Juillet 2019

Protocole de Labo II
Séquençage Sanger

Séquences de référence

Les séquences ADN

annotées, conservées et
réunies pour un accès
publique facilité.

Fichiers

SÉQUENCES ADN RÉFÉRENCÉES = RÉFÉRENTIEL GÉNÉTIQUE

La séquence de nucléotides d’une région connue du génome représente une
source d’informations sur le spécimen. Les séquences de différents
spécimens permettent ainsi de caractériser génétiquement les espèces, pour
Le séquençage de l’ADN
une ou plusieurs régions du génome. L’inventaire génétique de la
produit deux types de
biodiversité sert ainsi de référentiel des espèces suisses et assiste à des
fichiers: les
applications variées. chromatogrammes
individuels – ab1 ; les
Marqueurs & Primers Les marqueurs sélectionnés pour caractériser les espèces séquences éditées
doivent être des régions informatives de l'ADN – faible variabilité intraspécifique et consensus – fst.
large variabilité interspécifique. Un bon marqueur doit avoir des sites adjacents
conservés afin de faciliter la création de primers qui, selon l’application prétendue, Données
permettent une couverture plus ou moins complète des espèces du groupe
d'organismes étudié. La longueur de la séquence ADN doit être suffisamment courte
pour être utilisée avec les méthodes actuelles d'amplification et de séquençage.

PCR & Séquençage Le séquençage de l'ADN est le processus de détermination

de la suite d'acides nucléiques qui composent la région ciblée – marqueur
sélectionné. Grâce à la PCR, la région spécifique choisie peut être amplifiée de façon
exponentielle pour générer des milliers de copies supplémentaires de ce fragment
d'ADN particulier.
Les informations
relatives à l’obtention
des séquences sont
indispensables, ainsi
que les fichiers mêmes
des séquences –
chromatogrammes et
CHROMATOGRAMMES SEQUENCES CONSENSUS INFORMATIONS séquences consensus.
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sofia.wyler@unine.ch
 BONNES PRATIQUES
Manipulation Des instruments adaptés et stériles doivent être utilisés lors de la préparation de la PCR et de la
manipulation des extraits d’ADN. Le port de gants est obligatoire pendant toutes les manipulations et des précautions
doivent être entreprises afin d’éviter les cross-contaminations. Lors de la préparation de la PCR, il est indispensable
d’utiliser des auxiliaires stérilisés (récipients, tubes, eppendorfs, falcons, pointes) et le recours à des pointes à filtres
est clairement un avantage. De plus, il est fortement conseillé de prendre des pipettes uniquement utilisées pour
travailler avec de faibles concentrations d’ADN, ainsi qu’une manipulation dans des salles pré-PCR. La grande majorité
des méthodes de PCR actuelles reposent sur un cycle thermique et l’utilisation d’une ADN polymérase thermostable.
Une fois amplifié, l’ADN est beaucoup moins sujet aux contaminations et la vigilance peut être libérée pour les
processus post-PCR de vérification et purification du produit d’amplification, puis de séquençage.

Préparation Une nomination des fichiers compréhensible dès le départ facilite la validation des données. Les
séquences consensus doivent être soumises selon une des deux alternatives : 1. un fichier par séquence (nom du
fichier : VOUCHERID_SEQMARKER.fst ou EXTID_SEQMARKER.fst) ; 2. un fichier par marqueur rassemblant toutes les
séquences pour ce projet (nom du fichier : SEQMARKER.fst ; intitulé de la séquence : VOUCHERID ou EXTID).
Les fichiers des chromatogrammes doivent être nommés selon la règle suivante : VOUCHERID_TRAMARKER_TRASEQ
PRIMER.ab1 ou EXTID_TRAMARKER_TRASEQPRIMER.ab1).
Informations Afin de faciliter le maintien des liens entre les différents objets, il est recommandé de garder
l’identifiant unique attribué au spécimen – BARCODE TAG (identifiant unique en étiquette fourni par GBIF.ch);
INFOSPECIES ID (identifiant de l’occurrence attribué par un centre de données); MUSEUM ID (numéro de catalogue
fourni par l’institution muséale); FIELD ID (identifiant arbitraire attribué temporairement lors de la récolte). Les
informations concernant les primers utilisés pour amplifier et séquencer l’ADN garantissent la qualité des données.

Identifiant interne utilisé pour assurer les liens entre les informations génétiques - BARCODE TAG
VOUCHERID 1
IDENTIFICATION (GBIFCHID) ou INFOSPECIES ID (occurrence ID) ou MUSEUM ID (catalog Number)
PROJECTCODE 1 Code attribué au projet auquel l'aquisition de la séquence est associée

EXTRACTION DNA_EXTID 1 Identifiant assigné par le labo, assurant temporairement les lie ns entre les informations géné tiques
(EXT) DNA_EXTINS 1 Institution /Compagnie ayant effectué l'extraction
SEQ_GENOME 1 Organelle source de la séquence
SEQ_MARKER 1 Fragment ou région ciblée dans le génome
SEQ_FILENAME 1 Nom du fichier fasta contenant la séquence consensus
SEQUENCE
SEQ_REPOSITORYURL 4 Adresse internet sur laquelle le fichier fasta contenant la séquence consensus a été déposé
CONSENSUS
(SEQ) SEQ_NCBI 2 Accession number donné par Genbank lors de l'enregistrement de la séquence
SEQ_BOLDPROCESSID 2 Identifiant assigné par BOLD à l'entrée indiviuelle associé e au spécimen
SEQ_BIBLIOREF 2 Référence bibliographique de l'article dans leque l la séquence a été publiée pour la première fois
SEQ_BIBLIOREFDOI 4 Identifiant numérique de l'article dans leque l la séquence a été publiée pour la première fois

Identifiant interne utilisé pour assurer les liens entre les informations génétiques - BARCODE TAG
IDENTIFICATION VOUCHERID 1
(GBIFCHID) ou INFOSPECIES ID (occurrence ID) ou MUSEUM ID (catalog Number)
TRA_FILENAME 1 Nom du fichier contenant le chromatogramme correspondant à la séque nce individuelle
TRA_MARKER 1 Fragment ou région ciblée dans le génome
TRA_INS 3 Institution / Compagnie ayant effectué le séquençage
CHROMATOGRAMMES TRA_STAFF 4 Personne ayant procédé à l'extraction d'ADN - nom et prénom en toutes lettres
(TRA) TRA_YEAR 4 Année ou date (ISO) de l'extraction YYYY-MM-DD
TRA_SEQPRIMER 1 Nom du primer utilisé pour séquencer
TRA_PCRPRIMER1 1 Nom du primer Forward utilisé pour l'amplification par PCR
TRA_PCRPRIMER2 1 Nom du primer Reverse utilisé pour l'amplification par PCR

IDENTIFICATION PROJECTCODE 1 Code attribué au projet auquel l'aquisition de la sé quence est associée
PRI_MARKER 1 Fragment ou région ciblée dans le génome
PRI_NAME 1 Nom donné au primer par les auteurs qui l'ont conçu
PRIMERS PRI_SEQ 1 Séquence ADN du primer (5' -> 3')
(PRI) PRI_DIR 1 Direction du prime r
PRI_BIBLIOREF 2 Référence bibliographique de l'article dans lequel le primer a été publiée pour la première fois
PRU_BIBLIOREFDOI 4 Identifiant numérique de l'article dans leque l le primer a été publiée pour la première fois
Priorisation des informations : 1 – obligatoire ; 2 – basique ; 3 – recommandé ; 4 – optionnel.

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