Université L’arbi Ben M’hidi, Oum El-Bouaghi - Département SNV

2ème année LMD - Matière : Microbiologie

TD 4 : Estimation de la croissance bactérienne

La mesure de la croissance bactérienne consiste à estimer, à un moment donnée ou en cinétique de temps, la
population bactérienne ou sa biomasse. Différentes méthodes de dénombrement des cellules ou d’estimation de la
biomasse cellulaire sont utilisées.

1. Les mesures directes

1.1. Les méthodes de comptage des cellules totales

Le nombre de cellule dans une population peut être mesuré par comptage au microscope (appelé comptage
microscopique direct). Des lames spéciales appelées cellules de comptage ou chambres de comptage sont
utilisées. C’est l’exemple des cellules de Petroff-Hausser. Une grille est gravée à la surface de ces lames de façon
à définir des carrés de taille connue. Le volume au-dessus de chacun de ces carrés est très faible mais mesuré et
connu de façon précise. Le nombre de cellule par unité de surface de la grille peut être déterminé au microscope ce
qui donne une mesure du nombre de cellules par unité de volume contenu dans le liquide présent au-dessus des
carrés. La valeur obtenue est convertie en nombre de cellule par millilitre de suspension cellulaire en prenant en
compte un facteur de conversion dépendant du volume de la cellule de comptage.

Figure 01 : Schéma d’une chambre de comptage de Petroff-Hausser.

La chambre de comptage de Petroff-Hausser contient 25 carrées couvrant une surface de 1 mm2. La chambre
a une profondeur de 0,02 mm.

Ce type de comptage est une méthode rapide d’estimation du nombre de cellules d’un échantillon.
Néanmoins, elle présente des limites :

 Les cellules mortes ne sont pas différenciées des cellules vivantes ;

 Les cellules les plus petites sont difficiles à voir au microscope ;
 Une bonne précision est difficile à obtenir ;
 Elle n’est pas applicable pour des échantillons de faible densité cellulaire ;
 Les cellules mobiles doivent être immobilisées avant le comptage.

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1.2. Les méthodes de comptage des cellules viables

Le comptage des cellules viables le plus couramment utilisé est celui qui consiste à déterminer le nombre des
cellules d’un échantillon capable de former des colonies sur un milieu de culture solide approprié, c’est le
comptage sur boite. Il existe deux techniques principales pour effectuer un dénombrement en milieu solide :
l’ensemencement par étalement (par râteau) et l’ensemencement en masse (voir TP 2). Quelle que soit la méthode
utilisée pour le comptage sur boite, il faut que le nombre de colonies qui se développent sur les boites ne soit pas ni
trop élevé, ni trop faible. Dans la pratique, le meilleur résultat est statistiquement obtenu pour des boites
comprenant entre 30 et 300 colonies. Afin d’obtenir un nombre de colonies significatif (entre 30 et 300 colonies),
l’échantillon doit presque systématiquement être dilué. Les résultats des dénombrements sur boites sont exprimés
en unité formant colonies (UFC) par millilitre de l’échantillon (UFC/mL) de la façon suivante :

Nbre total de germes = [(nbre de colonies dans boite 1) x (1/d) x (1/v e)]+…….+ [(nbre de colonies dans boite n) x (1/d) x (1/ve)]
n
nbre : nombre ; d : dilution ; ve : volume ensemencé

Les comptages des cellules viables sont exposés à de nombreuses sources d’erreurs du fait des pipetages
successifs, du manque d’homogénéité des échantillons ou de la mauvaise homogénéisation notamment. Il faut
accorder une grande attention et assurer une qualité lors de la préparation des échantillons et du pipetage.

2. Les mesures indirectes

2.1. Détermination du poids sec

La biomasse est classiquement mesurée par l’évaluation du poids sec. Un volume bien précis d’une
suspension bactérienne est soumis à une centrifugation. Après un lavage soigneux à l’aide d’un tampon approprié,
le culot est séché à 100 – 110°C jusqu’à poids contant. Le poids est exprimé généralement en grammes de matière
sèche par litre, il totalise toute la masse cellulaire. Malgré la simplicité de la technique, les opérations de lavage et
de dessiccation notamment, peuvent conduire à des pertes de 5 à 10% de matière cellulaire.

2.2. Mesure de la turbidité

Une méthode rapide et utile pour estimer la concentration cellulaire est la mesure de la turbidité. Une
suspension cellulaire apparait rouble à l’œil car les cellules dispersent la lumière qui passe au travers. Plus il y a de
cellules, plus la lumière est dispersée, et plus la suspension est trouble.

La turbidité peut être mesurée par un spectrophotomètre, appareil qui mesure la quantité de lumière
résiduelle après passage au travers d’une suspension cellulaire. Les longueurs d’ondes le plus souvent utilisées
pour la mesure de la turbidité bactérienne sont de 540 nm, 600 nm et 660 nm. L’appareil mesure la lumière non
dispersée. La décroissance de cette lumière, qui résulte de l’augmentation de la concentration en cellules, se
mesure en densité optique (DO).

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 Figure 02 : Schéma de la mesure de la turbidité par spectrophotomètre.

Pour les microorganismes unicellulaires, la DO est proportionnelle, jusqu’à un certain point, à la

concentration en cellules. Les mesures de turbidité peuvent donc utilisées à la place des méthodes de comptage
direct. Néanmoins, il est nécessaire de réaliser une courbe d’étalonnage entre des valeurs de comptage direct de
nombre de cellules (microscopie, comptage sur boite) ou de la masse (poids sec) avec les mesures indirectes de
turbidité. Les mesures de turbidité permettront ensuite d’estimer la concentration en cellules ou la masse de ces
cellules.

Les mesures de turbidité peuvent se faire sans détruire ou perturbe l’échantillon. Pour ces raisons, ces
mesures sont largement utilisées pour suivre la croissance d’une culture microbienne. Le même échantillon peut
être mesuré plusieurs fois et les résultats sont utilisés selon une représentation semi-logarithmique en fonction du
temps. Il est alors facile de calculer le temps de génération et les autres paramètres de la croissance.