Analyse microbiologique des aliments

I. Généralité :

Trois types de microorganismes sont conventionnellement recherchés, lors de l’analyse

microbiologique des denrées alimentaires. Il s’agit des microorganismes responsables de
l’altération, des microorganismes indicateurs de la contamination fécale et des
microorganismes pathogènes responsables de toxiinfections alimentaires. Donc l’objectif de
l’analyse bactériologique des aliments est le contrôle de la qualité hygiénique et marchande de
ces derniers.

1°/ Origine des micro-organismes dans les aliments :

Les aliments sont d’origine végétale et/ou animale : la flore normalement associée aux plantes
et aux animaux est donc potentiellement présente. De plus, un apport microbien exogène est
souvent inévitable (environnement, contact, manipulations, etc...).

a. Principales sources des microorganismes dans l’aliment [01, 04] :

La matière alimentaire brute est d'origine végétale ou animale et la flore qui lui est associée
est donc respectivement celle naturellement présente sur les plantes et les animaux.

Par ailleurs, de nombreux apports exogènes peuvent accroître la charge microbienne. La

contamination se fait par l'environnement (eau, air, sol), manipulateur : très fréquent ( les
main :staph et arosole :strepto et staph), parfois par un vecteur (insecte).

Les plantes secondairement à la contamination par l’environement

L’homme et les animaux peuvent agir comme moyen de dissémination (voie fécale).

Contamination industrielle et produits fermenté

2°/ Facteurs affectant le développement des micro-organismes [01, 04, IV] :

De nombreuses caractéristiques physicochimiques de l’aliment et de son environnement

conditionnent le développement des microorganismes.
 a. Facteurs intrinsèques (propres à l’aliment) :
 Structures biologiques : La présence d’enveloppes, coques, peaux etc. confère à
certains aliments une excellente protection contre la prolifération microbienne.
 Agents antimicrobiens naturellement présents dans l’aliment :

-Le lait frais : contient des lacténines et des facteurs anti-coliformes à activité limitée dans le
temps.

-L’œuf : contient du lysozyme actif sur des germes à Gram positif.

 Composition chimique de l’aliment :

Les microorganismes dangereux sont pour la plupart hétérotrophes chimio-organotrophes et

doivent donc trouver leur énergie dans les composants de l’aliment. Ils doivent aussi y trouver
de l’eau, une source d’azote, des minéraux et pour certains des vitamines et des facteurs de
croissance.

Plus la diversité de composition d’un aliment est grande (produits animaux tels que les
viandes et dérivés, le lait ...) et plus sa susceptibilité à servir de milieu de culture pour les
microorganismes est grande.

 Le pH :
La grande majorité des bactéries ont la capacité de se développer à un pH proche de la
neutralité. En fonction de leur pH optimum de croissance, on classe les microorganismes en
trois groupes :
o Bactéries acidophiles 1 < pHopt < 5,5 (ex : thiobacillus),
o Bactéries neutrophiles 5,5 < pHopt < 8 (ex : E.coli, Pseudomonas),
o Bactéries alcalophiles 8,5 < pHopt < 11,5 (ex : bacillus, microcystis).
Par rapport au pH, il est habituel de considérer deux groupes d’aliments :
- ceux dont le pH est inférieur à 4,5 (dans ce cas, les microorganismes dangereux ne se
multiplient généralement pas et Clostridium botulinum n’élabore pas sa toxine), et
- ceux dont le pH est supérieur à 4,5 (Dans les aliments dont le pH est compris entre 4,5
et 9,5, de nombreuses altérations sont susceptibles de se produire et la plupart des
bactéries pathogènes cultivent dans ces conditions).
Le pH de l’aliment favorisera d’autant mieux la prolifération qu’il sera voisin du pH
optimum de croissance.
  Activité de l’eau :

Les microorganismes ont besoin, pour se multiplier, d’eau disponible ; la disponibilité de

l’eau est caractérisée par son activité.
Les microorganismes capables de se développer dans des produits à faible a w sont qualifiés de
xérophiles.
L’aw varie entre 0 et 1 :
- Pour aw < 0,65, aucun microorganisme ne peut cultiver (ils peuvent survivre).
- Pour aw <0,85, aucun microorganisme pathogène ne peut cultiver exception faite de
certaines moisissures excrétrices de mycotoxines.
 Potentiel d’oxydo-réduction :
Les germes qui ont besoin d’oxygène pour se développer, agissent comme des réducteurs et
baissent le potentiel d’oxydoréduction.
Selon leur mode de respiration, les microorganismes sont soit :
- Aérobies stricts ; lorsqu’ils ne peuvent se développer qu’en présence d’oxygène
(Pseudomonas, Microcoques, moisissures),
- Anaérobies stricts ; lorsque leur développement ne peut se faire qu’en absence
d’oxygène (Clostridium),
- Aéro-anaérobies facultatifs ; lorsque leur développement peut se faire en présence ou
en absence d’oxygène (coliformes, staphylocoques),
- Micro-aérophiles ; lorsque leur développement ne nécessite qu’un taux faible
d’oxygène (Lactobacillus, Streptococcus).
b- Facteurs extrinsèques (externes à l’aliment) :

Les conditions de l’environnement : nature de l'atmosphère, humidité, température, etc.

 Température d’entreposage :

Les courbes de croissance (variations du nombre de germes en fonction du temps) sont

variables en fonction des germes, ce qui les fait classer en trois principales catégories :

1- les thermophiles : 45-80°c Certains thermophiles obligatoires ne peuvent se multiplier

qu’en dessus de 37°C (Lactobacillus
2- Les mésophiles : 15- 45°c La plupart des germes pathogènes font partie de cette
catégorie.
 3- Les cryophiles (psychrophiles ou psychrotrophes): ont une température optimale de
croissance voisine de 15°C.
Parmi les germes dangereux en microbiologie alimentaire capables de cultiver entre 0
et 10°C il faut citer : Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Bacillus cereus,
Yersinia enterocolytica, Vibrio parahaemolyticus.
 Humidité relative :

L’humidité relative du lieu d’entreposage influe à la fois sur l’activité de l’eau (HR% =
aw.100) de l’aliment (équilibre dynamique) et sur la croissance des microorganismes à la
surface de cet aliment.

humidité  => aw  =>  la croissance microbienne.

 Présence et concentration de gaz :

La notion d’atmosphère contrôlée est déjà ancienne. Une augmentation de la teneur en

anhydride carbonique (jusqu’à 10 %) et une diminution de la teneur en oxygène permettent
une meilleure conservation des fruits et légumes (4ème gamme) en retardant le
développement de certains microorganismes et plus particulièrement des moisissures.

Une atmosphère d’azote ou un conditionnement sous vide permet d’éviter des contaminations
par des microorganismes aérobies.

 Antimicrobiens produits au cours de la fabrication de l’aliment :

Il s’agit de substances qui sont soit bactériostatiques soit bactéricides (éthanol, les acides
lactique, acétique, citrique, tartrique, malique, etc.).

L’addition de composés antimicrobiens aux produits alimentaires (additifs) ou l’utilisation

d’agents antimicrobiens divers dans l’environnement de production des aliments (agents de
désinfection, de nettoyage, etc.) est réglementée et fait l’objet du cours suivant.

II. Analyse proprement dite :

1°/ Transport et échantillonnage :

1.1 Echantillonnage :

L’échantillonnage et le transport peuvent être réalisés par le client ou par le laboratoire. Lors
de l’échantillonnage, le préleveur veillera à obtenir un échantillon représentatif du lot et à ne
pas contaminer l’échantillon en le prélevant.
Pour une denrée alimentaire de même nature, l'échantillon doit être réparti, au moins, en cinq
(5) unités issues d'un même lot. ï Le laboratoire doit disposer d’environ 500g de produit, soit
5 fois 100g. Ces 100g peuvent être fournis par une ou plusieurs pièces. Ces prélèvements
doivent, respecter les règles d’asepsie et les règles de représentativité. Pour les conserves,
l'échantillon doit être réparti, au moins, en six (6) unités issues d'un même lot.

2.2 Transport :

- Ils doivent être amenés le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les
conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit dans leur emballage d’origine s’il
s’agit de produits finis ou dans des flacons ou récipients stériles s’il s’agit de produits en vrac
ou de prélèvements.

- Il ne faut pas congeler le produit car la congélation provoque une diminution plus ou moins
importante du nombre de germes qu’il contient. Exception faite pour le produit déjà congelé
dont il faut s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant son transport (ce produit peut
être gardé pendant un mois avant d’être analysé).

2°/ Réception et enregistrement des échantillons :

A son arrivée au laboratoire, l’échantillon sera accompagné de sa fiche qui englobe tous les
renseignement nécessaire (nature, date, heure, provenance du prélèvement, nom du préleveur,
analyses demandées, …).

 On effectue enregistrement (codification ) de l’échantillon avant son passage à la salle

de la prise d’essai.
- Le code est du type alphanumérique (exemple : D 220)
- Lettre indique la nature du produit alimentaire, L : Lait liquide, PDL : Poudre de lait,
C : Conserve, V : Viande, D : Divers (jus, café,…), Le numéro indique le numéro de
prélèvement selon l’enregistrement.
3°/ Prise d’essai :
La prise d’essai destinée à la préparation de la suspension mère et des dilutions décimales
porte :
 Sur les parties superficielles et profondes, notamment pour les produits en tranches,
hachés et les plats cuisinés à l’avance.
  Sur la partie profonde après cautérisation de la surface du produit, notamment pour les
viandes (pièces), les volailles (pièces), les produits carnés (pièces) et les poissons
entiers ;
 Sur le produit homogénéisé ou sur les parties superficielles et profondes, selon la
nature du produit liquide ou semi-liquide, notamment les produits laitiers.
 Préparation de la suspension mère :
 Cas des produits solides : (Exemple : fromage, viande….).
- Peser dans un sachet stérile 25 gr du produit à analyser aseptiquement à l’aide d’une
balance analytique (Soit 5 gr de chaque unité si n= 5). Ces 25 gr vont être mis dans 225ml de
TSE ( Tryptone sel eau) pour l’isolement et le dénombrement des microorganismes à
l’exception des salmonelles et listéria.
La 1iere étape consiste à verser la moitié du bouillant d’enrichissement ou le diluant
dans le sachet stérile contenant le produit à analyser, broyer l’aliment 2 à 5 minutes dans un
broyeur type Stomacher.
- Après homogénéisation verser le contenu dans le flacon TSE. Cette étape permet
d’obtenir la solution mère 10-1 à partir de laquelle on va préparer les autres dilutions
décimales.
Pour la recherche de salmonelle et listéria on pèse 2×25 gr qu’on va les mettre respectivement
dans 225ml d’eau peptonée Tamponnée et 225ml du bouillant d’enrichissement Fraser
 Cas des produits liquides : (Exemple : lait pasteurisé, jus ….).
Pour la recherche des salmonelles et Listéria on prend 2 fois 25ml (5ml de chaque unité)
qu’on va les mettre dans 225ml d’EPT et 225ml du bouillant d’enrichissement Fraser.

Pour la recherche et le dénombrement des autres micro-organismes on travaille directement

sur le produit à analyser donc la suspension mère +1, à partir de laquelle on prépare des
dilutions décimales.

Req : ne pas oublier de codifier les flacons

III. Méthodes générales d’analyse des aliments

L’examen microscopique :

Ce dernier constitue une étude préliminaire souvent précieuse. Utilisé pour des applications
particulières ainsi que dans le cadre de certaines analyses quantitatives. Il est généralement
réalisé sur le prélèvement brut afin d'avoir une concentration suffisante en microorganismes.
 Cet examen peut s'effectuer à l'état frais ou sur un frottis fixé ou sur les deux

Les frottis sont colorés au bleu de méthylène ou de préférence par la coloration de Gram. Les
résultats de cet examen ne sont pas toujours très significatifs car la flore est très variable en
fonction de l'aliment.

Avantage :

L'examen microscopique peut être cependant utile dans les cas suivants :

 Mise en évidence d'une contamination dans une flore de fabrication.

 Estimation de la flore totale (viable et morte) ou de la charge microbienne initiale d'un
aliment ayant subi un traitement antimicrobien.
 Etude rapide de la composition relative et de l'évolution de la flore au cours de
fabrications.
 Numération directe des levures

Étude quantitative et qualitative :

 Détermination du NPP : Ensemencement en milieu de culture liquide

 Dénombrement après ensemencement : Incorporation en gélose nutritive /Étalement
en surface de gélose
1.9.1 Recherche et dénombrement des germes aérobie mésophiles totaux G.A.M :
a) Définition :

C’est l’ensemble des micro-organismes aptes à se multiplier à l’air et aux températures

moyennes, ceux dont la température optimale de croissance est entre 25° et 40°c.

- Ce sont des microorganismes capables d’altérer la qualité marchande de l’aliment.

Ils renseignent sur :

 La propreté des manipulations

 Les conditions de conservation
 La fraicheur du produit
 L’efficacité des procédés de traitement.
b) Principe : repose sur le dénombrement de la microflore aérobie développée sur un
milieu de culture approprié. Le milieu utilisé est la gélose PCA (PLATE COUNT
AGAR)
 c) Mode opératoire :
- Inoculer les boites de pétri avec 1 ml des différentes dilutions
- Déposer l’inoculum (1 ml) goutte à goutte sur toute la surface de la boite.
- Couler la gélose PCA (≈ 15 ml) refroidie (≈ 45°C).
- Mélanger avec des mouvements circulaires ou en 8 et laisser solidifier.
- Couler une deuxième couche de gélose blanche ≈ 5 ml.
- Laisser solidifier.
- Incuber les boites couvercle en bas 72 ± 3h à 30°C.
- Faire des Lecture toutes les 24h d’incubation.
d) Lecture et interprétation :

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires et de tête d’épingle qui poussent en masse et
noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre
15 et 300.

Retenir 2 dilutions successives (plus fortes dilutions) où le nombre de colonies dénombrées

soit : 15 ≤ c ≤ 300.

Σc
Appliquer cette formule : N=
Vml ×(n 1+0.1 n 2)×d

- N : nombre d’UFC par gramme ou par ml de produit initial ;

- Σc : sommes des colonies des boîtes interprétables ;
- Vml : volume de solution déposé (1 ml) ;
- n1 : nombre de boîtes considérées à la première dilution retenue ;
- n2: nombre de boîtes considérées à la seconde dilution retenue ;
- d: facteur de la première dilution retenue

1.9.2 Recherche et dénombrement des coliformes totaux, coliformes Thermotolérants

dans les denrées alimentaires :
a) Définition :
 Les coliformes totaux :

Ce sont des bacilles à Gram négatif, non sporulés, oxydase-, aérobies ou anaérobies
facultatifs ; capable de se multiplier en présence de sels biliaires ou d’autres agents de surface
 ayant des propriétés équivalentes, possédant l’enzyme ß- galactosidase permettant l’hydrolyse
du lactose à 37°C avec production de gaz.

Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Klebsiella et Serratia

 Les coliformes thermotolérants :

Ce sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose à une

température de 44°C.

Ils renseignent sur :

 La propreté des manipulations.
 L’efficacité des procédés de traitement (pasterisation)
 La propreté des locaux et du matériel.
b) Principe :

Basé sur la propriété des coliformes à fermenter le lactose avec production d’acide et
d’aldéhyde, avec ou sans production de gaz. La recherche se fait en milieu solide.

c) Mode opératoire :

Les milieux solides utilisés : gélose VRBL (gélose au cristal Violet et au Rouge neutre Biliée
Lactosée) OU Désoxycholate 1 ‰

Inoculer 2 séries de boites avec 1 ml des différentes dilutions.

 Déposer l’inoculum (1 ml) goutte à goutte sur toute la surface de la boite.

 Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45±1 °C.
 Incuber une série de boites pdt 24-48 h à 37°C pour la recherche des coliformes totaux et
l’autre série à 44 °C pour la recherche des coliformes thermo-tolérants.

d) Lecture et interprétation :
 Lecture des Boites incuber à 37°C ±1 pour le dénombrement des coliformes totaux :
-Dénombrer les colonies typiques et atypiques de couleur rouge qui poussent en masse, noter
la dilution correspondante.

Σc
N= /gr ou ml
1.1 ×d
∑ c : La somme des colonies typiques et atypiques identifiés

d : Le taux de la 1ère dilution retenue

NB : retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 10 et 150 de colonies typiques et

atypiques

 Lecture des Boite incuber à 44°C pour le dénombrement des coliformes

thermotolérants :

-Dénombrer les colonies de couleur rouge qui poussent en masse et noter la dilution
correspondante.

-Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 10 et 150.

Σc
N= /gr ou ml
1.1 ×d

∑c : Nombre de colonies de la 1ère dilution et de la 2ème dilution.

d : Le taux de dilution de la 1ère boite retenue .
N : Nombre de coliformes thermotolérants / gr ou ml.

Recherche et Dénombrement d’Escherichia Coli :

Repiquer 3 à 5 colonies caractéristiques sur le milieu Urée Indole. Incuber à 24 h à 37°C.

Lecture du milieu Urée Indole :

• Nbre d’E Coli par boite:

Formule : a = (b x c)/ A

b : Nombre de colonies caractéristiques indole +

c : Nombre total de colonies caractéristiques sur la boite.

A : Nombre de colonies caractéristiques repiqués.

a : Nombre d’Escherichia Coli identifiés par boite.

Retenir 2 dilutions successives (plus fortes dilutions) où le nombre de colonies dénombrées

soit : 10 ≤ c ≤ 150.
 Appliquer cette formule :

Nombre d’E coli /gr ou ml:

Σa
N=
1.1 ×d

Σa : Nombre d’Escherichia Coli identifiés.

d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N = nombre d’Escherichia coli /gr ou ml

A- En milieu liquide. (VBL + Cloche) :

 Test de présomption :
 Introduire 1ml des différentes dilutions dans chaque tube .
 Chasser le gaz présent dans les cloches avant l’incubation.

 Lecture des coliformes totaux à 37°C :

Aspect d’un tube de milieu VBL + cloche ‘positif’ :

- Un dégagement de gaz >1/10

- Un trouble microbien accompagne d’un virage du milieu au jaune (témoin de la fermentation
du lactose)
 Noter le nombre de tubes positifs à 37°C et se référer à la table de NPP.
 Test de confirmation :

 Repiquer chaque tube de milieu VBL (+) sur un autre tube de VBL et un tube d’Eau Peptonée
Exempt d’Indole.
 Chasser le gaz présent dans la cloche avant l’incubation.
 Incuber 24h à 44°C.
 voir acidification du milieu VBL et le dégagement de gaz dans la cloche.
 Ajouter le milieu Kovacs au tube d’Eau Peptonée Exempt d’Indole et voir la formation d’un
anneau rouge.

 Noter le nombre de tubes positifs pour chaque série de dilutions et se référer à la table de
NPP.

1.9.3 Recherche et dénombrement d’E.Coli :

a) Définition :
-Il s’agit là de coliformes thermotolérants qui produisent l’indole à partir du tryptophane à
44°C.

-La bactérie E. coli représente toutefois 80 à 90 % des coliformes thermotolérants détectés.

b) Principe :

Elle se fait en milieu solide par incorporation de gélose spécifique TBX (Le BCIG : acide 5-
bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucuronique), c’est un milieu chromogénique qui en présence
de β D-glucuronidase donne naissance à un substrat chromogène de couleur bleu (Le
dichloro-dibromo indigo), la présence d’E. Coli est révélée par l’apparition de colonie
caractéristique de couleur bleu.

c) Mode opératoire :
 Inoculer 1 série de boites avec 1 ml des différentes dilutions.
 Couler la gélose TBX ≈ 12 ml.
 Laisser se solidifier.
 Incuber 24h ±2h à 44°C ±1.
d) Lecture et interprétation :

-Dénombrer les colonies caractéristiques de couleur bleu

-Retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 10 et 150 de colonies.

Σc
∑ c : La somme des colonies caractéristiques. N= /gr ou ml
1.1 ×d
d : Le taux de la 1ère dilution retenue.

1.9.4 Recherche et dénombrement des Entérobactéries :

a) Définition : Ce sont des bacilles, Gram (-) , axydase (-), aérobie, anaérobie facultatif
fermentant le glucose .
b) Principe :

Basé sur la propriété des entérobactéries à fermenter le glucose, elle se fait en milieu solide
par incorporation en gélose VRBG (gélose au cristal Violet et au Rouge neutre Biliée
Glucosée).

c) Mode Opératoire :
 Inoculer des boites de pétri avec 1 ml des différentes dilutions.
  Déposer l’inoculum (1 ml) goutte à goutte sur toute la surface de la boite
 Couler une couche de gélose de VRBG ≈ 12 ml, refroidie à la température ≈ 45±1 °C
 Mélanger et laisser se solidifier
 Incuber 24h ±2h à 37°C ±1
d) Lecture et interprétation :

-Dénombrer les colonies caractéristiques de couleur rouge qui poussent en masse, noter la
dilution correspondante.
-Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 10 et 150.

Σc
N= /gr ou ml
1.1 ×d
∑ c : La somme des colonies caractéristiques.
d : Le taux de la 1ère dilution retenue.

II.2.2.3- Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux : [8]

Ils sont d’origine fécale, humaine ou animale et témoignent d’un nom respect des régles
d’hygiène
Ils renseignent sur :

 Hygiène du personnel
 La propreté des locaux et du matériel.

A- En milieu liquide :
 Le test présomptif :

 On ensemence les tubes de milieu ROTHE par 1 ml des différentes dilutions.

 Incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48H.
 Effectuer la lecture des tubes positifs (présentant un trouble microbien)
 Noter les tubes positifs.
 Le test confirmatif :
 Repiquer chaque tube positif de milieu ROTHE dans un tube de milieu LITSKY.
 Incuber à 37°C pendant 24.
 La lecture : la présence de Streptocoques fécaux se manifeste par l’apparition d’un trouble
microbien dans le milieu et/ou l’apparition d’une pastille violette ou blanchâtre au fond du
tube.
 On note le nombre de tubes positifs et on se rapporte à la table NPP pour obtenir le nombre de
germes présents dans 10 ml/g de notre denrée alimentaire.

B- En milieu solide :
 Inoculer les boites de pétri avec 1ml des différentes dilutions.
 Déposer l’inoculum goutte à goutte sur toute la surface des boites.
 Couler une couche de gélose BEA (bile, esculine, azide de sodium et citrate de fer
ammoniacal) ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45±1 °C.
 Incuber à 37°C pendant 24- 48h.
 Lecture : dénombrer les colonies de streptocoques fécaux apparaissent grises entouré, d’une
auréole noire (esculine +).
Recherche et dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs à 46°c : [9]

 Chauffer le produit à tester (l’inoculum) 10min à 80°C afin de détruire les formes végétatives
et d'activer les spores.
 Refroidir rapidement à l’eau de robinet.

 Cas des produits solides :

 Transférer 1 ml de l’inoculum (dilutions décimales ; 10-1 et 10-2) dans des tubes stériles, en
évitant au maximum d’incorporer de l’air. On utilise 2 tubes par dilution.

 Cas des produits liquides :

Transférer 5 ml de la suspension mère (+1) dans chacun des deux tubes stériles, en évitant au
maximum d’incorporer de l’air.
 Figure 21 : inoculation des tubes stériles
 Liquéfier le milieu en bain marie bouillonnant puis refroidir le milieu vers 45-47°C.
 Ajouter environ 15 ml de gélose Viande Foie additionnée d’une ampoule contenant 5 ml de
sulfite de sodium et une ampoule contenant 2 ml d’alun de fer.
 Homogénéiser parfaitement par retournement complet en évitant au maximum d’incorporer
de l’air.
 Refroidir dans un bain d’eau glacée ou laisser solidifier sur la paillasse.
 Incuber à 46°C pendant 48 heures.
 Lecture : compter les colonies entourées d’un halo noir qui poussent en profondeur. La taille
de la colonie doit être assez grande de 5 mm de diamètre. Les colonies ayant poussé à 1 cm de
la surface du tube sont éliminées.
 Noter les dilutions correspondantes.
On effectue des lectures après 18, 24 et 48h d’incubation

 Recherche et dénombrement de Clostridium perfringens :[10]

 Inoculer les boites de pétri avec 1ml des différentes dilutions.
 Couler la gélose TSC (tryptone sulfite cyclosérine) sur les boites, environ 15ml.
 Incuber 24h à 37°C en atmosphère riche en CO2.
 Dénombrer les colonies noir caractéristiques qui poussent en profondeur
 Confirmation :
 Ensemencer 3 colonies suspectes sur le bouillon thioglycolate.
 Incuber à 37°C pendant 24h en anaérobiose (milieu recouvert d’une de paraffine).
 Repiquer à partir de ce milieu 2 gouttes sur le bouillon lactose sulfite (LS) +cloche.
 Incuber à 46°C pendant 24h.
 Voir un dégagement de gaz dans la cloche et un précipité noir au fond du tube.

 Recherche de la neurotoxine botulique :

10g aliment broyé + 30 ml diluant (Na 2HPO4, gélatine, pH 6.8) incuber 10min à 22°C,
traitement par trypsine (1h à 37°C). Centrifuger. Sur le culot de centrifugation (recherche de
toxine après culture, enrichissement, et isolement de Clostridium perfringens ), surnageant de
centrifugation (filtration sur membrane 0.45 ųm : détermination du titre toxique par
inoculation à la souris voie IP 1ml/dilution, 2souris /dilution et identification du type toxique
en répartissant 2 ml dans 6 tubes + 0.1 ml sérum antibotulique A,B,C,D,E. Incuber 30min à
37°C, inoculer à 2 souris /tube (1ml voie IP) et voir la survie des animaux protégés par le
sérum spécifique du type) [10]

1.9.5 Recherche et dénombrement des staphylocoques à coagulase positive :

a) Définition :

Ce sont des microorganismes de forme sphérique, cocci Gram positif , halophiles c'est-à-dire
cultivent en présence de 5 % de NaCl ,catalase +.

b) Principe : Pour la recherche des staphylocoques à coagulase positive on utilise une

méthode dite par étalement en surface ( en râteau) c’est une méthode en milieu solide
qui utilise la gélose Baird Parker , c’est un milieu sélectif et riche en accélérateur de
croissance ( pyruvate de sodium et la glycine), ce milieu sera enrichi avec du jaune
d’œuf et le tellurite de potassium pour mettre en évidence l’action de la lécithinase et
la réduction du tellurite en tellure, ce qui donne naissance à l’aspect caractéristique des
colonies de staphylocoque coagulase+ : noir avec halo clair.

c) Mode opératoire :

- La 1iere étape est la préparation de la gélose Baird Parker a laquelle on rajoute 15ml
de la solution de jaune d’œuf au tellurite de potassium.
- Couler la gélose dans des boites de pétri et conserver à +4°C.
- Inoculer les boites avec 0,1 ml des différentes dilutions.
- Étaler les gouttes à l’aide d’une pipette pasteur stérile en râteau.
- Incuber les boites couvercle en bas 48h ±2h à 37°C ±1.
d) Lecture et interprétation :

Dénombrer les colonies caractéristiques et non caractéristiques et noter les dilutions

correspondantes.

Retenir 2 dilutions successives où le nombre total de ces colonies est compris entre 10 et 150
dans chaque boite.
- Les colonies caractéristiques : Staphylococcus aureus est caractérisé par la formation
de colonies noires (réduction du tellurite en tellure), brillantes, convexes, entourées
d’un halo d’éclaircissement du jaune d’œuf (2 à 5 mm de diamètre, correspondant à
 une protéolyse). À l’intérieur du halo, il peut apparaître une zone opaque due à l’action
d’une lécithinase.
- Les colonies non caractéristiques : Staphylococcus epidermidis est caractérisé par
l’apparition de colonies noires, brillantes, de forme irrégulière et une formation de
zones non transparentes autour des colonies après 24 heures.

e) Test de confirmation :

Pour confirmer qu’il s’agit bien de colonies de Staphylococcus aureus, effectuer des tests
biochimiques rapides (catalase et coagulase) sur 5 colonie caractéristique et 5 autre non
caractéristique pour deux boites de dilution successive ou le nombre de colonie est compris
entre 10 et 150.

C’est uniquement sur les colonies catalase positif on effectue le test coagulase, et on note le
nombre de colonie caractéristique et non caractéristique a catalase et coagulase positif.

 Teste catalase :

Prélever une moitié de la colonie et la déposer sur une lame propre, puis déposer sur cette
demi- colonie une goutte d’H2O2.

Dégagement des bulles gaz La bactérie est Catalase +.

 Teste coagulase :

La coagulase libre est une enzyme qui permet de catalyser la transformation du fibrinogène
(soluble) en fibrine (insoluble). La formation d’un coagulum attestera de la présence d’une
coagulase libre. Il suffit pour cela d’utiliser du plasma de lapin.

- La moitié de chaque colonie ayant la catalase positive est repiquée dans un bouillon
cœur cervelle (BHIB). Les tubes sont incubés 24h à 37°C.
- Mélanger 0.1 ml du bouillon BHIB avec 0,3 ml avec le plasma du lapin dans un tube
stérile et incuber les tubes à 37°C pendant 24h ou bien au bain marie 37°c pdt 30min.
Faire des lectures durant les 1 ères heures d’incubation et laisser 24h si le résultat est
négatif.
 Calcul du nombre de Staphylocoques à coagulase positive par boite :

c nc
b b
c nc
a= × c + × c
c nc
A A
 Ac = Nombre de colonies caractéristiques repiquées

Anc = Nombre de colonies non caractéristiques repiquées

bc = Nombre de colonies caractéristiques repiquées à coagulase +

bnc = Nombre de colonies non caractéristiques repiquées à coagulase +

cc = Nombre total de colonies caractéristiques par boite

cnc = Nombre total de colonies non caractéristiques par boite

 Calcul du nombre de Staphylocoques à coagulase positive par gr ou ml de produit:

∑a
N =
V x 1,1 x F

∑ a = a1 + a2 (a1 = nombre de staphylocoques à coagulase + de la 1ère dilution retenue et

a2 = nombre de staphylocoques à coagulase + de la 2ème dilution retenue).

F: taux de la 1ère dilution retenue

V: volume inoculé (0,1ml)

1.9.6 Recherche et Dénombrement des levures et moisissures :

a) Définition :

Micro-organismes capables de croître en conditions adverses (basse température, acidité,

faible humidité)

Les levures et moisissures sont des agents importants d’altération. Elles dégradent les denrées
fraiches (fruits et légumes), réfrigérées (produits de viande, fromages), sèches (charcuteries)
et acides (jus de fruits).

Les moisissures produisant des mycotoxines représentent un danger pour la santé du

consommateur.
 b) Principe :

L’ensemencement se fait en milieu solide par étalement en surface sur milieu Sabouraud, ce
milieu est rendu sélectif par addition de chloramphénicol ou de gentamicine.

c) Mode Opératoire :

-Ensemencer 0.1 ml des différentes dilutions à l’aide de pipettes pasteur stériles en râteau sur
le milieu Sabouraud.

-Il faut faire aussi un témoin milieu (milieu Sabouraud seul) et un témoin diluant (milieu
sabouraud ensemencer en râteau par 0.1 ml du diluant seul (TSE)).

-Incuber à température ambiante (22°C) sur la paillasse pendant 5jours couvercle en haut.

d) Lecture et interprétation :

Dénombrer les levures et moisissures et noter la dilution correspondante

Σc
N= /gr ou ml
V ×1.1 ×d
∑ c : La somme des colonies
d : Le taux de la 1ère dilution retenue.
V : Volume inoculer (0,1ml)

1.9.7 Recherche de salmonelle dans les denrées alimentaires :

a) Définition : Entérobactérie, bacilles à Gram négatif, Mobile (ciliature péritriche),
aéro-anaérobie facultatif, oxydase -, glucose +, Lactose – , responsable de toxi-
infection alimentaire.
b) Principe :

La recherche s’effectue selon le schéma suivant :

- Pré-enrichissement dans l’eau peptonée tamponnée
- Enrichissement dans SFB/DC (Sélénite F Broth)
- Isolement dans l’Hektoen
- Identification (TSI, gallerie biochimique….)
c) Mode opératoire :
 Pré-enrichissement :
  Cas de produit solide :
- Peser dans un sachet stérile 25 gr du produit à analyser aseptiquement.
- Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
- Broyer l’aliment
- Verser le contenu dans le flacon d’E.P. Tamponnée
 Cas de produit liquide :
- Prélever 25 ml de la Suspension mère (+1)
- Introduire dans 225 ml d’Eau Peptonée Tamponnée
- Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée Tamponnée à 37°c pdt 24h.

 Enrichissement :
A partir du pré-enrichissement on effectue un enrichissement sur bouillant SFB D/C.
- Dans des tubes contenant 10ml du bouillant SFB D/C additionnée 2disque d’additif
SFB au moyen d’une pince stérilisé.
- On rajoute 10ml du Flacon d’Eau Peptonée pré enrichie.
- Travailler toujours au près du bec benzen.
- Incuber pdt 24h à 37°c.
 Isolement :
C’est seulement à partir des tubes qui présente un virage vers le rouge brique qu’on va
faire l’isolement sur Hektoen.
- Prendre une goutte au moyen d’une anse de platine ou une pipette pasteur et la déposer
sur le bord de la gélose Hektoen
- Faire des stries serrées pour un meilleur isolement
- Incuber a 37°c pdt 24h.
 Lecture:
Colonies typiques (forte suspicion de salmonelle) :

Colonies ayant un contour régulier, transparente (verte sur Hektoen) avec ou sans centre noir
(H2S +).

 Identification:
 TSI: (triple sugar iron)
Il permet de mettre en évidence la fermentation du lactose, le glucose et le saccharose ainsi
que la production du gaz et l’H2S (hydrogène sulfuré).
  Emplois :
5 colonies typiques de Salmonelle sont ensemencées en stries centrale sur la pente puis en
piqure profonde sur le culot, porter les tubes à l’étuve à 37°c pdt 24h. après avoir vérifier que
les bouchons ne sont pas visés à fond afin de permettre une bonne oxygénation de la pente.
-La fermentation des 03 sucre se traduit par le virage au jaune, la production d’H2S par
noircissement et le dégagement de gaz par le décollement de la gélose ou l’apparition de bulle
d’air.

Lactose Glucose Saccharose H2S GAZ

S.Typhi _ + + + _
S.Paratyphi A _ + + _ +
Autres _ + + + +
Salmonelle

 Une mini-galerie classique : urée-indole, ONPG, TDA. LDC

Technique :
-Préparer la suspension bactérienne à partir des colonies du tube TSI dans de l’eau distillé
stérile,
-Prendre 2goutte de la suspension bactérienne et la mettre dans 1ml du LDC et faire la même
chose pour le temoin moeller.
-Mettre 1 ml de la suspension bactérienne dans un tube stérile et on rajoute un disque
d’ONPG.
-Dans un tube contenant environ 3ml du milieu urée-indole qu’on vas le charger avec des
colonies à partir du TSI.
-Incuber le tous à 37°c pdt 24h.
Lecture :
 Les salmonelles doivent être : urée -, TDA -, indole -, ONPG – (sauf S. arizonae),
LDC+
 Une API 20 E :
Après préparation de la suspension bactérienne on suit les étapes suivantes :
- Humidifier le support de la galerie API 20 E par l’eau distillé stérile.
 - Au moyen de la pipette pasteur prélever un certain volume de la suspension
bactérienne et on commence à remplir les cupules une a une, ceux qui sont encadré on
doit les remplir complètement par contre les autres seront remplis à moitié.
- Rajouter l’huile de vaseline aux paramètres souligner à fin d’éviter le départ des
substrats volatile.
- Incuber à 37°c pdt 24h.
- Au moyen d’un logiciel qui traite les résultats de la galerie API E on peut confirmer
s’il s’agit vraiment de salmonelle et quelle espèce qui est en cause.

1.9.8 Recherche de Listeria dans les denrées alimentaires :

a) Définition :

Les bactéries du genre Listeria sont des petits bacilles à Gram positif, à extrémités arrondies,
asporulés, non acido-alcoolo-résistant, mobiles à 20-25°C. Bactérie pathogène capable de
croître à 4°C (donc dans les denrées réfrigérées).
L. monocytogenes est surtout dangereuse pour les sujets fragiles (enfants, personnes âgées,
femmes enceintes). Provoque la listériose (méningites, septicémies, avortements) avec un taux
élevé de mortalité (30%).
b) Principe :

La recherche de listéria monocytogenes se fait en plusieurs étapes :

- Enrichissement primaire dans le bouillant Fraser demi en flacon.

- Enrichissement secondaire dans le bouillant Fraser demi en tube.
- Isolement sur gélose, Oxford, Palcam, milieu chromogénique pour listéria.
- Identification biochimique et sérologique.
c) Mode Opératoire :
 Etape 01 :
 Enrichissement primaire :
- Verser le bouillon Fraser dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser.
- Broyer l’aliment au stomacher.
- Verser le contenu dans le flacon fraser ½. (225ml du bouillant fraser)
- Incuber à 30°c pdt 18-24h.
 - Req : Le noircissement du bouillant d’enrichissement laisse suspecter la présence de
Listeria qui hydrolyse l’esculine à confirmer avec les autres étapes à fin d’éviter de
tomber dans des faux positifs.
 Etape 02 :
 Isolement primaire :
- A partir de l’enrichissement primaire faire un isolement sur la gélose oxford ou
palcam, incuber à 37°c pendant 24-48h.
 Enrichissement secondaire :
- Pour l’enrichissement secondaire on va mettre 0,1 ml de l’enrichissement primaire
dans un tube contenant 10ml du bouillant Fraser ½ (à 50% d’inhibiteur : acide
nalidixique et l’acryflavine) pour les produits faiblement chargés en bactérie tels que
le lait et produit laitiers et on utilise le Fraser complet (à 100% d’inhibiteur) dans le
cas des produits fortement chargés en germes tels que les viandes et les produits carné.
- Incuber de nouveau à 25°c pendant 24h.
 Etape 03 :
 Lecture des boites issues de l’isolement primaire :

Après 24-48 h d’incubation, forment sur gélose PALCAM des colonies d’environ 2 mm de
diamètre, de couleur gris-vert, avec un centre concave et un halo noir sur un fond rouge
cerise.

Sur la gélose Oxford, Listeria monocytogenes forme des colonies vert-olive entourées d’un
halo noir après 24h, après 48h, elles deviennent plus foncées avec un centre noir en creux et
sont entourées de zones noires (creuse la gélose après qlq jrs d’’incubation à la recherche de
substrat).

 Isolement secondaire :

A partir de l’enrichissement secondaire faire un isolement sur la gélose oxford, palcam, ou

milieu chromogènique pour Listéria, incuber à 37°c pendant 24-48h.

 Etape 04 : Lecture de boites isolé à partir de l’enrichissement IIaire

Aspect des colonies sur gélose palcam et oxford sont décrite précédement, pour leur aspect
sur le milieu chromogènique elle sont de couleur bleu à bleu-vert avec formation d’halo
opaque.
Les colonies présumées identifiées comme des L. monocytogenes doivent être confirmées par
des tests biochimiques et immunologiques
 Etape 05 : Identification
- Examen microscopique à l’état frais : Bacille minces, courte de mouvement rotatif
- Identification biochimique : Coloration gram, TSI, gallerie biochimique, test
mobilité ( mannitol- mobilité), test coagulase, test catalase.
- Mobilité +, Nitrate –, Glucose +, H2S –, Gaz-, Esculine +, Urée –, Indole-, TDA –VP
+, RM +
- Repiquage sur gélose au sang de mouton : Mise ne place des zones d’hémolyse
spécifique à listéria monocytogenes.
- Identification immunologique : Recherche d’antigène flagellaire et pariétal
- PCR : C’est une méthode sensible, rapide et spécifique qui vise à rechercher les gènes
par hybridation et révélation.
- Elisa : Basé sur l’utilisation des anticorps monoclonaux anti-Listéria
d) Lecture et interprétation :

L’analyse a pour objectif d’assurer l’absence de L. monocytogenes dans tous les aliments de
type « Ready-To-Eat » où le pathogène pourrait se multiplier. Pour les « Ready-To-Eat » dans
lesquels Listeria ne sait pas pousser (trop secs ou trop acides) : dénombrer le pathogène pour
assurer que l’on ne dépasse pas la dose minimale infectieuse (100 CFU/g).
 Denrées de type «Ready-To-Eat » :<100 L. monocytogenes/g au moment de la
consommation
- Si ce niveau (100 CFU/g) ne peut être garanti, car le pathogène est capable de pousser
dans l’aliment, le critère est : absence dans 25g.
- Notification obligatoire en cas de résultat positif.
1.9.9 Recherche de Chronobacter sakazakii :
a) Définition :

C’est une bactérie pathogène bacille mobile Gram – , Chez les nourrissons, il peut causer une
Méningites, septicémies, bactériémies, entérocolites nécrosantes (NEC)la raison pour laquelle
elle est rechercher systématiquement dans les préparation destinées aux nourrissons de 1ier âge
( surtout les produits déshydraté ex : PDL infantile de 1ier âge car elle peut vivre dans des
endroits très secs.)

b) Principe :
 La recherche de chronobacter s’effectue selon les étapes suivantes :

- Pré-enrichissement dans TSE.

- Enrichissement dans le bouillant mossel.
- Isolement dans la gélose sakazakii
c) Mode opératoire :
 Pré-enrichissement dans TSE : 25g de l’échantillon dans 225ml de TSE, incuber à
37°c pdt 24h.
- Travailler toujours dans des règles d’asepsie au près du bec.
 Enrichissement dans le bouillant mossel : Prendre 10ml du bouillant de prè-
enrichissement TSE et le mettre dans 90ml du bouillant Mossel, incuber à 44°c pdt
24h.
 Isolement dans la gélose sakazakii : C’est par étalement en surface sur gélose
Sakazakii qu’on va faire l’isolement à partir du bouillant d’enrichissement Mossel.
- On dépose une goutte du bouillant d’enrichissement et on ensemence sur toute la
surface de la gélose par des stries au moyen d’une hanse de platine ou une pipette
pasteur.
- Incuber à 44°c pendant 24h.
d) Lecture et interprétation :

Les colonies caractéristiques apparaissent de couleurs vert- bleu.

Selon le journal officiel algérien 2017 : Cronobacter sakazakii doit être absent dans 10g de
produit destiné pour l’alimentation des nourrissons.

1.9.10 Recherche de Bacillus :

a) Définition :
Bacillus cereus est responsable de toxi-infections caractérisées par des symptômes
diarrhéiques et d’intoxinations se traduisant par des symptômes émétiques. Il s’agit d’un
bâtonnet à coloration Gram positive, sporulant et aéro-anaérobie facultatif.
b) Principe :

La recherche de Bacillus cereus s’effectue en milieu solide par étalement en surface sur
gélose Mosel.

c) Mode opératoire :
Ensemencer 0,1 ml des différente dilution (10-1 et 10-2) à l’aide de pipettes pasteur stériles en
râteau sur milieu Mossel.

- Incuber à 44°c pdt 24h.

Lecture et interprétation

Contrôle de stérilité :

Réalisé principalement lorsque le contrôle de stabilité donne des résultats positifs ou douteux,
ou en cas de conserves présentant des accidents de conservation spontanés.

Interprétation :
Le premier point qu'il est important de noter est l'absence ou la présence de cultures.

Si contrôle de stabilité positif, qui, n’est pas suivi de cultures positives, il faut rechercher les
explications possibles :
 Milieux mal adaptés,
 pH mal ajusté,
 Autodestruction des germes dans la conserve avant l'ensemencement.

Dans un deuxième temps, l'examen des caractéristiques culturales et morphologiques des

germes ayant cultivé doit permettre d'expliquer le défaut de stabilité.

La présence de thermorésistants est le signe d'une stérilisation insuffisante. Il se présentant

sous forme de :

 bacilles Gram positif, parfois sporulés, anaérobies stricts (Clostridium),

 ou aérobies, parfois facultatifs (Bacillus),

La présence d'une flore thermosensible est associée à une contamination postérieure à la

stérilisation, liée à un défaut d'étanchéité.

Cette flore est généralement mésophile, aérobie ou anaérobie facultative, composée le plus
souvent de coques Gram positif ou de bacilles Gram négatif.

Les conserves acides subissent un chauffage bien plus limité, qui peut ne pas détruire des
germes non sporulés (lactobacilles, levures).
 I. INTERPRETATION DES RESULTATS D’ANALYSE
MICROBIOLOGIQUE :

Les critères qualificatifs « m » et « M » expriment le nombre de germes présents dans un

gramme (g) ou un millilitre (ml) d’aliment et dans 25 grammes d’aliment pour les salmonella.
- n : nombre d’unité constituant l’échantillon
- m : nombre de germes présents dans un gramme ou un millilitre de produit analysé, qui
correspond à la valeur en dessous de laquelle la qualité du produit est considérée comme
satisfaisante ;
- M : nombre de germes présents dans un gramme ou un millilitre de produit analysé, qui
correspond à la valeur au-dessus de laquelle la qualité du produit est considérée comme
inacceptable ;
- c : nombre maximal d’unités d’échantillonnage de produit analysé qui peut dépasser
« m » tout en étant inférieur à « M » sans que le lot ne soit rejeté.

III. Interprétation des résultats d’analyses microbiologiques :

n : nombre d’unité constituant l’échantillon

m : nombre de germes présents dans un gramme ou un millilitre de produit analysé, qui

correspond à la valeur en dessous de laquelle la qualité du produit est considérée comme
satisfaisante ;

M : nombre de germes présents dans un gramme ou un millilitre de produit analysé, qui

correspond à la valeur au-dessus de laquelle la qualité du produit est considérée comme
inacceptable ;

c : nombre maximal d’unités d’échantillonnage de produit analysé qui peut dépasser « m »

tout en étant inférieur à « M » sans que le lot ne soit rejeté.

A) Interprétation selon un plan à trois classes : L'interprétation des résultats s'effectue

selon un plan de trois classes, dans le cas où la valeur « c » est différente de zéro (0). Les
résultats s’expriment de la façon suivante :

 Si le résultat de l'analyse est inférieur ou égal à «m », le résultat du critère

microbiologique est satisfaisant ;

 Si le résultat de l'analyse n’excède pas « M » et si le nombre d’unités de l’échantillon

donnant un résultat supérieur à « m » et compris entre « 1 » et « c », le résultat du critère
microbiologique est acceptable ;

 Si le résultat de l'analyse excède « M » ou si le nombre d’unités de l’échantillon

donnant un résultat compris entre « m » et « M » est supérieur à « c », le résultat du critère

microbiologique est non satisfaisant.

B) Interprétation selon un plan à deux classes : L'interprétation des résultats s'effectue

selon un plan à deux classes, dans le cas où la valeur « c » est égale à zéro (0). Les résultats
s’expriment de la façon suivante :

Pour l'expression "absence dans" :

 Le résultat du critère microbiologique est satisfaisant lorsqu’il y a absence du

micro-organisme dans toutes les unités de l'échantillon.
 Le résultat du critère microbiologique est non satisfaisant, lorsque la présence du
micro-organisme est détectée dans, au moins, une unité de l'échantillon. Dans le cas des
micro-organismes suivants : Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter spp
(thermotolérants), le résultat révèle que le lot contrôlé est impropre ‡ la consommation.
 Pour la valeur limite "m=M" :
- Si le résultat de l'analyse est inférieur ou égal « m », le résultat du critère
microbiologique est satisfaisant.
- Si le résultat de l'analyse excède « m » le résultat du critère microbiologique est non
satisfaisant. Dans le cas de Listeria monocytogenes, le résultat révèle que le lot
contrôlé est impropre à la consommation.
3. Cas particulier : L’échantillon est considéré toxique si la limite est supérieure ou égale à
105 pour les bactéries : Anaérobies sulfito-réducteurs, staphylocoques à coagulase+ et Bacillus
cereus.