide

On obtient un milieu solide en ajoutant un agent gélifiant, "l’agar-agar" ou gélose, à un milieu

liquide. Il permet l'identification des bactéries en étudiant les caractères des colonies
(morphologie, pigmentation, l'hémolyse...) et Les cultures mixtes peuvent être séparées.

Exemple: Gélose nutritive, Gélose trypticase soja, Gélose Cled.

4. Milieu de culture biphasiques

Le milieu contient à la fois une partie solide et une partie liquide dans une seule bouteille.
L'inoculum est ajouté au milieu liquide et lorsque des sous-cultures doivent être faites, la
bouteille est simplement inclinée pour permettre au liquide de s'écouler sur le milieu solide.

Exemple: Flacon de Castaneda, système biphasique Middlebrook (gélose inclinée Middlebrook

7H11 + bouillon Middlebrook 9H).

◉Classification des milieux de culture selon leur utilisation

1. Milieu de culture simple

Les milieux de cultures simple, base, sont ceux qui peuvent être utilisés pour la culture de
bactéries non exigeantes. Généralement utilisé dans le diagnostic de routine en laboratoire pour
l'isolement primaire des bactéries. Ce type de milieu peut être rendu plus riche, par l'ajout de
supplements, ou sélective, par l'ajout de concentrations variables de chlorure de sodium.

Exemple: Bouillon nutritif, gélose nutritive et eau peptonée

2. Milieu de culture enrichi

Ce sont des milieux utilisés pour l'obtention des bactéries dites « exigeantes » en y ajoutant de
suppléments sous forme de sang, de sérum, de jaune d'œuf, etc.

Exemple: Gélose au sang frais, gélose au sang cuit.

3. Milieu sélectif et milieu d'enrichissement

Un milieu sélectif est formulé pour inhiber la croissance de certaines espèces bactériennes. Ces
milieux peuvent être formulés en ajoutant des réactifs sélectifs supplémentaires, tels qu'une
concentration saline élevée pour sélectionner les halophiles, éosine-bleu de méthylène toxique
pour les bactéries Gram-positives.

Exemple: Gélose EMB, gélose MacConkey.

Un milieu d'enrichissement permet également la croissance d'espèces bactériennes spécifiques,
cependant, les milieux d'enrichissement sont complétés par un réactif qui permet, plutôt qu'il
n'inhibe, la croissance d'une espèce particulière.

Exemple: Bouillon Sélénite F (sélénite est un inhibiteur pour les coliformes et bénéfique pour la
récupération des espèces de Salmonella), gélose Thayer Martin.

4. Milieu différentiel

Le milieu de culture dit « différentiel » ou « indicateur » permet de distinguer deux types de

microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu utilise les
caractéristiques biochimiques d'un micro-organisme se développant en présence de nutriments
et/ou d'indicateurs spécifiques (tels que le rouge neutre ou le bleu de méthylène) ajoutés au
milieu pour indiquer visiblement les caractéristiques déterminantes d'un micro-organisme.

Exemple: Gélose MacConkey (Par la fermentation du lactose), gélose chapman (par la

fermentation du mannitol).

5. Milieu de transport

Ces milieux sont utilisés lorsque les spécimens ne peuvent pas être cultivés peu de temps
après le prélèvement. Les milieux de transport empêchent le dessèchement de l'échantillon et
inhibent la prolifération de bactéries indésirables.

Exemple: Gélose Cary-Blair, écouvillons de transport gélosés amiès.

6. Milieu anaérobie

Les bactéries anaérobies ont besoin d'un potentiel d'oxydo-réduction réduit et de nutriments
supplémentaires. De tels milieux peuvent être réduits par des moyens physiques ou chimiques.

Exemple: La gélose anaérobie Schaedler, gélose Wilkins-Chalgren.

◉Classification des milieux de culture selon la méthode de préparation

1. Milieu prêt à l'emploi

Milieu de culture prêt à l'emploi est un milieu solide ou liquide fourni en boites, flacons, tubes
ou autres récipients, sous forme prête à l'emploi ou prête à l'emploi après refusion et
supplémentation.

2. Milieu préparé à partir de formulations déshydratées

Un milieu de culture est un milieu sous forme sèche qui nécessite une réhydratation et
un traitement avant utilisation, aboutissant soit à un milieu complet, soit à un milieu
incomplet auquel des suppléments sont ajoutés avant utilisation.
Ezoic

◉Gélose nutritive ordinaire

Relativement simplifiée, la formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la

croissance d’une grande variété de germes non exigeants,Il est recommandé par
l’American Health Association pour la numération des bactéries dans les eaux.

La gélose nutritive est dépourvu d'indicateur, d'agent sélectif, d'ingrédients différentiels et de

substances enrichissantes, donc utilise pour une meilleure expression de la pigmentation, test
biochimique et même pour le sérotypage.

Gélose nutritive ordinaire

Serratia sur gélose nutritive

● Pour plus de détails sur la Gélose nutritive.

◉Gélose Mueller Hinton

La gélose Mueller–Hinton est un milieu solide standardisé recommandé pour l’étude de la

sensibilité des bactéries aux agents antimicrobiens par la méthode de diffusion ou de
dilution en gélose.

La standardisation du milieu de Mueller-Hinton est nécessaire pour obtenir des résultats

fiables au niveau de l'antibiogramme. Celle-ci concerne la composition du milieu avec des
concentrations limites de CaCl 2+, MgCl2+ et ZnCl2+.