TRAVAUX PRATIQUES INTÉGRÉS

LABO – 0431 – A-a

COURS DU 15 FÉVRIER 2021

Thème de recherche : la transition épithélio-
mésenchymateuse.

Il s’agit d’une cellule épithéliale qui se déguise en fibroblaste.

Au cours de la formation d’une tumeur, des cellules se
prolifèrent et se différencient avec une déstructuration du
tissu. On passe d’un carcinome local à un carcinome invasif à
switch
Carcinome = cancer épithéliale, des cellules épithéliales
subissent le phénomène d’EMT : elles perdent leurs
caractéristiques épithéliales et obtiennent des caractéristiques
fibroblastes.
- Tissus : Les fibroblastes sont libres tandis que les cellules
épithéliales sont adhésives.
- Niveau cellulaire : La E-cadérine est un marqueur des
cellules épithéliales. La fibronectine et la vimentine sont
des marqueurs des cellules fibroblastiques. La vimentine
est un filament intermédiaire du cytosquelette qui est
exprimée par les cellules mésenchymateuses (notamment
fibroblaste)

Lors d’une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), il y

a formation de métastases. On passe d’un état avec des
cellules cohésives et polarisées, cubiques à des cellules
fusiformes avec une polarisation antéro-postérieure. Les
cellules épithéliales migrent peu, les mésenchymateuses ont
plus tendance à migrer.

ATTENTION : ce n’est pas une cellule épithéliale qui devient

un fibroblaste mais plutôt c’est un déguisement partiel, la
cellule perd des caractéristiques épithéliales mais gagnent des
caractéristiques fibroblastiques, on est un peu entre les deux
types de cellules, c’est ça qui est difficile.

On cherche à montrer que la cellule perd des caractéristiques

épithéliales mais gagnent des caractéristiques fibroblastiques
sachant qu’on se situe dans un tissu où il y a à la fois des
cellules fibroblastes et épithéliales.

Cette transition est permise par des facteurs de transcription

qui font que la cellule exprime toute une série de marqueurs.
Toutes les cellules n’acquièrent pas toutes les propriétés, on
peut avoir des choses intermédiaires.

3 questions :
1) Comment pourriez-vous expliquer la perte de la
cadhérine E à la surface des cellules en cours d’EMT ?
• Endocytose : la E-cad peut être endocytosé et dégrader
• Mutation du gène qui fait que l’exportation de l’E-cad à
la surface n’est pas bonne
2) Comment pouvez-vous mettre en évidence la perte de la
cadhérine E dans des cellules ou dans un tissu ?

3) Comment peut-on mesurer le potentiel migratoire d’une

lignée cellules ?
• Scratch essay : monocouche de cellules, on fait une
 cicatrice

Article sur nanos3 : est-il possible de conclure que vu

l’augmentation de la production de NANOS3 dans les cancers,
ce NANOS est impliqué dans la cancérogénèse et donc il est
intéressant comme cible thérapeutique potentiel ?
• Testicule comme contrôle positif : le testicule exprime
nanos 3 de façon physiologique, le contrôle + permet
d’être sure qu’on colore nanos 3. C’est une vérification
de l’anticorps.

Pour faire un WB, il faut une bonne quantité d’échantillon

contrairement à la RT-PCR, où un peu d’échantillon suffit.

Chambre de Boyden est un test de migration très important.

On a un insert qu’on place dans un puit d’une plaque de
culture cellulaire. Il y a un filtre avec des trous qui laissent
passer une certaine taille de cellules. Ces cellules n’ont
tendance à passer par les trous que s’il y a quelque chose qui
les attirent en dessous. Pour ce faire, on utilise un
chémoattractant soluble que l’on met dans l’eau en dessous.
Est-ce que ce test apporte un avantage supplémentaire ou
non que le scratch essay ?
Est-ce que NANOS est impliqué dans la migration
cellulaire ? si oui comment le démontrer ?

QUESTIONS :
1. Comment pourriez-vous expliquer la perte de la
cadhérine E à la surface des cellules en cours d’EMT ?
2. Comment pouvez-vous mettre en évidence la perte de la
cadhérine E dans des cellules ou dans un tissu ?
3. Peut-on observer l’EMT/MET in vitro, en culture ? la
 culture sur plastique est-elle sufissament fiable
4. Sur base des données présentées ici, puvez-vous conclure
que Nanos est une cible thérapeutique potentielle ?
5. Comment peut-on mesurer le potentiel migratoire d’une
lignée cellules ?

COURS 23 FÉVRIER
1) Comment pourriez-vous expliquer la perte de E cadhérines à la surface des cellules en cours
d’EMT ? Comment pourriez-vous vérifier vos hypothèses ?
La première hypothèse est la suivante : c’est une modulation
au niveau transcriptionnelle. Pour mettre en lumière le
pourvoir transcriptionnelle, on peut faire une RT-PCR, pour
aller voir des cellules qu’on suspecte d’avoir subi la EMT. On
peut faire une q-RT-PCR pour être quantitatif. Pour les
contrôles, on utilise des gènes domestiques (GAPDH), il faut
être sûr que dans le processus étudié, l’expression du gène
domestique n’est pas modifiée.

2 hypothèse : on perd la protéine à la surface car elle peut être

e

dégradée très rapidement. C’est un processus de dégradation

soit à l’intérieur de la cellule soit un processus à la surface de
la cellule. Comment savoir si en IHC on est dans la cellule ou
à l’intérieur de la cellule, on marque les membranes. Sur une
culture, on peut voir si la protéine est à la surface ou pas, en
utilisant un perméabilisateur ou pas, l’anticorps peut pénétrer
le tissu.
Microscope confocal : microscope sophistiqué qui permet de
regarder le marquage tranches par tranches. On marque le
noyau, et on se met sur une tranche ou je vois bien le
marquage du noyau.
Quelle technique permet d’analyser des cellules en suspension
pour voir ce qui est membranaire et ce qui n’est pas ? la
cytométrie de flux (FACS). Si on ne perméabilise pas les
cellules, on aura juste un marquage membranaire.
L’inconvénient du FAX est qu’il faut détacher les cellules.
Cependant en les détachant, il faut les trypsiniser. La trypsine
dégrade les protéines donc elle peut dégrader les E-cadhérines.
Il faut donc réaliser des contrôles qui sont très importants dans
ce genre de situation. Pour travailler plus en douceur, on peut
utiliser l’EDTA.

Si la E-cadhérine est dégradé à la surface de la cellule, elle

peut être dégradée par endocytose par internalisation puis elle
peut être dégrader. Ce qui dégrade les protéines à l’intérieur de
la cellule ce sont les lysosomes ou le protéasome. Comment
déterminer qui fait quoi ? on utilise des inhibiteurs soit de
l’une soit de l’autre. La chloroquine inhibe les lysosomes en
empêchant leur acidification.

Sheding : décapage où les enzymes clivent à la surface de la

cellule.

2) Comment pourriez-vous mettre en évidence la perte des E cadhérines dans des cellules ou dans un
tissu ?
- IHC
- WB où on peut voir une diminution sachant que la
sensibilité de la technique pose problème. Dans un tissu,
il y a des fibroblastes, de la MEC, …. Et nous on veut
voir si il y a une diminution minime. On peut donc avoir
un faux positif car le phénomène est faible par rapport à
tout ce qui se trouve dans la cellule.

Est-ce qu’il y a plus de risque de faux positifs en IHC qu’en

WB ? en WB, on peut vérifier grâce à l’échelle de poids
 moléculaire. Si le poids moléculaire est plus faible que celui
attendu, on peut imaginer que la protéine se soit faite cliver,
il y a tout de même peu de chance que cela soit un clivage
complet.
Dans les IHC, il y a beaucoup de faux positifs. La
localisation de la protéine doit être vérifiée.

3) Sur base des données présentées ici, pouvez-vous conclure de Nanos3 est une cible thérapeutique
potentielle ?
Le fait que soit présent dans la tumeur secondaire mais pas
primaire montre que les cellules extrement agressive, cela
pourrait ainsi constituer une cible.
Pour savoir si c’est une cible potentielle, on doit réaliser des
études fonctionnelles.

4) Quelles informations donne le « scratch assay » ou « wound healing assay » par rapport à la
chambre de Boyden ?
Dans la chambre de Boyden, il n’est pas possible de suivre
les cellules par rapport au temps. on peut voir la façon dont
elle migre.
Dans le scratch les cellules doivent être en 2D. Or une
tumeur est plutôt une boule. On va donc faire des
sphéroïdes pour étudier ces boules.
On peut bloquer la prolifération cellulaire en utilisant la
mitomycine C qui va inhiber la prolifération.
La cellule tumorale doit répondre à des chémoattraquants.
Elle ne va pas migrer n’importe comment.
Pour qu’elles puissent migrer, les cellules doit avoir des
microtubules et des filaments intermédiaires.

La chambre de boyden permet de savoir si c’est la réponse

de la motilité en réponse à un chémoattractant.
Le stratch est un test rapide mais pas complétement fiable.
5) Quelle quantité de matériel serait nécessaire pour un Western versus RT-PCR ?
Cela dépend en fonction de kit, et du tissu. On a moins
besoin de quantité d’ARN pour faire un RT-PCR que de
protéines pour faire du WB.
• WB : entre 10 et 250 mg de tissus pour obtenir
suffisamment de protéines pour faire un WB
• RT-PCR : ….

6) Dans ce même article, les auteurs présentent des résultats indiquant une corrélation entre la
migration des cellules et l’expression de Nanos3 dans différentes lignées. Comment pouvez-vous
montrer l’implication de Nanos3 dans la migration des cellules ?
On prend un siARN qui vont bloquer l’expression du gène
nanos3. Pour les contrôles, on doit vérifier que. Le siRNA
n’inhibe que NANOS-3 et pas d’autres gènes impliqués
dans la migration cellulaire. Il faut vérifier que les
conditions de transfection n’effectent pas les propriétés des
cellules. Les siARN réduisent l’expression du gène de façon
transitoire.
Pour diminuer la production d’une protéine de façon
permanente, on peut utiliser des souris knock out pour
NANOS3 ou on prend des cellules de souris knock out et
les rendre tumorigène.

La transfection transitoire fait que le matériel génétique du

vecteur reste dans le cytoplasme, puis au bout d’un temps
disparaît. La transfection permanente fait que le génome du
vecteur va dans le noyau et intègre le génome.

Pour travailler avec des clones, on ne peut pas travailler

avec un seul clone parce que il se peut que par hasard
l’ADN a été se mettre à côté d’un gène qui module la
migration, alors on ne peut pas se fier au résultat. Il faut
donc travailler avec plusieurs clones.
 On peut aussi travailler avec des populations de cellules
mais leur inconvénient est que l’expression des gènes est
variable d’une cellule à une autre. La population ne cesse
d’évoluer. Par exemple, il est possible que l’expression de
NANOS-3 disparaissent dans une population au cours du
temps (problème lors d’un doctorat).

Il est possible d’utiliser un promoteur inductible.

7) Peut-on extrapoler les données obtenues in vitro à un comportement cellulaire in vivo ?

Comment suivre une cellule in vivo ? on peut utiliser la
luciférase dans la tumeur primaire. Au cours du temps, on
peut voir apparaitre des métastases partout dans la souris.
Dans cette technique, la sensibilité n’est pas toujours top.
On doit toujours valider par de l’histologie.

Une autre technique, in vivo, est d’utiliser des souris knock

out nanos et induire une tumeur de façon transgénique et
voir si il y a quelques choses qui se passe.
HEMMER MARINE – TP INTÉGRÉS