Cours Culture Cellulaire

Culture Cellulaire Touil-boukoffa C / Rafa H, 2017
CULTURE CELLULAIRE ET
APPLICATIONS
BIOTECHNOLOGIQUES
1
TOUIL-BOUKOFFA. C et RAFA. H
• Introduction :
La culture cellulaire est devenue un des outils majeurs utilisés aujourd'hui dans
les sciences de la vie.
La culture de cellules animales appartient à un ensemble technologique intitulé

‘’La culture de tissu’’ qui est constituée de 3 parties essentielles :
- La culture d’organes
- La culture de tissu
- La culture cellulaire
La culture d’organes : correspond au maintien en dehors de l’organisme

d’organes ayant conservé leur structure et leur fonction.
La culture de tissu : correspond au maintien en dehors de l’organisme de tissus

d’une manière qui permettrait la conservation des fonctions spécifiques de
chaque tissu.
La culture cellulaire : correspond au maintien en dehors de l’organisme de

cellules non organisées en tissu, cependant capables de se diviser et d’exprimer
in vitro métabolismes et fonctions spécifiques
• Applications de la culture cellulaire :
Biologie cellulaire :
-Etudes de cellules physiologiques
-Division, différenciation
-Vieillissement cellulaire
-Physiopathologie
Santé :
-Diagnostic de maladies (pathologie virales)
-Toxicologie
-Diagnostic prénatal et postnatal de maladies génétiques
2
Biotechnologie :
Production des biomolécules à usage thérapeutique (exp : insuline, interférons,
cytokines…)
• Quelques définitions à retenir :
Primoculture : Culture dérivant des cellules, tissus ou organes prélevés

directement à partir d’un organisme.
Repiquage ou passage : Transfert de cellules d’un flacon de culture à un

ou plusieurs autres.
Nombre de repiquage ou passage : nombre de fois où la culture a été

repiquée.
Lignée cellulaire : dérivée d’une primoculture au moment du premier

repiquage.
Souche cellulaire : dérivée d’une primoculture ou d’une lignée cellulaire

par sélection ou clonage des cellules possédant des propriétés ou des
marqueurs spécifiques
Clone cellulaire : population de cellules dérivant d’une seule cellule par

division
3
Méthodes de cultures :
Deux types de cellules sont à distinguées :
-Les cellules libres (circulantes) : les cellules du sang et

d’exsudats
-Les cellules en cohésion : les cellules constituants un tissu.

Cette différence implique l’utilisation de méthodes d’obtention
différentes.
A- Méthodes d’obtention :
-Pour les cellules circulantes, elles sont obtenues par les techniques habituelles de
prélèvement suivie de centrifugation / gradient de densité (Ficoll d=1,077).
-Pour les cellules organisées en tissu, leur isolement fera appel soit aux méthodes
de dissection, soit aux méthodes enzymatiques
A1. Séparation des cellules :
A1. 1 LES CELLULES CIRCULANTES
Exp : PBMC, cellules mononuclées du sang périphérique
4
PBMC Méthodes d’obtention
2/. Décantation
+ 4°C
1/. Prélèvement sanguin /

anticoagulant
Dilution
du culot
Récupérer le plasma
dans du
Verser délicatement
le sang dilué sur le
Ficoll
Ficoll
3/. centrifugation
5
Prélever l’anneau
de PBMC et
procéder à un
plasma
lavage par PBS-
PBMC
NH4Cl /
Ficoll
centrifugation GR+PN
Le culot cellulaire est suspendu dans

un volume minimum de RPMI-1640
RPMI-1640 : PBMC
milieu de culture
A1. 2. LES CELLULES ORGANISEES EN TISSU :
Les méthodes d’obtention sont de 2 types :
-La dissection
-La méthode enzymatique
• La méthode de dissection proprement dite : le tissu est coupé en

fragment de 1 à 4 mm3. Ces derniers sont encore réduits à l’aide de pinces
puis places dans un flacon de culture contenant le milieu nutritif : les
cellules vont migrer à partir des différents fragments. Il est nécessaire de
mettre les explants dans un récipient de culture ne contenant qu’un très
faible volume de milieu pour affleurer les fragments. Cela évite la flottaison
des explants. Ce phénomène conduirait à l’incapacité de migration
cellulaire à partir des explants isolés. Après quelques heures, quand
l’explant a suffisamment adhéré au support, la quantité convenable de
milieu est ajoutée.
6
• Les méthodes enzymatiques :

Les enzymes utilises sont protéolytiques : Ils digèrent la trame protéique
entourant les cellules. La trypsine est la plus couramment utilisée. Il faut noter
que la trypsine brute ou cristallisée est utilisée à une concentration de 0,5 à 2,5
g /l dans une solution saline types Hanks ou PBS sans Ca+2 et Mg+2
Les techniques utilisant la trypsine sont nombreuses mais celle de Fernanades
est la plus couramment utilisée (1958) :
-Dissection du tissu choisi en pulpe épaisse dans une solution saline
additionnée d’antibiotique.
- -Trypsination effectuée sous agitation lente pour ne pas léser la membrane.
-Inactivation de la trypsine par dilution de la suspension cellulaire.
-Centrifugation
-resuspendre le culot cellulaire dans du milieu de culture suivie d’une filtration
pour éliminer les amas avant la mise en culture.
Remarque : Pour certains tissus riches en collagène, on utilise la collagénase
à différentes concentrations (0,1-2g /ml).
A.2Purification des cellules :

A.2.1. Purification par affinité à un support (Adhérence) :
La purification de certaines cellules est basée sur l’adhérence de ces dernières
à un support traité
Exp : Les monocytes à partir des PBMC, support traité
A.2.2 Purification par immuno-marquage (Billes magnétiques, Tri

cellulaire) :
La purification des populations de cellules est souvent nécessaire afin d'étudier
leurs fonctions uniques. Le tri cellulaire magnétique est une technique de tri
cellulaire permettant de sélectionner certains types de cellules et de les isoler
grâce à un champ magnétique
7
B. Méthodes de culture cellulaire:

a. Matériel utilisé :
Microplaque
Boite Falcon/ Flasque
Incubateur à CO2
Hotte à flux laminaire
8
b. Méthode en suspension :
Le but de la technique est le maintien des cellules en suspension. Il faut donc

éviter l’adhésion au support et l’agrégation cellulaire. Le support utilisé pour la
culture en suspension est un support non traité.
Exp : PBMC, Lymphocytes.
c. Méthode de culture stationnaire :
Le principe de ces cultures est base sur l’affinité des cellules mises en culture
pour le support utilisé.
Au début, le verre était très utilisé mais à l’heure actuelle, les matières
plastiques traitées ont remplacé le verre. La matière plastique est traitée au
Collagène, fibronectine, protéoglycanes.
L’adhésion au support comporte 4 étapes :
1. L’adsorption
2. Le contact
3. L’attachement
4. L’étalement
Cette adhésion nécessite l’intervention de facteurs d’attachement protéiques : la

fibronectine, la vitronectine, le collagène….Ces molécules sont également
apportées par le milieu de culture ou secrétées par les cellules..
Les boites et les microplaques sont mises dans des étuves spéciales où
l’atmosphère est régulée par un apport d’air 95%, 5% CO2 et de la vapeur d’eau
(% humidité).
d. Méthodes de cultures en système Transwell :
Les inserts Transwell sont des récipients Corning avec des supports perméables à
base de membrane qui permettent à ces cellules de développer une polarité et
d'acquérir la capacité d'exprimer des fonctions spéciales.
Exemple : voir l’article 5 (TD)
9
e. Méthodes de co-cultures :
Cette méthode est utilisée pour étudier quelques interactions entre deux types de
cellules distincts à des fins thérapeutiques par exemple.
Exemple : La co-culture des lymphocytes Th17 modifiés génétiquement

(modifications épigénétique) avec des monocytes autologues ou PBMC
autologues.
10
Besoins nutritifs des cellules en culture cellulaire
Milieu de culture :
Le rôle d’un milieu de culture :
-vecteur d’éléments nutritifs
-maintien des constantes physicochimiques (pH, osmolarité).
Un milieu de culture doit contenir tous les facteurs responsables du maintien de

toutes les fonctions cellulaires. Actuellement les milieux utilisés sont tous
synthétiques de composition plus au moins complexe. Alors que les premiers
milieux utilisés étaient des liquides biologiques : la lymphe, le liquide d’ascite.
Le milieu de culture est constitué d’un milieu de base au quel on ajoute les additifs
(sérum, antibiotiques, tampon, indicateur de pH) afin d’établir un environnement
optimal pour la cellule.
On distingue deux principaux types de milieux synthétiques :
Le milieu empirique ‘classique’: il est composé d’une base (sels minéraux,

métaux, glucose, acides aminés, vitamines), d’un indicateur de pH, des tampons,
de sérum de 2 à 20% du volume, des antibiotiques (pénicilline, streptomycine).
Le milieu définis : il contient les mêmes constituants que le milieu empirique

mais tout est quantifiés. Il est cher car tous les constituants sont hautement
purifiés.
A. Milieu de base :
A.1. Maintien des constantes biologiques : le maintien des constantes

biologiques in vitro est assuré par un apport des minéraux, métaux, substances
énergétiques (sucres, acides cétoniques, acides aminés) et des vitamines.
1. les constituants minéraux : 7 ions sont indispensables : Na+, k+, Ca++, Mg++,
PO4--, Cl-, Carbonate CO3-. Ces minéraux constituent la base de toutes les
solutions salines comme celles de Hanks, tampon Eagle. Ces minéraux jouent un
role dans le maintien de la pression osmotique, transport membranaire (canaux et
pompes) et les métabolismes (Ca++ active certaines enzymes impliquées dans le
métabolisme cellulaire). Na+, k+, Ca++, Mg++ jouent un rôle fondamental dans le
11
maintien des potentiels membranaires. Ca++, Mg++ sont des cofacteurs de

nombreuses réactions enzymatiques et ils interviennent dans l’attachement et
l’étalement des cellules à leur support de culture.
2. les métaux : certains milieux contiennent des métaux à l’état de trace qui
semblent indispensables à certaines réactions enzymatiques : Fer, Sélénium,
Cadmium, Lithium
Fer : chaine respiratoire.
Sélénium : indispensable au fonctionnement de la glutathion-peroxydase qui

permet la dégradation des peroxydes toxiques métabolisés par la cellule.
3. les molécules énergétiques : principale source d’énergie in vitro. Elles

alimentent la néoglucogénèse.
• Sucre : à 1g /l concentration semblable au sérum humain. Il peut être

remplacé par le galactose, mannose, fructose.
• Acides cétoniques : acide α cétoglutarique, acide pyruvique.
• Acides aminés : 12 acides aminés sont indispensables. Les cellules in vitro
sont incapables de les synthétiser. Exp : L glutamine, lysine, Tyrosine…
4. les vitamines : les besoins en vitamines sont variables selon les types
cellulaires. Certains chercheurs considèrent que huit vitamines sont nécessaires
aux cellules en culture in vitro : Choline, acide folique, pyridoxal, riboflavine,
thiamine, inositol, acide nicotinique, acide panthothemique.
A.2. Maintien des constantes physico-chimiques :
1. Le pH : Il doit être identique au pH sanguin mais l’optimum dépend des lignées

cellulaires.
Les variations de pH sont contrôlées par un indicateur de pH inclus dans le

milieu : le rouge de phénol : lorsque la culture a beaucoup poussée, le milieu va
pomper de CO2 qui provient de la dégradation des sucres et donc s’acidifié, il
devient jaune.
pH neutre : couleur rose
pH acide : couleur jaune
pH alcalin : couleur violet
12
Tous les milieux synthétiques contiennent des systèmes tampon HCO3- , PO4—ou
des tampons organiques comme Tris ou HEPES.
HCO3- est maintenu en équilibre avec 5% de CO2 dans l’atmosphère du système

d’incubation. Donc en présence deCO2 l’équilibre acido-basique des cellules est
réalisé par un tampon bicarbonate. Le CO2 présent en volume prédéterminé (5%),
se dissout dans le milieu de culture tamponné au bicarbonate et prévient son
alcalinisation, toxique pour les cellules.
2. Environnement gazeux : Azote, O2 (21%), CO2 (5%), Vapeur d’eau (%

d’humidité).
Dans l’étuve (Incubateur), l’atmosphère est constituée de 95% d’air et 5% de CO2.
Le rôle de CO2 : il intervient dans l’équilibre de pH (système HCO 3-) mais

également dans la prolifération cellulaire par son intervention dans la biosynthèse
des bases puriques et pyrimidiques.
La vapeur d’eau : prévient l’évaporation et l’osmolarité du milieu qui peuvent être

causés par la température 37°C
B. Sérum : le sérum contient des facteurs nécessaires au déclenchement de la

division cellulaire (agent mitogènes) et au fonctionnement cellulaire in vitro. Ce
qui traduit par le développement, la maturation, métabolisme et la fonctionnalité
des cellules.
Le % de sérum utilisé varie de 2 à 20 % selon le type cellulaire.
Origine de sérum : origine humaine et animale.
Le sérum doit provenir de donneur jeune, plusieurs travaux ont montré que l’effet
cytostimulant est inversement proportionnel à l’âge de donneur.
13
Les sérum les plus fréquemment utilisés sont :
-sérum de veau
-sérum de veau nouveau né
-sérum de veau fœtal (SVF).
Des études antérieures ont montré que le sérum contient des éléments qui ont un
effet synergétique cytostimulant sur la croissance globale des cellules en culture
et également certaines fonctions cellulaires. Ces éléments sont les facteurs de
croissances, les hormones, les molécules d’adhésion et les protéines de transport.
Toutefois la présence de sérum est un facteur limitant car :
• Les sérum d’animaux peuvent être contaminés par des virus, champignons.
En effet, ces derniers peuvent perturber le métabolisme des cellules.
• Les concentrations d’hormones et de facteurs de croissance sont instables
dans les sérum et varient selon les donneurs,
Ces deux paramètres peuvent engendrer une instabilité du pouvoir
prolifératif attendu par le sérum en déstabilisant la régulation des
métabolismes cellulaires.
Ces inconvénients ont amené les chercheurs à mettre au point des
milieux synthétiques définis sans sérum constitués d’une base (milieu
de base) à laquelle on rajoute différents additifs sélectionnées en
fonction de types cellulaires.
Facteurs de croissance :
Les facteurs de croissance sont des molécules polypeptidiques qui contrôlent la

prolifération, la différenciation ou la survie des cellules eucaryotes.
Ce sont des signaux qui participent à toutes les étapes de la physiologie mais
également de la physiopathologie comme les cancers.
Selon James en 1984, un facteur de croissance doit répondre aux critères

suivants :
-la majorité de la structure est de nature polypeptidique.
-son action sur la cellule cible pour initier la réponse cellulaire ne s’effectue que
si le facteur s’attache à un récepteur membranaire d’où la formation d’un
complexe spécifique.
14
La formation du complexe facteur de croissance-récepteur engendre :
-une réponse hypertrophique (augmentation de la taille des cellules).
-une réponse hyperplasique (augmentation de la population cellulaire).
-dans certains cas, ce complexe induit ou bloque une étape de la différenciation.
-le facteur de croissance et son récepteur sont éliminés de la surface de la cellule

par endocytose.
Les principaux facteurs de croissance caractérisés à ce jour :
• EGF : Epidermal Growth Factor : Mise en évidence par S Cohen en 1959.

l’EGF est un mitogène pour les cellules épidermiques et épithéliales in vivo
et in vitro. Il a été caractérisé a partir de la glande sous maxilaire et l’urine
humaine. L’EGF est un polypeptide de 53 acides amines, pHi= 4.6. Le gène
de l’EGF a été cloné à partir de l’E. Coli et levure.
• IGF : Insuline Like Growth Factor : ce facteur a des effets similaires à

l’insuline sur les tissus adipeux in vivo et in vitro (Froesh en 1963). L’IGF
a une activité mitogène sur les fibroblastes. Il existe deux types :
IGF1 : PM 5800, pHi basique
IGF 2 : PM 5800, pHi basique
Il existe 70% d’identité de séquence entre les deux sous types et 50%
d’identité de séquence avec l’insuline.
• NGF : Nerve Growth Factor : C’est un facteur qui augmente la survie et

la différenciation des cellules gliales sensorielles. Le NGF a été isolé a
partir de glande sous maxilaire de souris adulte male de différents venins
de serpents. C’est un complexe formé de 3 molécules distinctes α, β, γ. Ce
complexe a un PM de 140 000 Da.
• PDGF : Platelet derived growth factor : le PDGF a été isolé à partir de

plaquettes. Le PDGF est une glycoprotéine de PM allant de 27000-310000
(hétérogénéité due à la glycosylation. Plusieurs types de cellules portent le
récepteur du PDGF. Ce récepteur présente une activité Tyrosine-kinase. Le
PDGF est un agent mitogène des cellules mésenchymateuses et des cellules
vasculaires du muscle lisse.
15
• TGF : Transforming growth factor : il constitue un groupe de facteurs

TGF-α et TGF-β.
Le TGF-α a été isolé d’une lignée métastasique de mélanome humain. Le
TGFα est un polypeptide de 68 acides aminés. Il présente 30% d’homologie
avec le EGF de souris. Son récepteur est un monomère de poids de
60000Da.
Le TGF-β, il a été isolé de différents tissus d’origine normale ou
néoplasique. Son PM est de 23000-25000 Da, constitue de 2 chaines reliées
entre elles par des ponts S-S.
Le TGF-β est capable de conférer un phénotype transforme a des
fibroblastes normaux.
Le TGF-β semble être est un inhibiteur de la prolifération cellulaire. Son
action est analogue à d’autres facteurs inhibiteurs TIF (Tumor inhibitory
factor).
Le récepteur de TGF ne possède pas d’activité tyrosine kinase.
• FGF : Fibroblast growth factors :il a une activité mitogénique sur des
cellules isolées de tissus : cerveau, hypothalamus, rétine. Le récepteur
membranaire du FGF a été mis en évidence. Il a été particulièrement
caractérisé sur des cellules de rein de hamster. Le récepteur existe
également sur les cellules épithéliales du cristallin et les myoblastes. Le
FGF stimule in vitro la croissance des cellules d’origine mésodermique,
ectodermique, cellules épithéliales du cristallin, myoblastes.
16
Contrôle des contaminations des cultures cellules
La qualité des résultats de recherche dépend de la qualité des cultures

cellulaires et dans cet axe, le manipulateur doit être vigilant face aux divers
contaminants, soit d’origine biologique ou chimique. Qu’ils soient visibles
ou non, destructeurs ou non, les contaminants agissent sur la croissance,
altèrent les caractéristiques et les fonctions cellulaires et influent sur la
qualité des résultats. Parfois, certains agents ne sont pas toxiques
individuellement mais peuvent le devenir, soit par leur forte concentration
ou combinés avec un autre agent. Egalement, certains types cellulaires sont
plus sensibles que d’autres.
A. Origines des contaminations :

- Air
- Eau
- Mains, Matériel
- Milieu
- Sérum
- Cellules elles-mêmes
A.1. les contaminants chimiques :
Les contaminants chimiques sont définis comme étant une présence de

produits non vivants ayant un effet indésirable sur la culture cellulaire.
Exp : -Impureté de CO2 et de l’air de l’incubateur.
-Résidu de germicides ou pesticides utilisés lorsqu’on désinfecte les
incubateurs, comptoirs ou autres instruments.
-La qualité de l’eau qu’on utilise pour préparer le milieu et les
solutions doit être testée.
-Réservoir d’eau dans l’incubateur.
A.2. les contaminants biologiques :
Les contaminants biologiques sont plus facilement détectables et souvent

visibles à l’œil nu (bactéries, levures, moisissures….). La croissance rapide
de ces microorganismes (surtout en absence d’ATB) permet de les détecter
en peu de temps : turbidité, changement de pH, mort cellulaire). Cependant,
17
l’utilisation fréquente d’ATB contribue à garder un faible taux de

contamination. Il existe d’autres bactéries qui sont moins détectables à la
microscopie, comme les bactéries de petites dimensions ou intracellulaires
(mycoplasmes,…..).
B. Les incidences dues aux contaminations :
-Mutation : les aberrations chromosomiques.

-activation des macrophages et mitogènes des lymphocytes T.
-déviation des activités métaboliques des cellules en faveur du
métabolisme des cellules procaryotes. Ce qui engendre une baisse des
activités biologiques et à long terme : la mort cellulaire.
C.Comment prévenir la contamination et la transmission de la contamination :
-Les cultures des cellules doivent être testées régulièrement sur le plan
des contaminations microbiologiques.
-Les cellules doivent être conservées, congelées dans l’azote liquide

après qu’on est montre qu’elles n’étaient pas contaminées par des
mycoplasmes ou d’autres contaminants.
-Les surfaces de travail doivent être désinfectées avant et après chaque

manipulation.
-Air : hotte à flux laminaire avec un système Ultra-violet et un système

filtrant l’air.
-Eau : doit subir une distillation et filtration.
-Mains : lavage et désinfection avec l’alcool et eau de Javel.
-Matériel : stérilisation par autoclavage sous chaleur humide pendant

30min.
-Milieu et le sérum : stérilisation par filtration
18
Contrôles fonctionnels des cellules en culture
L’objectif de la culture cellulaire est de :
-Produire des cellules par prolifération.

-Préserver les fonctions spéciales.
Nous devons donc prendre en considération les critères suivants afin

d’assurer la bonne marche de la culture :
1. Le contrôle de mise en route :

-Effectuer un test de viabilité. Ceci permet de situer l’état de départ des
cellules.
-Il est impératif de vérifier la morphologie des cellules au microscope à

phase inverse.
-Dans certains cas, il est nécessaire de vérifier leur ultrastructure au

microscope électronique.
2. Le contrôle de routine :
Ce contrôle est effectué quand la culture est en route, l’objectif de contrôle

est d’établir des conditions optimales pour la culture cellulaire. Il repose
sur le changement de milieu. La fréquence du changement de milieu
dépend des cellules mais en règle générale, la fréquence est de 2-3 jours.
Le renouvellement du milieu doit se faire même quand les cellules ne sont
plus en phase de prolifération car elles continuent à métaboliser des
molécules néfastes à leur survie tels que les protéases.
Quand et comment faut-il changer le milieu ?
Le paramètre physico-chimique à contrôler est le pH.
Les cellules vivantes exigent un pH neutre. A pH< 6.5, la viabilité est

menacée. La modification du pH est indiquée par les indicateurs que
contient le milieu.
19
La forte concentration des cellules tend à l’acidification du pH du milieu.

Le contrôle de l’état de confluence des cellules doit être fait tous les 2
jours.
3. Contrôle de contaminations :
La détection de tous les microorganismes s’effectue de manière
séquentielle, virage de coloration du milieu de culture, trouble du milieu
de culture et observation au Microscope à phase inverse.
Les mycoplasmes sont les germes les plus fréquents dans les
contaminations de cultures cellulaires.
La détection des mycoplasmes se fait par deux voies :
-Voie directe
-Voie indirecte
1. Voie directe : se fait par culture microbiologique, le milieu de culture

utilise est un milieu liquide qui comprend un bouillon de base :
• Sérum de cheval
• Extrait de levure
• Arginine
• Glucose
• Indicateur de Ph
2. Voie indirecte : Elle porte sur la coloration à l’ADN à l’aide de
substances fluorescentes. Cette coloration est la méthode la plus sensible
et la plus économique pour détecter les Mycoplasmes. Le fluorochrome
utilisable est le Diamido-Phenylindole (DAPI), qui se lie à l’ADN. En
microscopie à fluorescence, les cellules non infectées présentent une
fluorescence du noyau et les cellules infectées, un noyau fluorescent ainsi
qu’une fluorescence extranucléaire due à l’ADN des Mycoplasmes.
20
La conservation des Cellules
Intérêt :
- Constitution d’une réserve

- Protection des cellules contre :
• Les modifications de leur patrimoine génétique
• Le vieillissement in vitro
• Contamination
La conservation doit être de longue durée, pour cela, la température instaurée doit
être la plus basse possible.
La Cryoconservation : -180°C, sous l’azote liquide
Réactifs :
- Azote liquide (Source de froid)
- Cryoprotecteurs : DMSO (Dimethyl sulfoxyde) , Glycérol
Le DMSO est plus protecteur et plus cytotoxique, tandis que le Glycérol est moins
cytotoxique et moins protecteur.
Matériels nécessaires :
Le matériel de conditionnement doit être étanche : Ampoules et Cryotubes

(Polypropylène)
Méthode de congélation : Elle doit être progressive et non brutale
1. Déterminer la viabilité de la population cellulaire, attendre la fin de la phase

exponentielle de croissance pour entamer la conservation.
2. Centrifuger afin d’éliminer toute trace d’enzyme utilisée pour le
détachement (le cas des cellules adhérentes).
3. Bien disperser les cellules dans leur milieu de culture à une densité de 10 6-
107 cellules/ml + 5 à 10% de cryoprotecteur.
4. Repartir la suspension dans des cryotubes qui doivent porter les
caractéristiques suivantes :
-Type cellulaire
-Nombre de passage ou étape de la culture
21
-Date de la congélation
5. On procède à un abaissement progressif de la température en utilisant des

boites de congélation contenant de l’isopropanol (-80°C pendant une nuit).
Ensuite, on les transfère rapidement dans l’azote liquide (- 180°C).
Cette méthode est très efficace, elle permet la conservation des cellules et de
leurs fonctions pendant de nombreuses années.
Décongélation : doit être rapide.
Le principe consiste à placer l’ampoule à 37°C pendant 1 min jusqu'à

décongélation complète.
-Stérilisation du tube par l’alcool.
-Ouverture du tube.
-Transfert de la suspension cellulaire dans un tube contenant du milieu de

culture approprié.
-Dispersion
-Centrifugation pour éliminer les traces d’agents cryoprotecteurs.
-Le culot est alors remis en suspension dans le milieu.
Remarque : Un test de viabilité est effectué systématiquement.
Incidences dues à une mauvaise congélation ou décongélation :
-Formation des cristaux de glace intracellulaire.
-Variation de pression osmotique.
Diminution du rendement, déviation des activités métaboliques
22
Le transport des cellules
Le transport des cellules est une étape importante pouvant altérer les propriétés
thérapeutiques des préparations de thérapie cellulaire, ainsi les résultats de
recherche. L’hétérogénéité des pratiques et la diversité des intervenants
nécessitent une meilleure harmonisation destinée à renforcer la qualité des
produits et la sécurité des personnes.
Ce transport est une étape sensible puisqu’il peut, lorsqu’il est mal maitrisé,
aboutir à la perte ou à l’altération de la qualité de produits le plus souvent
irremplaçables.
A. Colisage et conservation temporaire avant l’acheminement

Le conditionnement primaire doit être clos et rendu étanche dès la fin du
prélèvement.
Si la durée de conservation totale avant transformation estimée < à 6 heures :
- Le conditionnement primaire (la poche contenant les cellules), placé dans un
conditionnement extérieur (sac propre, étanche), est soit positionné dans le
récipient de transport (mallette, poolbox, conservé à l’abri des sources de chaleur
ou de refroidissement) et maintenu stable à l’aide de matériel de calage et de
protection minimisant ainsi les chocs internes, soit entreposé dans une enceinte
dédiée à cet effet et assurant le respect de la température de consigne dans l’attente
de son enlèvement.
Si la durée de conservation totale avant transformation estimée > à 6 heures :
- Il est recommandé, afin d’éviter tout changement de température, de stocker le
conditionnement primaire (la poche contenant les cellules), dans un
conditionnement extérieur (sac propre, étanche, avec un dispositif absorbant pour
les poches), positionné dans le récipient de transport (dispositif isolant thermique)
et maintenu stable à l’aide de matériel de calage et de protection minimisant ainsi
23
les chocs internes. Ce mode de conservation temporaire dans le colis de transport

doit être préféré au stockage temporaire dans une enceinte réfrigérante
Les produits frais issus du prélèvement doivent bénéficier d’un suivi continu de
leur température de conservation, par le biais d’un indicateur étalonné. Ce suivi
débute, dans l’heure suivant la fin du prélèvement jusqu’à réception dans l’unité
de thérapie cellulaire. Ces indicateurs doivent pouvoir mettre en évidence des
variations de température en dehors des limites recommandées.
B. Acheminement des cellules vers l’unité de thérapie cellulaire
Les colis doivent être surveillés contre tout acte de négligence ou de malveillance
durant toute la durée du transport. A cet effet, les étapes ou relais de transport
doivent être sécurisées.
La durée de transport maximale préconisée, porte à porte, est de 18 heures pour
un transport national et de 36 heures pour un transport international longue
distance.
C. Contrôle à réception
A la réception, il faut vérifier :
- l’intégrité du colis, le respect des conditions d’hygiène, de température de
transport et la durée du transport.
- l’état des cellules (Test de viabilité, contrôle de contamination, Morphologie
cellulaire, Ultrastructure..)
24

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La culture de cellules animales appartient à un ensemble technologique intitulé

La culture d’organes : correspond au maintien en dehors de l’organisme

La culture de tissu : correspond au maintien en dehors de l’organisme de tissus

La culture cellulaire : correspond au maintien en dehors de l’organisme de

• Applications de la culture cellulaire :

• Quelques définitions à retenir :

Primoculture : Culture dérivant des cellules, tissus ou organes prélevés

Repiquage ou passage : Transfert de cellules d’un flacon de culture à un

Nombre de repiquage ou passage : nombre de fois où la culture a été

Lignée cellulaire : dérivée d’une primoculture au moment du premier

Souche cellulaire : dérivée d’une primoculture ou d’une lignée cellulaire

Clone cellulaire : population de cellules dérivant d’une seule cellule par

Deux types de cellules sont à distinguées :

-Les cellules libres (circulantes) : les cellules du sang et

-Les cellules en cohésion : les cellules constituants un tissu.

A1. Séparation des cellules :

A1. 1 LES CELLULES CIRCULANTES

Exp : PBMC, cellules mononuclées du sang périphérique

PBMC Méthodes d’obtention

1/. Prélèvement sanguin /

Le culot cellulaire est suspendu dans

A1. 2. LES CELLULES ORGANISEES EN TISSU :

Les méthodes d’obtention sont de 2 types :

-La méthode enzymatique

• La méthode de dissection proprement dite : le tissu est coupé en

• Les méthodes enzymatiques :

A.2Purification des cellules :

A.2.2 Purification par immuno-marquage (Billes magnétiques, Tri

B. Méthodes de culture cellulaire:

Boite Falcon/ Flasque

Hotte à flux laminaire

Le but de la technique est le maintien des cellules en suspension. Il faut donc

c. Méthode de culture stationnaire :

Cette adhésion nécessite l’intervention de facteurs d’attachement protéiques : la

d. Méthodes de cultures en système Transwell :

Exemple : voir l’article 5 (TD)

Exemple : La co-culture des lymphocytes Th17 modifiés génétiquement

Besoins nutritifs des cellules en culture cellulaire

Le rôle d’un milieu de culture :

-vecteur d’éléments nutritifs

-maintien des constantes physicochimiques (pH, osmolarité).

Un milieu de culture doit contenir tous les facteurs responsables du maintien de

On distingue deux principaux types de milieux synthétiques :

Le milieu empirique ‘classique’: il est composé d’une base (sels minéraux,

Le milieu définis : il contient les mêmes constituants que le milieu empirique

A.1. Maintien des constantes biologiques : le maintien des constantes

maintien des potentiels membranaires. Ca++, Mg++ sont des cofacteurs de

Fer : chaine respiratoire.

Sélénium : indispensable au fonctionnement de la glutathion-peroxydase qui

3. les molécules énergétiques : principale source d’énergie in vitro. Elles

• Sucre : à 1g /l concentration semblable au sérum humain. Il peut être

A.2. Maintien des constantes physico-chimiques :

1. Le pH : Il doit être identique au pH sanguin mais l’optimum dépend des lignées

Les variations de pH sont contrôlées par un indicateur de pH inclus dans le

pH neutre : couleur rose

pH acide : couleur jaune

pH alcalin : couleur violet

HCO3- est maintenu en équilibre avec 5% de CO2 dans l’atmosphère du système

2. Environnement gazeux : Azote, O2 (21%), CO2 (5%), Vapeur d’eau (%

Dans l’étuve (Incubateur), l’atmosphère est constituée de 95% d’air et 5% de CO2.

Le rôle de CO2 : il intervient dans l’équilibre de pH (système HCO 3-) mais

La vapeur d’eau : prévient l’évaporation et l’osmolarité du milieu qui peuvent être