90-60-0005-A

ADN branché ou bDNA

I. Vassias

La technique de l’acide désoxyribonucléique (ADN) branché, ou branched DNA (bDNA) permet la détec-
tion d’acides nucléiques sans étape d’amplification. Elle est basée sur l’amplification d’une ou plusieurs
sondes hybridées à un acide nucléique cible. Elle a été développée pour détecter et quantifier des ADN
ou des ARN. Elle utilise une cascade de sondes spécifiques de la cible qui sont ensuite immobilisées
sur un support solide. Ces sondes s’hybrident à d’autres sondes, aboutissant à l’amplification d’un
signal quantifiable. Cette technique est aujourd’hui appliquée au diagnostic des infections virales et
plus particulièrement du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et des virus des hépatites.
© 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : bDNA ; Amplification de sonde ; ADN ; ARN

Plan Processus d’amplification

■ Principe de la technique 1
Hybridation des sondes cibles
■ Étapes 1 Deux sondes cibles sont utilisées : elles possèdent une région
Préparation de l’échantillon 1 complémentaire de l’ARN cible et une région complémentaire
Processus d’amplification 1 d’une autre sonde (Fig. 1).
Détection des sondes amplifiées 1
■ Avantages et inconvénients 3 Capture des complexes sonde-ARN
■ Applications possibles 3 Une des deux sondes cibles possède une séquence complémen-
■ Conclusion 3 taire d’une sonde (appelée sonde capture) fixée à un support solide
(microplaque). Le complexe sonde cible-ARN-sonde capture est
donc immobilisé.

 Principe de la technique Amplification des sondes

La technique dite de l’« ADN branché », ou branched DNA
(bDNA) est une technique basée sur l’amplification du signal de
détection et non sur l’amplification de l’acide nucléique, comme
la polymerase chain reaction (PCR). L’acide nucléique, après avoir
été libéré des particules virales, est hybridé à des sondes spéci-
fiques de la cible qui sont ensuite immobilisées sur un support.
Ces sondes s’hybrident à d’autres sondes, aboutissant à l’émission
d’un signal quantifiable. Cette technique a été développée pour
détecter et quantifier des ADN ou des acides ribonucléiques
(ARN).
 Étapes
Préparation de l’échantillon
Les acides nucléiques sont libérés par un traitement des échan-
tillons (le plus souvent du plasma) par la protéinase K et un
détergent [1] .
Les deux sondes cibles possèdent une séquence complémen-
taire d’une sonde appelée préamplificateur. Ce préamplificateur
comporte plusieurs séquences complémentaires d’un amplifica-
teur. Celui-ci est une structure branchée ayant l’aspect d’un
arbre de Noël, comportant de multiples séquences identiques,
complémentaires d’une sonde marquée à la phosphatase alcaline
(sonde de marquage). Chaque structure branchée peut fixer 45
sondes de marquage. Le substrat dérivé du dioxétane est ajouté et
une émission de photons est alors générée (Fig. 1).
Détection des sondes amplifiées
La production de chimiluminescence peut être mesurée dans
un luminomètre. Chaque échantillon est testé en double et
comparé à des standards de quantification. Ils permettent
d’établir une courbe d’étalonnage, nécessaire à la détermina-
tion de la quantité d’acide nucléique présent dans l’échantillon.
En effet, l’intensité du signal chimiluminescent, est directe-
ment proportionnelle à la quantité de cibles présentes au
départ.

EMC - Biologie médicale 1

Volume 90-60-0005-A 2012
doi:10.1016/S2211-9698(12)56772-5
90-60-0005-A  ADN branché ou bDNA

Figure 1. Technique du branched DNA (bDNA). Les sondes cibles et la sonde capture s’hybrident à l’acide ribonucléique (ARN) cible et l’ensemble est
immobilisé sur un support solide. Un préamplificateur s’hybride alors aux deux sondes cibles simultanément. Plusieurs sondes « amplificateur » ayant la
structure d’acide désoxyribonucléique (ADN) branché en arbre de Noël s’hybrident au préamplificateur. Chaque structure branchée peut alors fixer 45
sondes de marquage. Une fois le substrat dérivé des dioxétanes ajouté, une émission de photons est générée, lisible par un luminomètre.

2 EMC - Biologie médicale


 Avantages et inconvénients
Cette technique présente l’avantage, contrairement à la PCR,
de ne pas être sensible aux contaminations puisque la cible
n’est pas amplifiée. De plus, il n’est pas nécessaire d’installer des
pièces spécifiques comme c’est le cas des techniques de détection
par amplification génique. Elle est relativement courte : 5 heures
réparties sur 2 jours, extraction des acides nucléiques comprise.
Enfin, elle peut s’effectuer à partir d’un échantillon simplement
lysé puisque peu de molécules inhibent les hybridations. En
revanche, elle ne peut être utilisée que dans le cadre de trousses
commercialisées.
Dotée d’une bonne reproductibilité, elle est adaptée à l’analyse
de grandes séries dans le cadre de l’utilisation d’automate.
 Applications possibles
Cette technique a été développée pour le diagnostic du VIH
dans les années 1990. Deux autres trousses sont commercialisées
depuis, pour le diagnostic du virus de l’hépatite C (VHC) et celui
de hépatite B (VHB). Ce sont les trousses de troisième génération
qui sont actuellement commercialisées (Versant® ). La sensibilité
de ces trousses reste néanmoins inférieure à celle utilisant la tech-
nique de PCR quantitative (real-time reverse transcriptase [RT]-PCR).
En effet, avec la technologie du bDNA, le seuil de détection du
VHC est de 615 UI/ml versus 50 UI/ml pour les trousses utili-
sant la RT-PCR et 5 UI/ml pour celles employant la technologie
transcription-mediated amplification (TMA) [2] . Néanmoins, elle est
très reproductible et sa spécificité oscille entre 96 % et 98,8 % [3] .
Concernant le diagnostic du VIH, les techniques de PCR en
temps réel ont largement supplanté celle du bDNA en termes de
sensibilité [4] et aussi de spécificité vis à vis certains sous-types [5] .
Enfin, la trousse Versant® pour le diagnostic des infections à
HBV est aussi largement remplacée par les trousses utilisant les
techniques de PCR en temps réel, ces dernières étant plus sen-
sibles [6] .
 Conclusion
L’arrivée des techniques de PCR en temps réel depuis mainte-
nant 10 ans a révolutionné les méthodes de détection des génomes
viraux. Si la technique de l’ADN branché est séduisante, elle est
I. Vassias (isabelle.vassias@curie.fr).
UMR 218 Institut Curie/CNRS, Centre de recherche, 26, rue d’Ulm, 75005 Paris, France.
Toute référence à cet article doit porter la mention : Vassias I. ADN branché ou bDNA. EMC Biologie médicale 2012;7(1):1-3 [Article 90-60-0005-A].
Disponibles sur www.em-consulte.com
Arbres Iconographies Vidéos/ Documents
décisionnels supplémentaires Animations légaux
EMC - Biologie médicale
ADN branché ou bDNA  90-60-0005-A
aujourd’hui moins sensible que ses concurrentes. Dans la mesure
où le suivi des cinétiques virales est crucial pendant toutes les
phases de la maladie, des essais virologiques spécifiques et sen-
sibles sont désormais nécessaires [7-9] .
Cet article a fait l’objet d’une prépublication en ligne : l’année du copyright peut
donc être antérieure à celle de la mise à jour à laquelle il est intégré.
 Références
[1] Vassias I. Principe de l’amplification en chaîne par polymérase. EMC
Biologie médicale 2012;7(1):1–5 [Article 90-60-0015-A].
[2] Scott JD, Gretch DR. Molecular diagnostics of hepatitis C virus infec-
tion: a systematic review. JAMA 2007;297:724–32.
[3] Elbeik T, Surtihadi J, Destree M, Gorlin J, Holodniy M, Jortani SA,
et al. Multicenter evaluation of the performance characteristics of the
bayer VERSANT HCV RNA 3.0 assay (bDNA). J Clin Microbiol
2004;42:563–9.
[4] Holguin A, Lopez M, Molinero M, Soriano V. Performance of
three commercial viral load assays, Versant human immunodeficiency
virus type 1 (HIV-1) RNA bDNA v3.0. Cobas AmpliPrep/Cobas
TaqMan HIV-1, and NucliSens HIV-1 EasyQ v1. 2, testing HIV-1
non-B subtypes and recombinant variants. J Clin Microbiol 2008;46:
2918–23.
[5] Church D, Gregson D, Lloyd T, Klein M, Beckthold B, Laupland
K, et al. Comparison of the RealTime HIV-1, COBAS TaqMan
48 v1.0. Easy Q v1. 2, and Versant v3. 0 assays for determi-
nation of HIV-1 viral loads in a cohort of Canadian patients
with diverse HIV subtype infections. J Clin Microbiol 2011;49:
118–24.
[6] Ronsin C, Pillet A, Bali C, Denoyel GA. Evaluation of the COBAS
AmpliPrep-total nucleic acid isolation-COBAS TaqMan hepatitis B
virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV
DNA 3.0 assay. J Clin Microbiol 2006;44:1390–9.
[7] Bourlet T, Signori-Schmuck A, Roche L, Icard V, Saoudin H, Tra-
baud MA, et al. HIV-1 VIRAL LOAD COMPARISON BETWEEN
FOUR COMMERCIAL REAL-TIME ASSAYS. J Clin Microbiol
2011;49:292–7.
[8] Chevaliez S, Pawlotsky JM. Virological techniques for the diag-
nosis and monitoring of hepatitis B and C. Ann Hepatol 2009;8:
7–12.
[9] Pawlotsky JM, Dusheiko G, Hatzakis A, Lau D, Lau G, Liang TJ, et al.
Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and
practice: recommendations for a standardized approach. Gastroente-
rology 2008;134:405–15.
Information Informations Auto- Cas
au patient supplémentaires évaluations clinique
3