République Algérienne Démocratique et Populaire

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERGHE

SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE HASSIBA BEN BOUALI CHLEF

Biotechnologie Microbienne L3
Module :Biologie Moléculaire

Présenté par: Dirigé par:

-BOUREZAK RABIAA-NAWEL -Mm . NAHAL
-HADJ BEN ELEZAAR ASMA

Les Puces a ADN

2015/2016
Notre plan de présentation
Introduction
Historique

Définition des puces à ADN

Les différents types de puces à ADN

Principe
Notre plan de présentation
Les étapes de construction
Fonctionnement des puces a ADN

Domaines d’utilisation

Les avantages et les inconvénient

Conclusion
INTRODUCTION

Le concept de puce à ADN repose sur une technologie

multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la
chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio-
informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le
niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes
simultanément et les applications sont en plein essor dans un
grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la
médecine ou l’environnement.
 Historique

Les premières puces à ADN sont apparues en 1993.

Schena et al 1995
leur concept date de 1987 « suite logique aux
anciennes méthodes de northern blotting.

La technologie des puces à ADN est basée sur le principe

d’hybridation développé par southern (1974).
 Définition des puces à ADN Ploy-lysin

Une puce à micromatrice

biopuce ADN d'ADN

Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules

d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface
qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.

Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau

d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un
tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange
complexe, à un moment donné et dans un état donné par
rapport à un échantillon de référence.
puces à
biochip gènes
 Les différents types de puces
à ADN

Microarray: Macroarray: Oligonucléotides:

lame en verre -utilise des clones Affimetrix
d’ ADNc . -synthèse
-plus miniaturisé chimique
-utilise les d’oligonucléotide
produit PCR -disposés sur une
membrane de s In-situ
-200-400 microns -sur surface
-cibles marquées nylon.
solide
par fluorescence - un procédé de
-associés avec
des cibles photolithographi
Radioactives. e

 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
Source : The Samuel Roberts
Noble Foundation, Inc
Les étapes de construction

Analyse Regroupement
des des profils
Lecture d’expression
données

Hybridation

Préparation
de la cible

Fabricati
on
de la puce
 La Fabrication
Macroarrays Les fragments d'ADNc amplifiés par la
technique de PCR sont déposés sur
une lame de verre par adressage
mécanique.

L’accrochage de la molécule d’ADNc se

Microarrays fait grâce à (la poly-lysine).

L’ADN est lié de manière covalente au

Puces à support par une exposition aux UV.
oligonucléotides
Un Support idéal, c’est lui qui permet :
L’immobilisation efficace des sondes
sur la surface.
L’hybridation robuste de la sonde
avec la cible.
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
 Préparation de la
cible
Macroarrays
-Les ARNm sont extraits des deux
cultures dont on veut comparer leurs
expressions.

-Les ARNm sont ensuite transformés

Microarrays en ADNc monocaténaires par
transcription inverse RT-PCR.

-L’ADN de la première culture est

marqué avec un fluorochrome vert, et
Puces à l'ADN de la seconde culture est
oligonucléotides marqué en rouge.

-Mélange des deux ADNc (vert et

rouge) : c’est la cible.

 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
 L’Hybridation
Macroarrays
65c°
1-Le mélange PENDANT
est placé sur la UNE NUIT
matrice d'ADNc
monocaténaire
Microarrays (la sonde).

Puces à 2-La puce est alors incubée

oligonucléotides une nuit à 60 degrés. A
cette température, un brin
d'ADN qui rencontre son
complémentaire s'apparie
pour donner de l'ADN
double brin.
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
 MODE DE FIXATION des sondes:
séchage 12H /fixation des ADN par
cuisson à 80c° / lavage
 La lecture
Macroarrays

1-La puce est 2-Des résultats

Microarrays placée sous un obtenus par
scanner des logiciels
éléctronique. informatiques

Puces à 3-Superposition des images vertes et rouges :

oligonucléotides le vert , c’est seulement l'ADN de la
première condition qui est fixé ; le rouge
c’est seulement l'ADN de la seconde
condition qui est fixé)
*Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306
Microarrays: biotechnology’s discovery platform for
functional genomics
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
Domaine d’utilisation
 Analyse des
données
Macroarrays
*On mesure la quantité de signal dans la
longueur d'onde d'émission du
fluorochrome (vert et rouge)
pour chacun des spots

Microarrays *On suppose alors que la quantité d'ADN

fluorescent fixée est proportionnelle à la
quantité d’ARNm correspondante dans la
cellule de départ
Puces à
oligonucléotides *On calcule le ratio des intensités=
fluorescence rouge / fluorescence verte.
Si ce ratio > 1 (la couleur est
rouge), le gène est plus exprimé, si ce
ratio < 1 (la couleur est verte), le gène
est moins exprimé.
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
 ARNm présent
seulement dans les
Macroarrays cellules normales

ARNm présent en
quantité égale dans
Microarrays les cellules
normales et dans
les cellules
cancéreuses

Puces à
oligonucléotides
ARNm présent
seulement dans les
cellules cancéreuses

 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
 Regroupement des
profils d’expression
Macroarrays
1-Dans cette étape ,on essaye de
regrouper des gènes ayant le même
profil d'expression sur plusieurs
expériences ayant un rapport biologiques
Microarrays

2- On représente ensuite les ratios grâce

Puces à
à une échelle de couleur du vert (gènes
oligonucléotides réprimés) au rouge(gènes induits).

 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
On réalise une synthèse chimique
d’oligonucléotides représentative des
génes de l’organisme étudié,
directement sur une lame de verre, par
un procédé photolithographique .
3-Réseaux d’oligonucléotides :
synthèse d’oligonucléotides in
situ (sur une surfase)

1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à

fixer des nucléotides.
2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements
photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard.

3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection

contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit
apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger
toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème .

4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les
groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place.
5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé
portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème
place.

Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) =
f(intensités dans le vertCY3).
Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS)
Généralement, quand la limite
d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on
considère qu’un gène est
respectivement sur exprimé ou
sous- exprimé, dans une des
cibles par rapport à l’autre.
Domaine d’utilisation
parallèlement à l’analyse des profils d’expression, les puces à
ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses.
- La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis
d’améliorer la classification des tumeurs.

-Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de

découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en
réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de
molécules.
-L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment
pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques,
principalement des agents pathogènes dilués dans
l’environnement.
-Les applications dans le domaine de la guerre
bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les
modifications du fonctionnement génétique des cellules
immunitaires occasionnées par des agents toxiques.
Domaine d’utilisation
Avantages Inconvénients

Étude simultanée des profils La technique est assez

d’expression de plusieurs millier lourde à mettre en place.
de gènes.

Les données sont L’équipement de départ

est d’un coût relativement
cumulables. élevé.

Les groupes de gènes Le grand nombre de

affichent des comportements résultats obtenu très
identiques dans une situation rapidement nécessite un
biologique donnée. traitement informatique et
statistique non négligeable.
 conclusion

-Les biopuces se présentent comme une réelle révolution

autant au point de vue technologique qu’applicatif. En
effet, les procédés de fabrication et d’exploitation
nécessitent la participation de sciences à vocations
différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un
côté des technologies relevant des télécommunications
telles que l’électronique, l’optique et l’informatique, et
d’autre la biologie.
Merci