1ère Master BA……..2023/2024…….…Expression des Gènes des Procaryotes et Régulation ....

Chargé du module: MA Derradji yacine

Travaux dirigés EGPR

ème
3 Série : Différentes techniques utilisées dans l’étude des protéines régulatrices
- DNAse I footprinting
Protection de l’ADN par la
liaison d’une protéine
contre la coupure par la
DNAse I

Utilisations: locatisation du
site de liaison de la protéine
régulatrice à l’ADN

Exemple 1: donnez les sites de liaison des différentes protéines sur l’ADN en se basant sur les résultats de la
technique DNase I FP, complétez les résultats de la technique pour la protéine 1.

Pn1

-300 -80 -20 +200

1ère Master BA……..2023/2024…….…Expression des Gènes des Procaryotes et Régulation ....
Chargé du module: MA Derradji yacine

- Chromatographie
d’affinité à l’ADN

Utilisations:
- Purification des protéines
régulatrices
- Autres utilisations :
la technique a été utilisée
dans l’étude du
complexe d’initiation
de la transcription
chez les eucaryotes

- Gel mobility shift

assay (GMSA) : modification
de la mobilité électrophorétique
d’un fragment d’ADN à cause
de la liaison d’une protéine.

Utilisations:

Liaison ou Différence Nombre de sites Courbure ou Degré de la Position du Linéaire ou Interaction entre
non de taille ou de protéines non Courbure site lors de circulaire protéines (dimérisation)
la courbure
1ère Master BA……..2023/2024…….…Expression des Gènes des Procaryotes et Régulation ....
Chargé du module: MA Derradji yacine

Exemple 2: suite de l’exemple 1, complétez les résultats de ADN ADN ADN ADN ADN
ADN1 + +
la technique GMSA en se basant sur les résultats de DNaseI + + + Pn 4 Pn 5
Pn 1 Pn 2 Pn 3 + -
FP et les données suivantes. L4 L5

Protéine 1: PM 200 Kda courbe l’ADN 90°

Protéine 2: PM 200 Kda

Protéine 3: PM 300 Kda

Protéine 4: PM 400 Kda, répresseur contrôlé par un ligand

inducteur (L4)

Protéine 5: PM 200 Kda, courbe l’ADN 90°, activateur

contrôlé par un ligand inhibiteur (L5)

- Site-directed mutagenesis :

PCR ordinaire PCR avec amorces chevauchantes kit QuikChange

Méthode avec une amorce Méthode avec plusieurs amorces

Vecteur méthylé contenant le

fragment d’ADN cible)

PCR

Transformation
Insertion dans un vecteur
Séquençage et sélection
Digestion DpnI (site reconnu 5´-Gm6ATC-3´)
Transformation

Séquençage

Utilisations :
- Etude du site de liaison dune protéine : Transformation
recherche des paires de bases impliquées dans l’interaction.
- Mutation (inactivation d’un site de liaison). Séquençage
- Mutation dans la région codante pour générer des protéines modifiées (étude des différents domaines de la
protéine).
1ère Master BA……..2023/2024…….…Expression des Gènes des Procaryotes et Régulation ....
Chargé du module: MA Derradji yacine

- Chromatine immunoprécipitation (CHIP)

Utilisations :
- Savoir si la protéine est lié ou non invivo,
- Localisation du site de liaison de la protéine.

- Utilisation d’un gène rapporteur :

Travaux dirigés EGPR