UE Bases de la culture cellulaire - Chapitre 2 Serge

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‣ Comptage manuel:

http://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc

‣ Comptage électronique:

Il existe différentes méthodes / machines pour le comptage électronique.

- Paru il y a environ une 10aine d’années. Ressemble à une petite pipette avec un cône spécial. A
chaque fois qu’une cellule passe dans un micro-trou ça crée une variation d’inoédence
proportionnelle à la taille de la cellule. Le résultat apparaît sur l’écran: on a la concentration, le
nombre de tests, le volume cellulaire et le diamètre cellulaire moyen. On obtient une courbe avec
le nombre de test et le diamètre des cellules et le volume cellaire moyen. Le diamètre varie du
simple au double: division des cellules. Différents types de cellules: adherents, celles qui sont
entrain de croitre et celles qui vont se diviser.

- D’autres appareils plus sophistiqués ont vu le jour: le Nucleo Counter. L’appareil est bien
pratique, mais il y a un système de prélèvement à chaque comptage qui coûte 2000-3000 euros
(un peu comme une imprimante: pas cher à l’achat mais cher après). à voir video lien diapo

- Luna Counter: http://mokascience.com/

- Countess II counter: Appareil très complet: fait de la fluorescence grace à des cubes de
fluorescence, du comptage, … En plus on a des résultats chiffrés, des photos des cellules. On a
également du matériel de lame de comptage réutilisable et donc moins de fournitures en dépense.
à voir video lien diapo

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- Corining Cell Counter: Compteur de cellules. Petit appareil, utilisation de notre lame de
comptage classique, compatge très rapide, quelque millier d’euros. à voir video lien diapo

Attention: pour le comptage électronique c’est toujours les personnes qui réalisent le prélèvement de la
suspension de cellules et la mise sur lame de ces cultures. Si le prélèvement est resté sur la paillasse et
que les cellules ont eu le temps de sédimenter, on peut surestimer le comptage (prélèvement en dessous)
ou le sous-estimer (prélèvement au-dessus). Il faut donc que le prélevement pour l’observation soit
homogène. La suspension dans la lame de comptage doit être representative de ce qui se trouve dans
notre milieu de culture.

‣ Culture des cellules adhérentes: (culture 2D):

Les cellules qui adhèrent au support forment une monocouche de cellules qu’il faut alors repiquer lors
de la phase croissance la ou le taux de cellules doublent tous les 20 à 24h.
Combien on va prendre de cellules pour faire une autre boite ? Cela s’appelle le split ratio: c’est le
rapport de la densité de saturation à la vapeur de l’inoculum cellulaire. C’est-à-dire qu’il faut faire le
ratio entre le nombre de cellules qu’il y a et qu’on va mettre dans le repiquage. Si on dilue trop les
cellules ne vont pas repartir et si on ne dilue pas assez le lendemain on peut refaire le travail.
Généralement, le split ratio est autour de 8: avec une boite pleine on peut en faire 8 nouvelles.

Ici lignée de cellules de souris. On peut voir notamment des doublets (celleules qui viennent de se
diviser d’aspect en general arrondis). Une fois leur croissance about it ells s’arrondissent pour se
diviser.

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Protocole de repiquage lorsque les boites sont pleines:

- Les cellules adhèrenet sur le fond de la boite. Il faudra donc les décoller du fond de la boîte. Lavage
des cellules avec un tampon salin, (de la trypsine ou du milieu de culture sans serum ou du PBS).
Milieu sans calcium ni magnesium
- Mise en contact avec de la trypsine, incubation à 37°C, quelques minutes seulement.
- Observation au MO voir si les cellules sont bien arrondis et décollement des cellules par cisaillement
(choc latéral sur le falcon).
- Arrêt de la trypsine par ajout de milieu avec le sérum 10%. Ce serum ammène des antiprotease qui
arête l’action de la trypsine.
- Comptage et répartition dans des nouvelles boîtes ou plaques ou flacon pour refaire des nouvelles
experiences dessus.

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‣ Culture sur microporteurs (microcarriers):

C’est des supports sphériques de petit diamètre sur lesquels les cellules adhèrent.
Permettent l’augmentation de la surface d’adhérence sans avoir à augmenter le volume du milieu.
Les cellules adhèrent sur les billes et non sur le polystyrène. Pratique si on veut les récolter.
Beaucoup sont faites de collagènes.

Conditions:

- Surface suffisante pour loger plusieurs cellules sur les microbilles.

- Charge superficielle autorise l’adhérence.
- Densité des billes voisine de celle du milieu de culture de façon que sous une simple agitation, ils
puissent rester facilement en suspension.
-
Application en thérapie cellaire: cultutre de progéniteur d’oligodendrocyte sur des milieu collagène (milieu
naturel pour la cellule car fait partie de la MEC donc très bien adapter)

‣ Le biréacteur à fibres creuses FiberCell:

Scale-up (100fois permet de gagner de la place) facile des cultures cellulaires pour la production
d’anticorps monoclonaux, de protéines recombinantes, … On a un système de fibres creuses dans
lequel circule le milieu de culture et les cellules sont entre les fibres. On a une petite unité de
production qu’on met directement dans l’incubateur avec les réservoirs, les pompes, …

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La pompe fonctionne et amène des nutriments et de l’oxygène, ça passe dans la cartouche à

l’intérieur des fibres. Entre les fibres on a nos cellules qui produisent des AC (par exemple). On a
deux orifices spéciaux qui permettent d’injecter du média et de récupérer les protéines produites par
les cellules. VIDEO

C’est une culture qui s’apparente à la culture 3D, car entre les fibres les cellules peuvent interagir
entre elles. Il n’y a pas de repiquage de cellules, pas de stress sur les cellules et peu d’entretien. On a
des petits volumes de récoltes et donc c’est un produit qui est plus propre et plus concentré. On fait
de grosses économies sur les milieux de culture.

‣ Culture en suspension en milieu liquide:

- Pour certaines cellules non adhérentes comme les cellules hématopoïétiques (lymphocytes, cellules
lymphoblastoïdes, cellules leucémiques, hybridomes).
- Multiplication cellulaire indépendante de l’ancrage au support et donc de la surface disponible.
- Haute densité cellulaire (6 à 7 fois 10 puissance 6 cellules/mL en grand volumes sous agitation).
Nécessite de fournir à ces cellules un milieu plus riche en nutriment

Conditions:

- Milieu appauvri en calcium.

- Support peu adhérent.
- Milieu riche en nutriments car densité élevée de cellules.
- Repiquage par simple dilution d’un aliquote. Pas besoin d’un milieu trypsine

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‣ La culture 3D:

Jusqu’à présent, on avait parlé de la culture en 2D: les cellules adhèrent sur une surface plate. Le
problème c’est qu’on est loin des conditions physiologiques où les cellules interagissent de façon
beaucoup plus complexe. Il y a alors eu des travaux sur des systèmes avec des gels 3D pour que les
cellules en culture aient des conformations beaucoup plus proches de la réalité.

Matrice 3 D en polystyrene à voir video diapo

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‣ La culture 3D appliquées à l’étude des tumeurs in vitro:

Quand on regarde in vivo le micro environnement d’une tumeur, elles sont très mal vascularisées du
moins au début. Lorsqu’on cultive les cellules avec un système classique, elles sont trop bien
oxygénées, même plus oxygéné que les cellule sen contact du capillaire. Système classique = pas la
réalité. HIF1 = facteur induit par hypoxie. Quand on s’éloigne du capillair l’accès à l’oxygène va
baisser mais expression plus forte de HIF1 et donc angiogénèse.

‣ Différentes méthodes pour obtenir un amas de cellules:

Technique utilisant plaque 96 puits en V ou en U = techniqye de la gouttes suspendues avec les cellules mises
dans les puits, ells seront collées les unes aux autres et vint faire des amats.
Autres technique: cellules dans du gel à formation d’amats régulier
Autre technique à détachement de la plaque. Lors du détachement ells vont se coller et former des amats
Autre technique : chambre à oxygène à mieux que les incubateurs car plus proche des codnition physio poyr que
les cellules restent coller les unes aux autres. lLes cellules centrales de ces amats auront un moins bon accès a
l’O2 et aux nutriments donc bon modèle pour étidier les cellules tumorales.

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‣ Application de la culture 3D:

Reconstitution d’un pavillon d’oreille.

- En 2013: Grâce à une imprimante 3D, un moule a été créé. On injecte dans ce moule du collagène
récolté à partir de queue de rat et combiné avec des cellules de cartilage recueillies auprès
d’oreilles de vaches pour former un hydrogel. Le collagène a servi d’échafaudage sur lequel les
cellules du cartilage ont pu s’installer et se developer et proliférer.
- En 2018: Toujours grâce aux imprimantes 3D. Le moule est un hydrogel. On laisse pousser les
cellules in vitro, lorsque l’oreille est assez rigide et que les cellules ont envahi la matrice, on peut
ré-implanter le pavillon d’oreille.

a. Enrichissement et clonage:

‣ Enrichissement:

Enrichir, c’est augmenter la proportion d’un type cellulaire donné dans une population. On a un
mélange de cellules et on veut enrichir une population pour pouvoir la clonner.

Pour enrichir, on va utiliser les différentes propriétés des cellules:

- La taille et la densité (centrifugation, élutriation, cytométrie).

- La capacité d’adhérer des cellules
- L’expression des marqueurs de surface (Ac sur billes magnétiques, cytométrie).

‣ La séparation par sédimentation ou centrifugation:

On met des cellules dans un milieu. Elles seront soumises à une force centrifuge et à la poussée
d’Archimède. La poussée d’Archimède dépend de la densité du milieu, de l’apesanteur et du volume
de la particule et la force d’Archimède est mesuré. La force centrifuge dépend du volume et de la
densité de la particule et de la gravité. Il en résulte donc deux forces (la force centrifuge sera plus
forte que la poussée d’Archimède). Les cellules auront tendance à descendre.

De plus, la densité des cellules est souvent supérieure à la densité du milieu, même si on ne
centrifuge pas la cellule aura tendance à descender au fond du tube. En centrifugent, on va accélérer
la vitesse avec laquelle la cellule va rejoindre le fond du tube.

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Exemple: vitesse de sédimentation des cellules sanguines (dépendnet de la densité):

Séparation des cellules sanguines par Buffy-Coat:

On prend un mélange de cellules sanguines chez une patiente sous héparine. On centrifuge: les
globules rouges vont descendre plus rapidement. On va alors obtenir: sur le dessus le plasma
mélangé aux plaquettes, puis notre Buffy-Coat contenant les neutrophiles / monocytes /
lymphocytes, et enfin en bas les globules rouges.

Séparation des cellules sanguines sur coussin de Ficoll:

Utilisation du Ficoll, un espèce de coussinet qui a une densité de 1,077. Densité choisie pour
qu’elle soit supérieure à celle des lymphocytes, monocytes et des plaquettes. On obtient une
petite couche avec les lymphocytes et monocytes (W). Permet de mieux séparer les éléments
qu’une centrifugation classique. Anneau blanc qui contient lympho e mono.

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Séparation des cellules sur gradient de Percoll:

Billes de différentes densité utilisées. Selon le gradient utilisé de Percoll, on peut obtenir des
séparations différentes. Très fastidieux car ce gradient s’établit à ultra haute centrifugation. Moins
utilisé.

Séparation des cellules sanguines par élutriation:

è Technique appliquée à la préparation de grandes quantités de cellules.
Dans les années 90, mise au point d’un système de séparation des monocytes et lymphocytes dans
le but de travailler sur l’immunothérapie adoptive. Permet d’obtenir une très grande quantité de
monocytes qui sont ensuite cultivés et différenciés pour être réinjectés au patient.

On va tout d’abord faire une cytaphérèse, qui consiste à récupérer les lympho et mono en très
grande quantité. On ré-injecte au patient les GR. On obtient des poches qui sont très riches mais
qui contiennent toujours quelques neutro, GR et plaquettes. Pas encore suffisamment pur pour
travailler.

On va donc utiliser une pompe qui injecte ces cellules directement dans la poche qui sont dans un
rotor qui se trouve dans une centrifugeuse. Elles vont être soumises à 2 forces: centrifuge et celle
de la pompe. A la sortie du rotor cela nous permet, grâce à différentes poches, de séparer les
différentes cellules et les obtenir avec des puretés de 99%.

On fait varier le débit de la pompe et donc la force de flux. On démarre à un petit débit :
plaquettes qui vont être poussées plus fort et qui vont s’éliminer. On va progressivement
augmenter le débit de la pompe pour faire sortir les plus gros éléments car c’est le diamètre de la
cellule qui va compter. L’ordre de sortie est donc: plaquette, GR, lym, neutro, mono.

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‣ Séparation par adhérence:

Pour séparer:
- Les macrophages qui adhèrent rapidement des lymphocytes qui n’adhèrent pas rapidement. On
les met ensemble dans une boîte de pétri, on les laisse ensemble à 37° un temps pas trop long
(1h), on récupère les cellules qui adhèrent après rinçage. On peut également récupérer les cellules
qui n’ont pas adhérées dans le liquide de rinçage.
- Les cellules satellites musculaires / fibroblastes.
- Les cellules en mitoses.
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‣ Autres méthodes de purification:

- Ac sur billes magnétiques:

On a notre mélange de cellules, on le met en contact avec des AC. Ils sont couplés à une bille
magnétique. On les fait passer dans une colonne qui se trouve entouré d’un aimant. Les billes
magnétiques sont arrêtées par un aimant, le reste va traverser. Il suffit de changer le tube et
d’enlever l’aimant pour récupérer nos cellules.

- Milieu sélectif : le cas des cellules transfectées:

On a le gène qui est inséré mais aussi un gène de sélection qui est implanté (ex: gène de
résistance à la gentamicine). On le met dans un milieu de sélection pour récupérer les cellules qui
continuent ce gene qui vont résister.

‣ Le clonage:
Cloner c’est recueillir la descendance d’un organisme unique ou d’une cellule unique.
On peut isoler les cellules avec les techniques:
- Manuelle: dilution limite.
- De cytométrie en flux.
- Du tri de cellules grâce à un champ électromagnétique.

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‣ La technique manuelle: dilution limite:

On prend notre suspension cellulaire et on fait des dilutions jusqu’à ce que les cellules soient
tellement diluées que lorsqu’on prend 100 microL on ait peu de chance d’avoir 2 cellules. On a plus
de chance d’avoir des puits vides que des puits avec deux cellules.

Quand on arrive à cette dilution, on remplit nos plaques à 96 puits. On peut alors regarder notre
plaque au microscope inversé et parcourir tous les puits. Si on a des puits avec 2 cellules, on aspire le
contenu et on recommence.

On les met ensuite en culture dans un milieu spécial. Au bout d’un certain temps, on a différents
clones qu’on peut alors transférer dans des boîtes plus grandes et ensuite les amplifier.

‣ La cytométrie en flux:

Fonctionne à l’aide d’une chambre de flux, les cellules y sont injectées. Il y aune source laser. Elles
vont passer par un orifice de 70-100 micron. Il y a un système de circulation de tampons ce qui fait
que les cellules passent les unes derrière les autres. Elles sont frappées par un faisceau laser, ce qui
nous renseigne sur leurs caractéristiques. Notre chambre de flux est couplée à un piezomètre (un
vibrateur ultrasonique) qui va permettre de fractionner notre gel en sortie de chambre en micro
gouttes (25 000 micro-gouttes par secondes) . Ces microgouttes vont nous permettre de trier les
cellules. La lumière déviée à 90 degrés va nous renseigner sur la structure de la cellule. Si la
fluorescence est émise elle sera émise à 90 degrés et analyser à un photomultiplicateur.

Un cytomètre en flux nécessite:

- De la fluidique: pour introduire et canaliser les cellules.
- De l’optique: une source d’excitation et de récupération des signaux émis.
- De l’électronique: pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques
proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

Si des fluorochromes ont été associés à la cellule, il y a émission de fluorescence à condition qu’ils
soient excitables à la longueur d’onde du laser. (En bleu = lié à la structure de la cellule)

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Les photomultiplicateurs vont recevoir des photons et les transformer en électron et en signal. Mais
ils ne sont pas capables de faire la différence entre les couleurs. Avant que la lumière arrive sur ces
photomultiplicateurs, il faut séparer les différentes longueurs d’onde avec des filtres. Filtres dichroic
qui par exemple vont laisser passer la lumière au dessus de 500 nm : le bleu est à 488nm, il va
rebondir sur le filtre pour arriver au PMT1.

On reçoit des photons qui sont transformés en signaux électroniques entre 0 et 10 volt. Echelle en
Volt transféré en canaux. On obtient un histogramme mono-paramétrique avec le nombre de cellules
et l’intensité du signal. On peut également faire un double marquage (apparition d’un cytogramme)
avec l’intensité du signal 1 et 2 (cellules que rouges, que vertes, rouges et vertes, ni vertes ni rouges).

On peut appeler ces appareils des FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting. Ils sont capables de
trier les cellules grâce à la fluorescence. Comme dit précédemment: on a une chambre de flux, un jet,
un laser qui interagit avec les cellules et émettent différentes couleurs. La lumière va nous rensiegner
le FALS sensor sur la taille de la cellule.

On a un vibrateur ultrasonique avec une vraie caméra qui filme le jet. Il va permettre le
fractionnement du jet en micro-gouttes. Il le faut qu’on ait un jet discontinue si on veut trier nos
cellules.

Comment ça fonctionne ? Une cellule arrive, elle passe devant le faisceau laser et émet de la
fluorescence. Si cette cellule nous intéresse, on va charger le jet positivement ou négativement. Si
on charge positivement le jet, la cellule va se retrouver prisonnière d’une goutte chargée + lorsque le
jet va se fractionner. Cette goutte passera ensuite dans un champ de courant et sera déviée vers le - .

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Comment on arrive à faire ça ? Notre cellule émet de la fluorescence dans le rouge (par exemple).
Elle nous intéresse, on veut garder cette cellule. On a un certain temps entre le moment où la cellule
est passée devant le faisceau laser et le moment où elle va se retrouver dans la dernière goutte
accrochée au jet: c’est le drop délai. Généralement, il est inférieur à une milliseconde, mais en
informatique c’est déjà énorme. Le temps que la cellule arrive à la dernière goutte, on va envoyer un
signal de charge positive. La goutte qui va se décrocher va donc être chargée positivement et déviée.

On peut trier les couleurs en les chargeant positivement ou négativement et les diriger vers différents
tubes. à voir le film sur le dia.

‣ Champ électromagnétique:
Appareil beaucoup plus moderne, il ressemble à un immense frigo. On a des petites puces qui nous
permettent de trier les cellules grâce à un champ électromagnétique.
On injecte au maximum 100 000 cellules dans ces puces. Elles sont soumises à un champ
électromagnétique et se placent à un endroit bien particulier. Ensuite, grâce à la fluorescence, on va
détecter les cellules qui nous intéressent. L’appareil va ensuite calculer un chemin de sortie. C’est la
cage électromagnétique qui va guider la cellule vers la sortie. Elle arrive dans un flux, ce qui nous
permet de la collecter. Très cher, environ 300 000 à 400 000 euros

b. La microscopie confocale:

C’est un microscope particulier couplé à un faisceau laser. On a un système de micro-trous qui nous permet
de regarder comme dans un scanner, mais ici avec la fluorescence. On découpe nos cellules en couches
trees peu épaisse qui sont ensuite assemblées par l’ordinateur = vision 3D de la fluorescence dans la
cellule.

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Exemple de marquage ci-dessus observable dans le visible en gris. Rouge: marquage de l’anti-actine du cortex
cellulaire. En bleu : DAPI qui montre l’AND des cellules. Vert: fluoresceine qui montre marquage avec des AC
contre trypanosome. L’info génétique est dans la cellule. Avec un confocale on peut bouger toute les cellules pour
mieux observer.
c. Contrôle des lignées cellulaires:

Afin d’être sûr qu’il n’y a pas de dérivés des cellules en culture.On a vuq que des cellules non transfomé Il
s’agit ici de vérifier la répétabilité des paramètres de croissance d’une subculture à l’autre.

- Les dérivés généralement observées dans le cas d’une lignée finie:

Au fur et à mesure que l’on se rapproche de la phase III, le % de métaphases hyperploides et surtout
hypoploides augmente. Quelquefois on observe même des populations tétraploïdes (la quantité d’ADN
dans les cellules a doublée).

- Les dérivés dans le cas d’une lignée indéfinie (lignée les plus utilisées dans les labo):
Après de nombreux passages, on observe la disparition systématique d’un chromosome ou d’une paire
de chromosomes. La cellule va perdre de l’information génétique, ça ne sera plus la même cellule. Elle
pourra alors réagir différemment et affecter nos résultats.

‣ Contrôle morphologique:

On fait des contrôles morphologiques tous les jours lorsque l’on regarde nos cellules au microscope.
Observation des changements morphologiques des cellules au cours des passages. Exemple:
changement de la taille des noyaux. Si on veut avoir plus d’informations sur le noyau on peut faire des
coloration (Hoechst, coloration MGG, …).

‣ Contrôle des caractéristiques de croissance:

Le nombre de cellules totales N après n générations s’écrit: N = N0*2n (c’est quelque chose qui doit
être reproductible)
N0 est le nombre de cellules initialement ensemencées.
Cette formule doit être reproductible.

De même pour la courbe de croissance où, le temps de latence/ la phase exponentielle/ le temps de
doublement/ la densité de population/ vieillissement de la population, sont des paramètres qui doivent
être répétables. Ce sont des choses qui doivent être reproductibles. La connaissance de ces paramètres
permet de déterminer la durée d’incubation d’une subculture et le split ratio.

‣ Contrôle par analyse cytogénétique des cellules car les cellules peuvent perdre le
contrôle génétique:
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Les cellules peuvent perdre ou gagner de l’information génétique, les contrôles par analyse
cytogénétique des cellules s’imposent.

‣ Suivi du caryotype des cellules:

On va prendre des cellules qui sont en pleine division avec des chromosomes condensés pour voir
s’il y a des anomalies et également pour pouvoir les compter. Cela permet aussi de determiner les
espèces animals.

Intérêt: déceler les anomalies et déterminer l’espèce animale. Toutes les espèces n’ont pas le même
nombre de chromosomes: souris - 40, taureau et chèvre - 60.

Exemple de la lignée Mono Mac 6 humaine et du NO:

Ils pensaient avoir trouvé la sécrétion de NO par les cellules de lignée Mono Mac 6 chez les
humains. Lorsqu’ils ont observé le caryotype, il y avait 46 chromosomes. Ils pensaient travailler
avec une lignée humaine, mais en faite ils travaillaient avec une lignée de souris. Attention car
chèvre et taureau ont le même nombre de chromosome.

Le caryotype humain:

Pour faire un caryotype humain, il faut tout d’abord cultiver des cellules. On fait une prise de sang,
on cultive les lymphocytes. On part de 7 gouttes de sang, que l’on met dans un milieu de culture
classique avec du sérum. On y ajoute de la phytohémagglutinine A pour que les lymphocytes se
divisent. Après 3 jours, on fait agir la colchicine qui va bloquer les fuseaux mitotiques, ce qui nous
permet d’accumuler les cellules en métaphase.
Un choc hypotonique nous permet de nous débarrasser des globules rouges. On pourra alors fixer,
puis centrifuger nos cellules. On place une goutte sur notre lame pour obtenir des étalements. Nos
chromosomes sont découpés et classés par paire du plus grand au plus petit.
On verra donc les variation chromosique.
Généralement lorsqu’on fait un caryotype humain, pour pouvoir bien les reconnaître, on fait un
traitement pour faire apparaître les zones claires et sombres = branding.

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‣ Analyse cytogénétique par cytométrie:

Beaucoup plus court que le suivi du caryotype. On va mettre un fluorochrome d’affinité (l’iodure de
propidium = agent intercalant de l’ADN) en contact de nos cellules. C’est un agent intercalant, il va
se mettre dans l’ADN. On aura une fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN dans la cellule.

On a une population qui se multiplie et donc un profil à deux pics de fluorescence: un qui correspond
aux cellules en G1 qui sont prédominantes qui ont une quantité d’ADN 2n et l’autre pic qui
correspond aux cellules G2+M qui ont une quantité de 4n. On arrive pas a faire distinction entre G2
et M car la quantité d’AND dans la cellules est la même, c’est juste la repartition de l’AND dans la
cellule qui n’est pas la même.

- Discrimination des doublets:

Parfois on peut avoir des doublets. Ce sont des cellules diploïdes qui adhèrent entre elles. On aura
un temps de passage qui est double quand un doublet passe, mais une intensité de fluorescence
égale à celle d’une seule cellule. La surface du pic reste la même. Diff entre cellule 4n et doublet :
temps de passage.

- Modèles mathématiques:
Si on veut connaître le nombre de cellules qui sont en G0/G1, en phase S et en G2+M, on est un
peu embêté car les piques se chevauchent. Il y a des modèles mathématiques qui ont été
développés pour contrer ce problème qui reposent sur les surfaces (Modèle de Baisch).

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Cette surface correspond aux cellules qui sont en phase S.

- Marquage spécifique de la phase S:

On peut aussi avoir des marquages plus précis de la phase S en faisant un double marquage.

On fait un marquage à l’iodure de propidium qui va nous donner la quantité d’ADN. On aura une
fluorescence rouge.

Avant de mettre nos cellules dans le cytomètre, on peut mettre les cellules en contact avec un
analogue de la thymidine: le BromoDeoxyUridine. Ce BrdUrd va s’intégrer dans l’ADN qui est
en synthèse. On laisse uniquement 30 minutes sinon les cellules en phase S vont passer en G2. On
va faire agir des anticorps anti-BrdUrd couplé à un fluorochrome qui fluorescent dans le vert
(thionosanatte de fluoresceine) pour repéréer les complexe immune repréant les cellules en phase
S. On pourra alors délimiter des zones, chaque point correspond à une cellule.

- Index d’ADN ou index de ploïdie pour voir si les cellules qu’on cultive n’ont pas été modifié
compare à des cellules contrôles:

On va regarder à quel canal sort le pic de nos cellules et le comparer au pic moyen de cellules
contrôles. On va faire le rapport entre les deux pour nous donner un index de ploïdie.

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Contenu normal en ADN = ADN-diploïde.

Présence d’un seul pic G0/G1. L’IP = 1.
Les deux pics se superposent.

Contenu anormal en ADN = ADN-aneuploïde.

Présence au moins d’un pic G0/G1 dont l’IP est différent de 1.
Différents cas d’aneuploidie: hypodiploidie (perte de chromosomes), tétraploidie (quantité
d’ADN a doublé), mutiploidie (quantités d’ADN différentes).

‣ Pouvoir tumorigène:
On peut également voir si les cellules ont un pouvoir tumorigène. Injection de cellules à un animal
pour voir s’il développe une tumeur.

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