Les biofilms chez les bactéries.

UE BIO24c
Cours Dominique Schneider
Les biofilms chez les bactéries

Sommaire

Introduction

La formation du biofilm

•les étapes
•les acteurs moléculaires impliqués dans l’adhérence
•l’exemple de Pseudomonas aeruginosa

•Les avantages procurés par le biofilm

•Le biofilm et l’Homme.

 Introduction : Petit historique du biofilm

1976 :
•29 morts (American Legion, Philadelphie)
•Découverte de Legionella pneumophila.

1943 :
•Claude Zobelle
•Les bactéries colonisent préférentiellement
les parois des flacons.

1978 :
•William Costerton
•1ères études des communautés des cours d’eau
•1000-10 000 fois plus de bactéries sur les rochers
•Définition du biofilm.
 Introduction : Définition du biofilm

Le biofilm :
•communauté de microorganismes (bactéries, champignons, etc.)
•agrégés en microcolonies adhérant sur une surface inerte ou biologique
•caractérisée par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice
d’exopolymères (Sci Ameri, 1978).

Forme de vie existant depuis au

moins 3,3M d’années

Longue évolution :
•très grande adaptation
•très grande résistance.

D’après Westall F. et al. Precambrian Res. (2001)

 Introduction : Le biofilm est le mode de vie normal des bactéries

Deux modes de vie des organismes unicellulaires :

•Flottaison libre planctonique, en milieu liquide

•Biofilm :
• Serait le mode de vie naturel de la plupart des microorganismes,
notamment en milieu hostile
• Colonies sur boîtes de Pétri
• Sa structure et sa physiologie donne aux bactéries ce que
l’organisation tissulaire apporte aux cellules des êtres supérieurs.
 Introduction : Quelques exemples de biofilm
Les biofilms peuvent coloniser tous les environnements (naturels, artificiels,
tissus vivants)
•Biofilms naturels: multi-espèces

•Plaque dentaire, 500 espèces différentes dans la cavité buccale humaine

•Écosystèmes naturels : eucaryotes unicellulaires, algues, protozoaires,

amibes (biofilm d’eau chaude à Yellowstone, les canalisations, les rideaux
de douches)
 Introduction : Quelques exemples de biofilm

Multitudes de surfaces colonisées :

•Toutes surfaces submergées, environnements aqueux

•Tous types de matériaux :

inorganiques : verre, minéraux, métaux
organiques : synthétiques et biologiques.
Médical
•Cathéters
Environnement Industriel •Pacemakers
 La formation du biofilm :
Architecture et fonctionnement du biofilm

Taille: visible à l’œil nu

Densité bactérienne 108 à 1011 bactéries par cm3.

Architecture et formes variables selon l’environnement :

•pellicules bactériennes
•agrégats ou floculats bactériens
•colonies formées à la surface de milieux gélosés.

Structure non homogène, sophistiquée et dynamique :

•Amas bactérien de formes variables
« champignons »
•Espaces vides = canaux dans lesquels le liquide
peut circuler : courant.

Hétérogénéité spatiale au sein du biofilm :

•pH, O2, nutriments……

Coopérations métaboliques vitales

Transfert d’information génétique favorisé
 réponse globale
 diversité de niches fonctionnelles et de croissance.
 La formation du biofilm :
La respiration au sein du biofilm

Transcription globale des gènes en fonction de la

concentration en oxygène chez Pseudomonas aeruginosa:

-1
-2

Mol. Microbiol. 65, 2007, 153-165

 La formation du biofilm :
La respiration au sein du biofilm

Epaisseur

Cellules dans le biofilm: marquées GFP.

Cellules mortes marquées en rouge (iodure de propidium).
 La formation du biofilm : L’adhésion
L’adhésion :
•une nécessité
•un processus très spécifique
•du côté de la bactérie, des structures spécialisées : les adhésines
•du côté de la cellule hôte, des récepteurs spécifiques.
 La formation du biofilm : L’adhésion

Passage de la vie planctonique à la vie sédentaire

Adhésion stable à un support :

•Transport à proximité de la surface
•Attachement au substrat
•Résistance au détachement en présence de forces de cisaillement par
des interactions moléculaires

Adhésion cellule/cellule ou cellule/substrat :

•Interactions physicochimiques
•Interactions moléculaires : glycanes/glycanes ou
glycanes/glycoprotéines.
 La formation du biofilm :
Schéma des différentes étapes de formation

Dépôt des éléments nutritifs sur la surface.

Adhérence
transitoire
et réversible
 La formation du biofilm :
Schéma des différentes étapes de formation

1. Attachement initial (t0)

Adhérence transitoire et réversible.

Flagelle
Pili de type IV.
 La formation du biofilm :
Schéma des différentes étapes de formation

2. Attachement définitif (2h à 8h)

Adhérence forte et irréversible

 Couche unicellulaire.

Perte du flagelle
Pili de type IV («Twitching motility»)

Flp
Structures adhésives cellule/surface
Exopolymères.
 La formation du biofilm :
Schéma des différentes étapes de formation

3. 1er stade de maturation (3j)

Nouvelles adhésines (cellule/cellule)
Pluri-stratification cellulaire  Exopolymères.
(10µm) Fimbriae
→Agrégation en microcolonies.

EPS
 La formation du biofilm :
Schéma des différentes étapes de formation

Chapeau

4. 2ème stade de maturation (6j)

Croissance et
Adhesion maturation du Aggregation
Adhesion biofilm Dissemination
transitoire forte et 100µm en du biofilm
et reversible Structure dite en « microcolonies
irreversible champignon ».
Pied
 La formation du biofilm :
Schéma des différentes étapes de formation

5. Dispersion (9 à 12j)
Webb et al., 2003
Altération interne et de Synthèse de novo du flagelle
surface des microcolonies Rhamnolipides.

Dissémination du biofilm →
nouvelle colonisation.
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires

Les systèmes de régulation permettant la formation du biofilm :

Les systèmes à deux composants
Le quorum sensing.

Appendices assemblés à la surface bactérienne :

Flagelle
Pili de type IVa
Nouveaux acteurs constituant fibres homo- et hétéro-polymériques
(pili type IVb, Cup, …).

Élaboration d’une matrice exopolyssacharidique (EPS) :

Alginate et matrices EPS

Protéines secrétées sous forme monomérique :

Two Partner Secretion Systems (TPS).
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - La régulation
Le développement du « phénotype biofilm » résulte d’une activation/répression de
>103 gènes.

Contrôle par des systèmes de régulation.

1. Systèmes classiques : les systèmes à deux composants

•1 senseur (détection d’une molécule spécifique dans le milieu)
•1 régulateur (activé par le senseur).
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - La régulation

2. Le quorum sensing
1 Exploration
•Basé sur le principe de masse critique
•Détection de la densité des cellules en
utilisant des signaux de cellule-à-cellule
dépendant de la taille de la population
Activation des
ex : les N-acyl homoserine lactones 2 gènes d’ adhérence
(AHLs) (adhésine…)

•Quand le signal atteint une certaine

concentration critique, il active un
régulateur transcriptionnel qui induit des
gènes cibles spécifiques 3 Quorum sensing
•La nature et donc la fonction des
molécules signalant les échanges de Facteur sigma contrôlant
cellule-à-cellule changent à partir d'une la transcription
concentration donnée des bactéries.

Production de la matrice
extracellulaire
 Communication intercellulaire ou 4
sociomicrobiologie
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - La régulation
Processus régulés par les Acyl-homoserine lactones

/Dispersal
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Le flagelle

Moyen de locomotion sous forme planctonique

Moyen d’exploration du milieu

Impliqué dans les 1ères étapes d’adhérence.

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Les pili

Pili de type IVa

Pili type IVb, Cup, ….

Fonctions:
•Adhésion et invasion
•Formation biofilm
•Mobilité
•Transport de protéines et d’ADN à travers la membrane.
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Les pili de type IV

•Structures longues et flexibles à la surface des bactéries

•2 types :
• a et b caractérisés par leurs sous-unités pilines

•Fonctions multiples :
• Adhérence
• Mobilité
• Transformation, transduction de phages
• Activation cellules eucaryotes,…

Souche ∆pilA
Souche sauvage

Mobilité par Twitching Mobilité par Swarming

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Les pili de type IVa

•Assemblage par une machinerie dédiée complexe

•Polymérisation d’une sous-unité majeure, la piline

maturée par une prépiline peptidase
ME
•Sécrétion à travers la membrane externe par
une sécrétine

•Energisation du système par 2 ATPases :

MI
•Polymérisation
•Rétractation

•Taille du pilus modulé par la présence de

pseudopilines.
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Comparaison pili de type IVa et IVb

PS Sécrétine ATPase PilC‐like Pilotin? Prépiline Pseudopiline

OM peptidase
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Les pili de type IVb (exemple de Flp)

Présence uniquement chez pathogènes humains:

•Vibrio cholerae
•Escherichia coli entéropathogènes
•Citrobacter rodentium
•Actinobacillus actinomycetemcomitans (plaque
dentaire)
•Pseudomonas aeruginosa (mucoviscidose).

PAO1

Souche sauvage Mutant type IVb

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - Les pili de type IVb (exemple de Flp)

Adhésion à des cellules épithéliales bronchiales.

Actinobacillus actinomycetemcomittans Pseudomonas aeruginosa

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires - L'alginate
EPS riche en acides glucuroniques et manuroniques

Forme un hydrogel

Forme une barrière physique

Produit dans les souches cliniques de P. aeruginosa.

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les systèmes Pel et Psl

Q77 IB64 ID29 IH74 et Q41 2000 pb

PA3064 PA3063 62 PA3061 3060 PA3059 PA3058

pelA pelB pelC pelD pelE pelF pelG

•Riches en glucose Exopolysaccharide PEL

PelA ?
milieu extracellulaire

•EPS entourant bactéries = colle PelC PelA ? Membrane externe

Périplasme
•Implication dans les phases
PelA ?
précoces et la maturation du PelB
biofilm ?
PelD
? ?Membrane Interne
•Permettent une structuration
PelG
complexe du biofilm. PelF
cGMP
PelE

Sucre-NDP Sucre + NDP

? Cytoplasme
accepteur endogène (lipide)
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les fimbriae « Chaperone–Usher » (Cup)
Présents chez de nombreux pathogènes
•E. coli uropathogenes
•P. aeruginosa
•Haemophilus influenza
•Y. pestis
•P. syringae
•Bacillus pseudomallei
Ø : 7 nm, L : 0,3 à 2m
Présence d’adhésine au sommet des fimbriae
Adhérence aux cellules eucaryotes

Fixation glycolipides des cellules du rein

Pyélonéphrites, infections urinaires.

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les fimbriae « Chaperone–Usher » (Cup)

pap operon : I B A H C D J K E F G

Regulation Major Pilus Periplasmic Minor Minor Minor Adhesin

« Usher »
Pilin anchor chaperone pilin pilin pilin

Adhésine
Assemblage dans la membrane externe:
Pilines mineures
•Chaperone périplasmique (boomerang)
•Usher: protéine formant un pore
Piline majeure
Usher
Milliers de SU de pilines

Diversité de formes:
•Gros cylindres en hélice Chaperone
•Fibres fines
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les fimbriae « Chaperone–Usher » (Cup)

pap operon : I B A H C D J K E F G

Regulation Major Pilus Periplasmic Minor Minor Minor Adhesin

« Usher »
Pilin anchor chaperone pilin pilin pilin

Pili de type P Pili de type 1

PapH: fin des pili P par la piline de terminaison PapH

 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les fimbriae « Chaperone–Usher » (Cup)
Cibles de nouvelles molécules anti-bactériennes:
•Efficacité de l’utilisation de FimH comme vaccin (modèles murin et primate)
•Antagonistes chimiques d’infections urinaires:
•Processus d’assemblage
•Reconnaissance de ligands par l’adhésine
•Molécules dérivées de sucre = inhibiteurs compétitifs du récepteur de l’adhésine.
Dérivés de mannosides:
•Bloquent l’adhésion aux cellules uro-épithéliales
•Fixent FimH (affinités nano- et micro-molaires)
•Inhibent internalisation et formation de biofilm.
Dérivés de galabiose:
•Inhibent PapG (faible IC50, micromolaires).
Pyridones bicycliques:
•Bloquent l’assemblage
•Fixent la chaperone PapD (affinités millimolaires).

Pyridone

Chaperone
PapD
Surface d’interaction
avec le usher PapC

- pyridones + pyridones
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les fimbriae « Chaperone–Usher » (Cup)
 La formation du biofilm :
Les acteurs moléculaires – Les protéines monomériques (TPS)

Système de secrétion de Type Vb : tpsB tpsA

•FHA de Bordetella pertussis

•HMW1 d’H. influenzae
2kb

Très grosses protéines (2000-3000 aa)

Secrétées à travers leur propre système de

secrétion

Soit relarguées
Soit restent au contact de la paroi bactérienne

Rôle d’hémagglutinine.
 La formation du biofilm :
Exemple de Pseudomonas aeruginosa
Apport de la génomique sur la connaissance des systèmes macromoléculaires impliqués dans l’adhérence

1999 2007
 La formation du biofilm :
Exemple de Pseudomonas aeruginosa

Systèmes décrits chez P. aeruginosa et leur

implication dans le développement du biofilm

Attachement initial 2ème stade de Dispersion

Attachement 1er stade de
Adhérence maturation Production de molécules
définitif maturation
transitoire et Croissance et oxydantes ou azotantes et de
Adhérence forte et Agrégation
réversible maturation du bactériophages
irréversible en microcolonies
biofilm  Altération interne et de
EPS surface des microcolonies
Fimbriae (conditions anaérobiques )
Flagelle Pili Type IVa Pili Type IVb EPS Dissémination du biofilm →
Fimbriae Lectines nouvelle colonisation
Lectines
Structures adhésives Adhésines Rhamnolipides
Flagelle
(cellule/surface) (cellule/cellule)
EPS
 La formation du biofilm :
Exemple de Pseudomonas aeruginosa
Mobilité Pili IVa-dépendante et structuration en amas multicellulaires dans les biofilms

Mélange 1:1 de P. aeruginosa Mélange 1:1 de P. aeruginosa Mélange 1:1 de P. aeruginosa

PAO1 Yfp et Cfp pilA Yfp et Cfp PAO1 WT Yfp et pilA Cfp

Rôle des pili type IVa dans la structuration des « champignons ».

 La formation du biofilm :
Exemple de Pseudomonas aeruginosa
Rôle du flagelle dans l’adhésion initiale
OUI NON
WT flgK

3h

8h

Milieu citrate

Milieu riche en glucose et

casaminoacides
 Le biofilm : un mode de vie avantageux
Protection des bactéries dans un biofilm :
•Protection passive :
•Protection physique contre la phagocytose
•Protection contre les antibiotiques
 Effet barrière de l’hydrogel

•Protection métabolique
Au sein du biofilm les bactéries sont moins actives
métaboliquement (phase de dormance)

•Protection active
•Activation de certains systèmes de défense (pompes
d’efflux, TolA)

•Protection génétique
•Expression génétique des bactéries modifiée
•L’environnement du biofilm est propice aux échanges
de matériel génétique et permet le transfert de
caractères de résistance

•Existence de persisteurs.
 Le biofilm : un mode de vie avantageux

Vie multicellulaire Matrice extracellulaire

•Communication intercellulaire
•Coopération métabolique
•Favorisation des transferts horizontaux. •Protection vis-à-vis des conditions
environnementales (UV, toxicité
métabolique, pH, déshydratation
et salinité, tolérance aux
antibiotiques pour une
concentration donnée)
•Persistance.
Mise en échec du système
immunitaire.
Les quatre forces conduisant aux biofilms bactériens

Jefferson, 2005.
 Le biofilm : un mode de vie avantageux

Sous forme planctonique, les bactéries :

•peuvent être éliminées par les mécanismes de défense

naturels (anticorps, phagocytes…)
•restent sensibles aux antibiotiques.

 Antibiotiques
Anticorps
Cellules planctoniques
Cellules en biofilm
Enzymes phagocytaires

JW Costerton Science 284, 1999, 1318-1322

 Le biofilm : un mode de vie avantageux

Si les conditions sont réunies, les bactéries peuvent adhérer

entre elles avant d’être éliminées par les systèmes de l’hôte

Elles forment un biofilm notamment sur une surface inerte

Cette communauté, sessile, est résistante aux anticorps, aux

phagocytes et aux antibiotiques.

 Antibiotiques
Anticorps
Cellules planctoniques
Cellules en biofilm
Enzymes phagocytaires

JW Costerton Science 284, 1999, 1318-1322

 Le biofilm : un mode de vie avantageux

Le biofilm étant reconnu comme un corps étranger, la

réponse immunitaire est activée

Les anticorps reconnaissent certains épitopes des bactéries

et des molécules sécrétées (TPS, lectines, Cup, …)

Les phagocytes sont attirés

La phagocytose est inopérante sur le biofilm mais les

enzymes phagocytaires sont libérées localement.

 Antibiotiques
Anticorps
Cellules planctoniques
Cellules en biofilm
Enzymes phagocytaires

JW Costerton Science 284, 1999, 1318-1322

 Le biofilm : un mode de vie avantageux

La réponse immunitaire est inefficace

Les enzymes phagocytaires vont endommager les tissus autour du

biofilm et entraîner une réponse inflammatoire chronique
 Cycle d’autodestruction des tissus

Des bactéries planctoniques vont essaimer du biofilm

Cette libération peut être la cause d’une dissémination de

l’infection et d’une infection aiguë dans un tissu voisin.

 Antibiotiques
Anticorps
Cellules planctoniques
Cellules en biofilm
Enzymes phagocytaires

JW Costerton Science 284, 1999, 1318-1322

Le biofilm et l’Homme : Les infections dues aux biofilms

La plaque dentaire, les caries

Les infections nosocomiales et

les endocardites infectieuses

La mucoviscidose
 Le biofilm et l’Homme : Les infections dues aux biofilms

Les bactéries opportunistes :

•Bactéries commensales (épiderme, muqueuses oropharyngées, muqueuse vaginale,
flore buccale …)
•Affaiblissement
•Intervention médicale
•Acte invasif (chirurgical, toxicomanie)
•Immunodépression (chimiothérapie, leucémie, VIH, …)
•Prolongation de l’acte
•Probabilité de formation d’un biofilm
•Risque de chronicité
•Résistance aux antibiothérapies.

Pathogènes opportunistes les plus fréquents :

•Staphylococcus epidermidis et S. aureus
•Escherichia coli
•Pseudomonas aeruginosa
•Streptococcus suis et S. agalactiae
•Pasteurella multocida et P. haemolytica
•Actinobacillus pleuropneumoniae.
 Le biofilm et l’Homme : Les infections nosocomiales dues à
l’implantation d’un corps étranger

Cathéter (intraveineux, dialyse)

Valve cardiaque
Prothèse
Pacemaker cardiaque
Tube endotrachéal, sonde urinaire

Définition d’une nouvelle pathologie :

« Infection chronique associée à un polymère »

Principalement S. epidermidis et S. aureus

Endocardite infectieuse :
•Greffe d’un agent infectieux sur une valve native ou une prothèse valvulaire
•Soit consécutive à une cardiopathie existante
•Soit iatrogène
•stomatologie (extraction, détartrage, gingivectomie)
•chirurgie cardiaque
•cathétérismes, cathéters à demeure, endoscopies
•Principalement Streptococci et Staphylococci.
 Le biofilm et l’Homme : Les infections nosocomiales dues à
l’implantation d’un corps étranger
Deux étapes dans la formation du biofilm :
•Adhérence multi-factorielle sur une surface solide
•fonction :
•des propriétés physicochimiques du polymère ou du
tissu lésé (hydrophobicité, charge électrostatique)
•des protéines bactériennes et de l’hôte
•Nombreuses adhésines
•Autolysine
• vitronectine
• polystyrène
•FnBPA et FnBPB
• fibronectine
•Cna
• collagène
•ClfA et ClfB
• fibrinogène
• polyéthylène
• polyvinyle
•Adhérence sur les protéines de l’inflammation
•Adhérence sur amas de plaquettes et de fibrines
(cercle vicieux)

•Formation d’un biofilm multi-couche riche en EPS

 Le biofilm et l’Homme : Les caries et la parodontite

Pathogènes les plus fréquents

Caries : S. mutans, S. sobrinus, l. spp
Parodontite : Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis, C. restus,S. intermedius, …

Y. Wang and C. Chen, Gene, 2005

Carie : phénomène ubiquitaire et naturel

Résulte d’un déséquilibre physiologique entre minéralité dentaire et biofilm microbien

Maturation uniquement dans les régions protégées de la bouche

 Bactéries physiologiquement actives

 Respiration anaérobie
 Production d’acides organiques
 Fluctuation du pH
 Déminéralisation des tissus dentaires
(email, dentine, cementum)
 Invasion tubulaire superficielle
 Action des acides et des enzymes protéolytiques
 Formation de tubules.
 Le biofilm et l’Homme : Les caries et la parodontite
Plaque dentaire = biofilm bactérien
AI-2 nécessaire pour :
•métabolisme des sucres
•formation biofilm multi-espèces entre Porphyromonas gingivalis et Streptococcus
gordonii.

Fusobacterium nucleatum :
„organisme-pont“.

Colonisateurs primaires :
Coques et bâtonnets à Gram-
positif.
 Le biofilm et l’Homme : La virulence des E. coli uropathogènes

E. coli uropathogènes (UPEC):

•Responsables d’infections urinaires récurrentes
•Communautés intracellulaires se multipliant dans la lumière de la vessie (gauche, A à C), formant
des structures en gousses de petits pois
•Cellules bactériennes dans une matrice à l’intérieur du cytoplasme de l’hôte (droite, A à E)
•Pas de vésicules membranaires).

Anderson et al. Science 301, 2003, 105.

 Le biofilm et l’Homme : La mucoviscidose

Infections multiples :

•Staphyloccus aureus
•Haemophilus influenzae
•Pseudomonas aeruginosa
•Burkholderia cenocepacia.