Cytométrie en Flux - EM - Premium

17/6/2015 Visualisation
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Imprimé par ALGERIE CERIST le mercredi 17 juin 2015
Biologie médicale
[90600065]
Cytométrie en flux
MarieClaude Gendron : Ingénieur de recherche CNRS
service commun de cytométrie en flux, institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRSuniversités Paris 7Paris 6, Tour 43,
2 Place Jussieu, 75251 Paris cedex 05 France
Résumé
La cytométrie en flux permet de mesurer individuellement plusieurs paramètres sur chacune des cellules
présentes au sein d'une suspension, et pas seulement de calculer la valeur moyenne de ces paramètres
sur l'ensemble des populations cellulaires. Actuellement, cette technique permet de faire simultanément
les analyses quantitative et qualitative de sept ou huit paramètres physiques. Les éléments analysés
peuvent être des cellules, des bactéries mais aussi des constituants subcellulaires : noyaux, mitochondries,
chloroplastes, chromosomes...
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OBJECTIFS GÉNÉRAUX DE LA CYTOMÉTRIE EN FLUX
La cytométrie en flux permet de mesurer différents paramètres sur des cellules en suspension dans un
liquide, alors qu'elles défilent une à une, à grande vitesse, devant une source lumineuse. Elle fait appel à
un appareillage spécifique appelé cytomètre en flux (analyseurtrieur de cellules, encore dénommé FACS
pour fluorescence activated cell sorter, par le constructeur Becton Dickinson).
Actuellement, cette technique permet de faire simultanément les analyses quantitative et qualitative de
sept ou huit paramètres physiques sur chacun des éléments en suspension monodisperse dans un liquide.
Ces éléments peuvent être des cellules, des bactéries, mais aussi des constituants subcellulaires : noyaux,
mitochondries, chloroplastes, chromosomes, etc.
Cette technique présente le double avantage d'être analytique et préparative. Elle se caractérise par :
la possibilité de mesurer individuellement et simultanément plusieurs paramètres

(taille, granulosité, fluorescences) sur chaque élément en suspension au sein d'une population
hétérogène. Elle définit donc la variation et la distribution de la propriété étudiée, permettant
l'identification de souspopulations et l'estimation de la population moyenne;
la rapidité (10 4 cellules/seconde) et la sensibilité d'analyse (100 déterminants
antigéniques/cellule), permettent de caractériser des souspopulations inaccessibles par d'autres
techniques : des types cellulaires présents entre 10 3 et 10 6 (GR foetaux) peuvent être
analysés sans enrichissement préalable;
la possibilité de séparer physiquement chaque élément analysé selon les propriétés
mesurées, pour faire des études fonctionnelles sur les souspopulations ainsi obtenues.
http://www.empremium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61453/impression/vue5 1/17
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Cytométrie en flux EM|Premium
HISTORIQUE
Cette technique est née du besoin d'automatiser le comptage des constituants cellulaires du sang. C'est en
1934 que Moldavan conçut le premier appareil qui réalisait des numérations cellulaires, en faisant défiler
des cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photoélectrique. Puis en 1949, W
Coulter a mis au point un appareil qui associait numération des cellules et mesure de leur taille par la
variation de résistivité du courant liquidien.
Au cours des 35 dernières années, de nombreux progrès techniques ont conduit à la mise au point de
méthodes de plus en plus fines pour analyser des populations hétérogènes. Parmi ces avancées, on peut
citer l'association des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales
(Fulwyler, 1965), l'utilisation du laser comme source lumineuse (Van Dilla, 1969), l'évolution de
l'informatique, l'apparition des hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux et le
développement permanent de fluorochromes, permettant de déceler des propriétés et des fonctions
cellulaires.
De nouveaux cytomètres effectuent l'analyse de 13 à 15 paramètres simultanément, soit 11 à 13 signaux
de fluorescence [4], ce qui permet d'identifier plus de 100 populations fonctionnelles distinctes parmi les
lymphocytes du sang périphérique humain (De Rosa et al. Nat Med 2003; 9 : 112117).
PRINCIPE
La cytométrie en flux résulte de la combinaison de plusieurs technologies :
la fluidique, pour introduire et canaliser les cellules vers la zone d'analyse;
l'optique, avec une source d'excitation et de récupération des signaux;
l'électronique et l'informatique, pour convertir les signaux optiques en signaux électriques
proportionnels, et les numériser pour en faire une analyse sur ordinateur.
Un exemple d'installation est présenté sur la figure 1.
Fluidique
La suspension monodisperse de cellules à analyser est injectée sous pression au centre d'une gaine liquide
pressurisée, les cellules vont être hydrodynamiquement contraintes de s'y centrer, et vont ensuite
individuellement traverser le faisceau laser focalisé sur l'axe du jet (fig 2).
L'injection peut se faire de deux façons suivant l'appareil utilisé :
par injection volumétrique, à l'aide d'une seringue qui permet de connaître le volume injecté et
délivre un volume fixe;
par la différence entre les pressions appliquées sur le liquide de gaine « sheath » et sur la
suspension cellulaire, ce qui permet de contrôler le débit et de travailler en flux continu.
Il est possible d'y adjoindre des systèmes qui permettent de faire des prélèvements à partir de
microplaques, ou d'autres qui vont ajouter et mélanger un réactif dans le tube échantillon, notamment
pour les études cinétiques.
Dans tous les cas, le débit de l'échantillon cellulaire doit être relativement faible par rapport à celui du
liquide d'entraînement, pour maintenir le centrage des cellules et donc la précision des résultats (par
exemple : 100 μL/min versus 5mL/min).
Les cellules ainsi centrées dans la chambre d'écoulement vont y intercepter le faisceau laser (dans ce cas,
la chambre d'écoulement est en quartz). Alternativement, l'interception aura lieu à la sortie, dans l'air.
Optique
La source d'excitation lumineuse utilisée doit permettre l'excitation des fluorochromes à une longueur
d'onde proche de leur maximum d'absorption. Le laser est le plus fréquemment employé, car il assure
puissance, stabilité du chromatisme et finesse du faisceau, ce qui permet de focaliser le rayon lumineux
sur une seule cellule à la fois.
Pour être mesurés par les photomultiplicateurs ou photodiodes, les signaux lumineux (photons) émis par
chaque cellule sont focalisés puis séparés par une alternance de miroirs dichroïques et de filtres.
Les miroirs dichroïques ont la propriété de transmettre les longueurs d'onde non réfléchies.
Les filtres doivent avoir une bande passante restreinte, et une capacité de transmission maximale.
En fonction du traitement de surface reçu, on dispose de quatre types de miroirs : passehaut, passebas,
passebande et bloquebande, qui seront choisis afin de sélectionner le maximum de lumière émise par
chaque fluorochrome utilisé.
Électronique
Les signaux lumineux émis sont collectés par les détecteurs : photodiode (FSC) et photomultiplicateurs
(fluorescences). Ces photodétecteurs vont convertir les photons en énergie électrique (0 à 10 V)
proportionnelle à la hauteur, la largeur ou la surface du signal. Ces signaux électriques sont ensuite
amplifiés, l'amplification des signaux mesurés est linéaire ou logarithmique (quatre décades).
L'ordinateur ne pouvant traiter que des données binaires, les signaux électriques sont transformés par le
convertisseur analogiquedigital : ADC (valeur continue/valeur discontinue) utilisable par l'ordinateur.
Pour qu'il y ait traitement du signal par l'électronique, l'opérateur doit au préalable avoir défini le seuil de
discrimination (valeur seuil audelà de laquelle les signaux seront analysés) ainsi que le ou les
paramètres déclencheurs (trigger).
Informatique (représentation, calcul et stockage des résultats)
Après transformation et digitalisation, les signaux émis sont représentés par l'unité informatique sous
différentes formes :
monoparamétrique (histogramme), où l'abscisse représente l'amplitude du paramètre (exprimée
en unités arbitraires ou canaux de 0 à 1 024) et l'ordonnée le nombre d'événements par canal
(fig 3);
biparamétrique (cytogramme) : corrélation de deux paramètres mesurés (fig 4);
3D : corrélation de deux paramètres mesurés avec le nombre de cellules par canal (fig 5).
Le positionnement d'une région sur un histogramme entraîne le calcul des statistiques correspondantes
par l'ordinateur : nombre et proportion de cellules au sein de la population, mesure de l'intensité et de la
moyenne de fluorescence, coefficient de variation, d'où l'aspect quantitatif et qualitatif de la technique.
La définition d'une région d'intérêt (gate) autour d'une souspopulation, que ce soit sur la morphologie
et/ou sur la fluorescence, permet d'obtenir des histogrammes conditionnés pour cette souspopulation,
donc de préciser l'analyse des paramètres et la détection d'évènements rares.
C'est encore au niveau informatique que seront définies les caractéristiques que doivent posséder les
cellules à trier (équations de tri).
L'ordinateur permet de stocker les données acquises, soit sous forme de listmode (valeur de chaque
paramètre mesuré pour chaque cellule) qui seront réanalysés a posteriori, soit sous forme
d'histogrammes qui pourront ensuite être comparés entre eux (superposition, soustraction,
normalisation, lissage) par des logiciels appropriés.
PARAMÈTRES ANALYSABLES
Les méthodes de mesure sont basées sur l'absorption et la diffusion du rayon laser par la cellule, la
fluorescence émise par les fluorochromes fixés, et la forme du signal détecté (mise en évidence de doublets
cellulaires).
Après interception de la lumière incidente, la cellule réémet dans diverses directions une partie de la
lumière reçue, sous forme de signaux lumineux (photons de différentes longueur d'onde). Ces signaux
sont représentatifs des propriétés de la cellule.
Propriétés physiques
Ce sont la taille et la granulosité (cas de la lumière diffractée à petits angles : FSC et réfractée à 90° : SSC)
: ainsi, sans aucune coloration, on peut distinguer les lymphocytes, des monocytes et des polynucléaires,
différencier les cellules vivantes des cellules en apoptose et des débris, mettre en évidence la phagocytose.
Propriétés biologiques
Elles sont liées à l'émission de fluorescence par un ou plusieurs fluorochromes préalablement fixés sur ou
dans la cellule, ou exprimée par la cellule (protéines fluorescentes de type green fluorescent protein [GFP]
et DsRed). L'intensité de chaque signal est donc corrélée avec des propriétés cellulaires. Il existe un large
éventail de fluorophores, utilisables seuls ou en combinaison, pour analyser différentes propriétés
biologiques. Certains fluorochromes peuvent se fixer directement à la cellule (colorants de l'acide
désoxyribonucléique [ADN] ou des protéines par exemple), ou être couplés à des anticorps
(immunofluorescence). Une liste des applications faisant appel à des fluorophores spécifiques, ainsi que les
propriétés de ces fluorophores, est présentée (tableau I). En fonction des marqueurs fluorescents
utilisés, les applications peuvent être divisées en deux groupes :
analyse de constituants ou compartiments de la cellule : ADN (viabilité, cycle, synthèse, analyse
des chromosomes); acide ribonucléique (ARN), protéines, expression d'antigènes (membranaires
ou intracellulaires), mitochondries;
analyse de fonctions dans la cellule : réponse précoce à un signal de stimulation cellulaire
(modification du pH, flux ioniques : Ca++, K+,...), mesure d'activités enzymatiques (substrat
non fluorescent transformé en produit fluorescent), potentiel membranaire, métabolisme
oxydatif, production de cytokines.
Le temps est un paramètre qui peut être pris en compte pour réaliser des études cinétiques des propriétés
cellulaires, cependant, compte tenu du principe de la technique, chaque cellule ne sera analysée qu'une
seule fois, et la cinétique portera sur des cellules « identiques » analysées à des temps différents.
Plusieurs exemples d'application sont présentés (fig 6, 7, 8, 9 et 10).
TRI CELLULAIRE
Certains cytomètres en flux, les « trieurs », peuvent séparer physiquement la suspension initiale en deux
souspopulations de cellules, voire quatre (en modulant l'intensité de charge) selon les critères choisis par
l'expérimentateur en fonction des paramètres étudiés. La pureté des fractions triées est de l'ordre de 99
%, et la vitesse peut atteindre 50 000 décisions de tri par seconde.
Pour séparer physiquement les cellules, il faut que le jet soit fractionné. Il existe deux méthodes pour le
faire : la déviation mécanique sur jet continu, et la déviation électrostatique sur gouttelettes (fig 2). Un
exemple d'application du tri cellulaire est présenté sur la figure 11.
Tri sur jet continu
Les appareils Partec utilisent une vanne actionnée par un quartz piézoélectrique, qui ouvre ou
ferme un conduit selon que la cellule correspond ou non aux spécifications. Ce système permet
le tri de grandes cellules (500 μm) mais n'est pas très rapide : 500 cellules/seconde.
Le module tri du FACSCalibur de Becton Dickinson prélève mécaniquement une portion de la
veine liquide contenant la cellule d'intérêt. Ce système est relativement lent (300
cellules/seconde) et dilue beaucoup les cellules.
Ces appareils ne trient qu'une seule souspopulation à la fois, mais ils sont moins coûteux, faciles à mettre
en oeuvre, et ils sont adaptés à la manipulation d'échantillons à risque puisque la veine liquide est dans un
environnement clos.
Tri sur gouttelettes
C'est la méthode la plus utilisée. La veine liquide est fractionnée en une succession de gouttelettes par
vibration d'un quartz piézoélectrique ou d'un système électromagnétique, l'ordinateur envoie un ordre,
pour chaque cellule correspondant aux spécifications déterminées, au niveau informatique (équations de
tri). L'ensemble de la gaine liquide est alors chargé soit positivement, soit négativement juste avant que la
goutte se détache. Ainsi, la goutte contenant la cellule d'intérêt est déviée du flux en passant dans un
champ électrique de haut voltage, puis collectée. Aussitôt la goutte détachée, la charge électrique
s'annule, de façon à ce que la goutte suivante puisse recevoir une charge opposée si la cellule qu'elle
contient possède les propriétés correspondantes. Les gouttes contenant des cellules non désirées ou n'en
contenant pas ne seront pas chargées, et donc pas déviées du flux. Le recueil des cellules peut se faire en
tubes, sur filtres (biologie moléculaire), sur lames coatées à la polylysine (morphologie) ou dans des
microplaques (clonage).
Les réglages à effectuer :
pression appliquée sur la gaine liquide;
fréquence de vibration;
sont fonctions du diamètre de l'orifice de la buse utilisée. Plus ce diamètre est important, plus on diminue
la pression du liquide de gaine, la fréquence de vibration et donc la vitesse de passage de l'échantillon.
Le délai constitue le facteur essentiel à contrôler : c'est la distance qui sépare le point d'analyse de la
cellule de celui où la goutte contenant cette cellule se détache. Les trieurs récents calculent le délai de
manière semiautomatique, notamment grâce à une caméra qui filme la formation des gouttelettes. Cette
caméra permet de vérifier la stabilité du jet, de visualiser le point d'interception cellule/laser et celui du
détachement de la goutte, à partir desquels la machine calcule le délai en équivalent goutte (valeur à
contrôler).
Pour privilégier la pureté ou le rendement du tri, il faut intervenir sur le nombre de gouttes qui sont
chargées à la fois (fonction de la durée de la charge) et sur la prise compte ou non des événements en
coïncidence (présence de deux cellules différentes dans une goutte ou dans un train de gouttes).
Exemple :
Pureté : 1 goutte chargée (détection de coïncidence ON)
Pureté / rendement : 2 gouttes chargées (détection de coïncidence ON)
Rendement / pureté : 3 gouttes chargées (détection de coïncidence ON)
Rendement : 3 gouttes chargées (détection de coïncidence OFF)
Le tri permet des analyses complémentaires sur la population isolée, mais il ne faut pas oublier que :
la bonne qualité du tri dépend aussi de celle l'analyse;
la grande pureté s'obtient bien souvent au détriment du rendement;
il peut y avoir des conséquences pour la population triée (viabilité, photosensibilisation...);
le tri peut être long (si une population représente 1 % du total à une vitesse de 5 000
cellules/seconde, il faut 6 h 30 pour en collecter 10 6 cellules).
Par conséquent, il faut parfois envisager des étapes préparatives de l'échantillon (enrichissement sur billes
magnétiques), à moins d'avoir accès à un trieur haute vitesse. Cette nouvelle génération d'appareil utilise
des pressions de liquide de gaine entre 30 et 100 PSI, et peut générer jusqu'à 100 000 gouttes par
secondes, et donc en théorie des tris pouvant aller à la même vitesse.
LIMITES ET NOUVEAUX DÉVELOPPEMENTS DE LA CYTOMÉTRIE EN

FLUX
La cytométrie en flux est la seule technique qui permet d'analyser et de trier une cellule sur la base de
plusieurs paramètres mesurés simultanément, mais elle nécessite une population de cellules parfaitement
dissociées, en bon état et en nombre suffisant, pour effectuer les contrôles et réglages indispensables à la
fiabilité et à la reproductibilité des mesures. L'utilisation de standards calibrés est indispensable pour avoir
une quantification absolue, sinon les mesures de fluorescence effectuées par un cytomètre sont relatives,
car elles dépendent de facteurs comme le pH, la température, la stoechiométrie de la coloration, la
combinaison des fluorochromes utilisés, le milieu dans lequel les cellules sont en suspension...
En revanche, la cytométrie en flux ne permet pas de visualiser la morphologie de la cellule, à la différence
des techniques microscopiques.
La possibilité de faire des analyses sur des échantillons de sang total, ou d'étudier le contenu en ADN à
partir de biopsies prélevées sur des malades (cellules tumorales en particulier), associée à la mise sur le
marché d'appareils simplifiés, de plus en plus automatisés, a conduit à de nombreuses applications
biomédicales (hématologie, immunologie, oncologie).
Cette technique trouve aussi ses applications en cytogénétique, en microbiologie, en hydrobiologie, ainsi
qu'en biologie végétale.
Enfin, des tests de cytométrie correspondant à des «enzymelinked immunosorbent assay (Elisa) sur billes
» ont été récemment mis au point pour détecter et quantifier de multiples produits sur un même
échantillon : détection d'un panel de cytokines dans le plasma [1], de récepteurs dans des surnageants ou
lysats cellulaires, ou encore d'ARN messagers (microarrays) [11]. Cette dernière application a conduit à la
fabrication de nouveaux cytomètres spécialisés.
SITES INTERNET
Association française de cytométrie : http ://www.afc.asso.fr
International Society for Analytical Cytology : http ://www.isacnet.org/
Cytometry : http :// www.interscience.wiley.com
Molecular Probes : http ://www.probes.com/
Références
[1] Carson RT Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J Immunol
Methods 1999 ; 227 : 4152 [crossref]
[2] Current protocols in cytometry. New York: Wiley and Sons, 1992
[3] Cytométrie par fluorescence. Apports comparatifs des techniques flux, image et confocale. Paris: INSERM,
1994
[4] De Rosa SC, Herzenberg LA, Herzenberg LA, Roederer M 11color, 13parameter flow cytometry:
identification of human naive T cells by phenotype, function, and Tcell receptoe diversity. Nat
Med 2001 ; 7 : 245248 [crossref]
[5] Duperray C Le tri par cytométrie en flux. Biofutur 1998 (n°183) :
[6] Flow cytometry. Methods Cell Biol 1994; vol 4142, 2000; vol 6364
[7] Flow cytometry. J Immunol Methods 2000; 243 (n°12)
[8] Flow cytometry in cell biology. Biol Cell 1993; 78 (n°12)
[9] La cytométrie en flux. Guide pratique, de la préparation à l'analyse des cellules. Limoges: édition PULIM,
1993
[10] Melamed MR Flow cytometry and cell sorting. New York: Wiley and sons1990
[11] Nolan JP Suspension array technology: evolution of the flatarray paradigm. Trends
Biotechnol 2002 ; 20 : 912 [crossref]
[12] Shapiro HM Practical flow cytometry. New York: Wiley and sons1995
© 2003 Elsevier SAS. Tous droits réservés.
Fig. 1 :
Fig. 1 :
Cytomètres de la marque Beckman Coulter (il existe des modèles équivalents fabriqués par Becton Dickinson, Cytomation et
Partec). L'Epics Altra est un analyseurtrieur dont l'emprise au sol est d'environ 1,50 m x 1,60 m qui nécessite comme tous les
trieurs un environnement dépourvu de vibrations, une température stable. Cet appareil est équipé en standard de deux lasers,
mais peut en admettre trois ou quatre, multipliant ainsi les possibilités d'analyse et de tri. L'Epics XL est un analyseur (appareil
qui se pose sur un plan de travail) capable d'analyser simultanément quatre émissions de fluorescence à partir d'un seul laser.
Ce type de cytomètre est peu encombrant et facile à utiliser.
Fig. 2 :
Fig. 2 :
Représentation schématique d'un cytomètre en flux (analyseurtrieur).
Fig. 3 :
Fig. 3 :
Histogramme monoparamétrique, où l'abscisse représente l'intensité du paramètre mesuré exprimée en unités arbitraires (ou
canaux), et l'ordonnée le nombre de cellules par canal. La distribution comporte deux populations, l'une négative et l'autre
positive.
Fig. 4 :
Fig. 4 :
Histogramme biparamétrique ou cytogramme : l'abscisse représente l'intensité du paramètre A, et l'ordonnée l'intensité du
paramètre B, la représentation est sous forme de points ou « dotplot ». Le quadrant 1 correspond aux cellules positives pour le
paramètre B, le 2 à celles qui sont doublement positives, le 3 à celles qui sont doublement négatives et le 4 aux cellules
positives pour le paramètre A.
Fig. 5 :
Fig. 5 :
Représentation en trois dimensions : corrélation de deux paramètres mesurés avec le nombre de cellules sur l'axe Z.
Fig. 6 :
Fig. 6 :
Les cellules ont été marquées avec trois anticorps fluorescents : CD3 Quantum Red, CD8 FITC et CD57 PE. Les lymphocytes sont
sélectionnés sur l'histogramme de double scatter pour l'étude des trois marqueurs. Ceuxci sont ensuite représentés
individuellement sur un histogramme monoparamétrique qui permet de connaître leurs proportions respectives. Sur les trois
histogrammes biparamétriques suivants les marqueurs sont corrélés deux à deux, le dernier histogramme biparamétrique
représente la distribution de CD3 et CD57 sur les lymphocytes CD8 positifs.
Fig. 7 :
Fig. 7 :
Profil de cycle cellulaire obtenu après coloration de l'ADN avec de l'iodure de propidium qui révèle aussi une population de
cellules apoptotiques pré G0 /G1 . Les cellules qui ont incorporé la bromodésoxyuridine ont été colorées avec un antiBrdU couplé
au FITC et de l'iodure de propidium, les cellules en phase S (30 %) sont ainsi mieux estimées.
Fig. 8 :
Fig. 8 :
Caryotype en flux, les chromosomes sont analysés après coloration de l'ADN par le hoechst (spécifique des paires de base AT,
excitable à 360 nm) et la chromomycine A3 (spécifique des paires de base GC, excitable à 457 nm). Cette mesure permet
d'analyser 20 paires de chromosomes humains sur 23, les chromosomes 9101112 ayant un contenu en ADN et un rapport en
paires de bases AT/GC trop proches pour être distingués par cette technique.
Fig. 9 :
Fig. 9 :
L'apoptose via l'exposition des groupements phosphatidylsérine à la surface cellulaire est mise en évidence après coloration par
l'annexine V FITC, associé à l'iodure de propidium utilisé comme marqueur de viabilité, on distingue : 74 % de cellules vivantes,
22 % de cellules en apoptose et 4 % en nécrose.
Fig. 10 :
Fig. 10 :
L'indo1 est un fluorochrome qui émet à deux longueurs d'onde différentes selon qu'il est lié au calcium ou libre. L'analyse en
fonction du temps du rapport de ces deux fluorescences permet de suivre des flux calciques. Les PBL marqués à l'indo1 sont
soumis au flux calcique par un antiCD3 suivi d'un crosslink avec un deuxième anticorps.
Fig. 11 :
Fig. 11 :
Les cellules transfectées comparées à leur témoin ont été triées sur la base d'un niveau d'intensité de fluorescence, elles ont été
collectées dans une plaque 96 puits à raison d'une cellule par puits. Les clones obtenus sont analysés sur l'histogramme de
droite.
Tableaux
Tableau I
Tableau I Applications faisant appel à des fluorophores spécifiques. Propriétés de ces fluorophores (actualisé
dÃ
Â }après P Metezeau, Spectra biologie 1990, nÃ Â ° 90/4).
Propriétés étudièes Fluorochromes excit. émis. Type Raie Fixation

laser laser
FITC 495 520 Ar 488
Phycoérythrine 575 Ar 488514

500
544
Per CP 493 675 Ar 488
PERouge Texas(1) 495 620 Ar 488
PECyanine 5(2) 495 670 Ar 488

Antigènes et récepteurs
PECyanine 7 495 755 Ar 488 Protéines
Contenu en protéines
XRITC 585 610 Kr 568
Rouge Texas 596 615 Kr 568
Allophycocyanine 650 660 HeNe 633
AMCA 354 442 Ar UV
Cascade blue 399 423 Ar UV

Alexa (3) 495 519 Ar 488
370 630 Ar UV
Cycle cellulaire viabilité cellulaire 488 630 Ar 488

Iodure de Propidium
Apoptose 540 630 Ar 514
K 530 ADN
ARN
370 610 Ar UV (double brin)
488 630 Ar 488

Caryotypes en flux Bromure d'éthidium
530 610 Ar 514
K 530
Ar
Caryotypes en flux Cycle
Hoechst 33342 350 450 K UV ADN (bases AT)
cellulaire (toxicité limitée
HeCd
Ar
Hoechst 33258 ADN
350 450 K UV
Caryotypes en flux Cycle DAPI (bases AT)
cellulaire HeCd
Chromomycine 430 570 Ar 457

Mithramycine ADN
ADN/ARN
Cycle cellulaire AMHA 360 510 Ar UV
(bases GC)
Cycle cellulaire viabilité 7 Aactinomycine D 478 660 Ar 488
490 530 Ar 488 ADN

Étude simultanée
de l'ADN et de l'ARN 500 640 Ar 488 ARN
Acridine Orange
540 570 Ar 514
ARN
Contenu en ARN Pyronine Y 540 570 K 530
Réticulocytes Thiazole orange 509 530 Ar 488
YOYO1 470 510 Ar 488

Caryotypes en flux ADN
TOTO1 514 533 Ar 488/514
viabilité ARN
TOTO3 640 660 HeNe 633
Rhodamine 123 510 534 Ar 488

Activité mitochondriale
membranaire DIOC4à 6, JC1, 484 510 Ar 488
CMXRos Membrane
mitochondriale
Masse membranaire 489 525 Ar 488
mitochondriale NonylAcridine
Orange (NAO)
358 445 Ar UV Lipides

Fluidité Diphényl
membranaire Hexatriène (DPH)
BCECF 500 Ar 488

520/620
pH6/7,5
Mesure du pH Intracellulaire
SNARF 518 Ar
575/670 514
pH6/9 488
Flux de calcium INDO1AM 355 485/410 Ar UV libre/lié Ca++
FLUO3 506 530 Ar 488
Flux de magnésium Magindo1AM 345 420/475 Ar UV Mg++
Flux de sodium SBFI 340/380 510 He UV Na+

Cd/Ar
Flux de potassium SBFI 340/380 510 He UV K+

Cd/Ar
Flux de chlore SPQ 340 440 He UV Cl

Cd/Ar
Estérases 490 513 Ar 488

Fluorescéine
Diacétate (FDA)
DCFHDA 490 513 Ar 488

NADPH oxydase
Estérases
galactosidase FDG 490 520 Ar 488
Glutathion Stransférase Monochlorobimane 360 420 Ar UV glutathion
Glutathion CMFDA 492 520 Ar 488 thiols/glutathion
Phiphilux 488 530 Ar 488 caspase3
ANNEXINEV FITC 495 520 Ar 488 phosphatidylsérine
dUTPFITC 495 520 Ar 488 3'OH DNA ends

Apoptose
YOPRO 495 520 Ar 488 acides nucléiques
SYTO 17 633 675 He 633 acides nucléiques

Ne
480 505 Ar 488/457

GFP : S65T, EGFP, RSGFP
DsRed 490,550 590 Ar 488/514
ECFP
EYFP 433,453 475 Ar 457
513 527 Ar 514/457
(1) : duochrome, ECD, red 613.
(2) : tricolor, quantum red, cychrome, red 670.
(3) : Alexa 350, 430, 488, 532, 546, 568, 594 : insensible au pH, soluble dans l'eau.

Cytométrie en Flux - EM - Premium

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17/6/2015 Visualisation

la possibilité de mesurer individuellement et simultanément plusieurs paramètres

LIMITES ET NOUVEAUX DÉVELOPPEMENTS DE LA CYTOMÉTRIE EN

Propriétés étudièes Fluorochromes excit. émis. Type Raie Fixation

FITC 495 520 Ar 488

Phycoérythrine 575 Ar 488514

Per CP 493 675 Ar 488

PE­Rouge Texas(1) 495 620 Ar 488

PE­Cyanine 5(2) 495 670 Ar 488

Rouge Texas 596 615 Kr 568

Allophycocyanine 650 660 HeNe 633

AMCA 354 442 Ar UV

Cascade blue 399 423 Ar UV

370 630 Ar UV

Cycle cellulaire viabilité cellulaire 488 630 Ar 488

488 630 Ar 488

Chromomycine 430 570 Ar 457

490 530 Ar 488 ADN

Réticulocytes Thiazole orange 509 530 Ar 488

YOYO­1 470 510 Ar 488

Rhodamine 123 510 534 Ar 488

358 445 Ar UV Lipides

BCECF 500 Ar 488

Flux de calcium INDO­1­AM 355 485/410 Ar UV libre/lié Ca++

FLUO­3 506 530 Ar 488

Flux de magnésium Mag­indo­1­AM 345 420/475 Ar UV Mg++

Flux de sodium SBFI 340/380 510 He­ UV Na+

Flux de potassium SBFI 340/380 510 He­ UV K+

Flux de chlore SPQ 340 440 He­ UV Cl­

Estérases 490 513 Ar 488

DCFH­DA 490 513 Ar 488

­galactosidase FDG 490 520 Ar 488

Glutathion S­transférase Monochlorobimane 360 420 Ar UV glutathion

Glutathion CMFDA 492 520 Ar 488 thiols/glutathion

Phiphilux 488 530 Ar 488 caspase­3

ANNEXINE­V FITC 495 520 Ar 488 phosphatidylsérine

dUTP­FITC 495 520 Ar 488 3'­OH DNA ends

SYTO 17 633 675 He­ 633 acides nucléiques

480 505 Ar 488/457

513 527 Ar 514/457

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