Nicolas JOLIVET MBA6002
Études des cdnséquences d’une mddificatidn milieu sélectif dont la composition est inconnue.
du milieu de culture dans un réacteur 2. Extraction des ARN16s et Séquençage
bidldgique qui prdduit du diazdte. Le protocole utilisé pour réaliser l’extraction des
Abstract :
Une erreur opportune de préparation de milieu à conduit une
augmentation du rendement de production dans un réacteur
biologique responsable de la production de diazote. La
comparaison des ARN16S par des outils bio-informatiques,
du réacteurs « après » et « avant » (avec erreur et témoin), à
montrer la sur-croissance d’une espèce bactérienne et des
analyses plus poussées du génome et du transcriptome
semblent démontrer que la souche bactérienne en sur-
croissance possède plusieurs mutations dans son génome,
notamment dans le gènes contrôlant l’absorption du fer dans
la cellule (indirectement) : le gène fur, et une insertion de
gènes originaires de la bactérie Bradyrhizobium
diazoefficiens.
Mdts-clés :
Génomique, transcriptomique, E.coli, sélection accidentelle,
fur, régulation, mutations, SNP, insertion par transposase.
Intrdductidn :
L’entreprise N2tech a pour ambition de produire à l’aide de
biofilms bactérien, du diazote à partir de déchets. Avant le
recrutement de Maxime Laberge, le rendement de
production était de 46 litres de diazote par mois. Après son
arrivé, en Mars, le rendement est monté à 64 litres par mois.
Son rôle au sein de la production était dans la préparation du
milieu de culture des réacteurs. Notre recherche de la cause
de cette hausse de production nous mène à utiliser des outils
de bio-informatiques essentielles aujourd’hui à la recherche
en microbiologie.
Matériels & Méthddes :
1. Milieux et support de cultures
La production de Diazote se fait dans deux réacteurs de
volumes inconnus dans lesquels on a ajouté du biofilm, de
composition microbienne inconnue ainsi que des déchets de
nature inconnue. A ce mélange, on ajoute un milieu de
culture à hauteur de 10 % (peptone (5g), extrait de levure
(3g), L-lysine (10g), glucose (1g), citrate de fer III
ammoniacal (2g), Bromocrésol pourpre (20mg), thiosulfate
de sodium (40 mg) au pH 6,7). Le milieu a été altéré lors
dans le réacteur « après ». La culture d’isolats bactérien
pour l’étude génomique et transcriptomique se fait sur un
ARN et
ADN et le protocole du séquençage Illumina n’est pas
détailler ici.
3. Identification des variations dans l’écosystème
des réacteurs par méta-génomique
Les reads illumina obtenus après séquençages sont
« nettoyés » en utilisant le logiciel Mothur afin récupérer des
contigs exploitables et de retirer les moins utilisables. Un
alignement sur des bases de données a permis d’extraire des
UTOs (Unités Taxonomique Opérationnelle) des contigs
illumina. En ne sélectionnant pas les UTOs appartenant aux
chloroplastes, aux mitochondries, aux Archées, et aux
organismes Eukaryotes, nous sélectionnons uniquement les
UTOs d’intérêt dans le processus et nous pouvons connaître
la proportion des UTOs dans les réacteurs.
L’utilisation de l’outil statistique R, permet de calculer les
dissimilarités entre les réplicats de proportions d’UTOs a
l’aide du modèle de Bray-Curtis. La dissimilarité est
visualisée à l’aide d’une ordination.
4. Étude génomique
L’étude du génome se fait sur les extraits d’ADN des
cultures isolées. Le séquençage de la culture de Escherichia
coli du réacteur « avant » se fait à via la technique Illumina,
le séquençage de E. coli du réacteur « après » se fait via la
technique PacBio (non détaillé ici). Les reads Illumina sont
« nettoyés » via le logiciel en ligne Galaxy. La première
étape consiste en une délétion des bases des reads ayant une
qualité inférieurs au seul choisie, ici 32. Puis les reads sont
assemblés en contigs, afin d’être aligné sur un template via
le logiciel SeqMan Ngen. Le template utilisé est le génome
d’Escherichia coli K-12. Le résultats aligné est alors utilisé
par le logiciel en ligne RAST afin d’être annoté. Cette
annotation se fait à l’aide du génome d’Escherichia coli K-
12. Afin de comparer les génomes « avant » et « après », les
fichiers de séquences de nucléotides du .gb sont concaténés
en un fichier .txt via Artemis. Les séquences en format .txt
sont formatées (via l’application formatdb) en fichiers .NSQ
afin que la séquence soit exploitable avec le logiciel blastall.
Le blast est effectué en comparant le fichier « après » sur le
fichier « avant ». Les résultats sont visualisés et analysés par
les logiciels act et SeqMan Pro ainsi que le logiciel Blastx de
NCBI.
5. Étude transcriptomique
L’étude du transcriptome se fait sur les extraits d’ARN des
cultures isolées. Les ARNm sont rétro-transcrits en leurs
séquences d’ADNc afin d’être séquencés par la technique
Illumina. Les résultats de séquençage (.fasta) sont nettoyés à
l’aide du logiciel galaxy, afin d’éliminer les bases ayant une
mauvaise qualité avec l’outil Fastq Quality Trimmer by
column (avec une étape de formatage via l’outil Fastq
groomer). Les séquences nettoyées sont alors alignées à
l’aide de l’outil Bowtie2, permettant de récupérer un fichier
qui, utilisé par l’outil htseq-count, donne les niveaux
d’expressions de chaque gènes. L’outil statistique intégré à
galaxy : DESeq2 permet de comparer les deux réacteurs.
Résultats :
1. Résultats de la méta-génomique :
La comparaison montre que l’UTO correspondant aux
groupe des genres Escherichia-Shigella, qui voit son
abondance relative augmenter à presque 25 % de
l’abondance relative dans le réacteur « après » contre moins
de 2,5 % d’abondance relative dans le réacteur « avant ».
2. Résultats de l’étude génomique :
La comparaison du génome de la bactérie Escherichia coli
retrouvée dans le réacteurs « avant » et dans le réacteurs
« après » a montré plusieurs différences significatives. La
plus importante est l’insertion d’une séquence de
nucléotides d’environ 6500 paires de bases en aval du gène
codant pour une transposase : insH1. Cet insert contient
notamment, selon les analyses réalisées par Blast, le gène de
nitrite réductase sous-unité E et sous unité B (norD, et
norB) de la bactérie Bradyrhizobium diazoefficiens. Les
autres différences significatives sont des polymorphismes
nucléotidiques présent dans la région du gène codant pour la
protéine Fur. Trois de ces quatre polymorphismes sont non-
synonymes et ont donc pour conséquence de modifier la
séquence de la protéine Fur et d’après les emplacements des
mutations, ces modifications se situeraient dans le site de
liaison au fer de la protéine (ou entraîneraient l’apparition
d’un codon « stop »).
3. Résultats de la l’étude du transcriptome :
La comparaison de l’abondance de transcription des gènes
de E.coli montre des niveaux d’expression significativement
différents pour certains gènes (1071 gènes
différentiellement exprimés avec une P-value ajustée
inférieure à 0,05). Les gènes les plus différentiellement
exprimés sont récapitulés ci-dessous avec leurs niveaux
d’expressions exprimés en FC (fold change) (tableau I).
Tableau I. Gènes les plus différentiellement exprimés (non exhaustif)
Ndm du gène
Expressidn relative « après »/ »avant
» (FC)
cirA, fepA, entC, 60<FC
entE, entB, fes, fiu, entH 40<FC<60
entD, entF, entA, ybdZ, nrdH, nrdI 25<FC<40
fhuE, ybiX, nrdF, nrdE, yjjZ, zntA, fecR. 10<FC<25
0<FC<0,1
fur, ykgM, zinT, ykgO, sodB, znuA, ykgL
yodB, flu, mepM, grcA, fumA, puuC,
napA, puuB, pliG
0<FC<0,2
Discutidns :
1. Bactérie potentiellement responsable de la
variation de production :
Les résultats obtenues en méta-génomique tendent à indiquer
que l’organisme (plus précisément, l’UTO) responsable du
changement de production est l’UTO Escherichia-Shigella.
L’isolement de la bactérie a permis d’identifier la bactérie
Escherichia coli.
2. Études du mutant de E.coli du réacteur « après » :
Le blast des génome de E.coli « avant » et E.coli « après » à
mis en évidence l’insertion de deux gènes : norB et norD,
initialement présents dans un opéron chez la bactérie
Bradyrhizobium diazoefficiens. L’insertion d’un gène en aval
de insH1, ajouté à la fonction de insH1 semble indiquer que
l’insertion est une conséquence de l’action de insH1, et que
en conséquence, les gènes insérés bénéficieront du
promoteur IS5 (Schnetz & Rak, 1992). Les deux gènes
insérés ont pour rôle de produire des sous-unités de l’enzyme
catalysant l’oxydation de l’oxyde nitrique en dioxyde
d’azote (étape dans la production de Diazote) Bien que ces
sous-unités ne suffisent pas à la production de l’enzyme au
complet, cette insertion reste un indice important dans la
sur-production du diazote détectée dans le réacteur « après »
(cela peut laisser suggérer que ces deux sous-unités sont
capables de réaliser l’activité enzymatique, ou que ces sous
unité interagissent avec d’autres éléments inconnus pour
réaliser l’activité enzymatique). De plus, les mutations dans
le gène fur, ajoutées aux résultats de l’étude
transcriptomique, semblent indiquées que le gène fur n’est
plus exprimé (le FC de fur étant de 0,002). Cette observation
est confirmée par la sur-expression des gènes habituellement
régulés par le complexe « Fur-Fer » (Pakarian & Pawelek,
2016; Dubrac & Touati, 2000; Wang, Wu, & Outten, 2011).
Cette sous-expression du gène fur pourrait avoir jouer un
rôle clé dans la sélection et la prolifération de ce mutant de
E.coli au sein du réacteur « après ». En effet, si la protéine
Fur est absente, alors les gènes codant pour des protéines
responsables de l’absorption du fer pour la bactérie ne sont
plus régulés, permettant à la bactérie d’acquérir le fer plus
aisément que d’autres bactéries possédant le gène fur non-
muté. En conditions de culture « classique », cela serait un
désavantage, car trop de fer est toxique à la bactérie. Mais
en conditions de carence en fer, cela devient un atout
majeurs à la prolifération du mutant.
L’hypothèse privilégié sur ce qui s’est passé lors de
l’intervention de M. Laberge, est qu’il y a eu une confusion
lors de la préparation du milieu, et que le citrate de fer III
ammoniacal a été oublié, entraînant une condition de
carence en fer dans le réacteurs, sélectionnant de fait la
souche mutée qui était la plus apte à survivre en carence en
fer.

Perspectives de recherches :
La forte présence de la bactérie E.coli mutée n’explique pas
a elle seule la forte hausse de production de Diazote. En
effet, la bactérie n’encode pour toutes les sous-unités de la
nitrite oxydase, et n’encode pas (selon les résultats de
génomique) pour les protéines responsable de la production
de N2 à partir de NO2. Il doit donc y avoir une activité
enzymatique avec les 2 sous-unités codées par les gènes de
l’insert d’une part, et d’autre part, il doit donc y avoir dans
le réacteur des espèces capable de réaliser cette dernière
étape du processus de dénitrification. Ces espèces ont réussi
a survivre dans le réacteur « après » et on potentiellement,
vue leur métabolisme de l’azote augmenté, que ce soit à
cause du stress du à l’absence du fer, à des mutations ou à la
hausse du NO2 présent à cause de E.coli. Une perspective
intéressantes serait donc de procédé aux même études de
transcriptomiques et génomiques, mais sur les autres
espèces majoritaire dans le réacteurs « après » (et qui sont
également présentes dans le réacteur « avant »).

Biblidgraphie :
Dubrac, S., & Touati, D. (2000). Fur positive regulation of iron superoxide dismutase in Escherichia coli:
functional analysis of the sodB promoter. Journal of Bacteriology, 182(13), 3802-3808.
Pakarian, P., & Pawelek, P. D. (2016). A novel set of vectors for Fur-controlled protein expression under iron
deprivation in Escherichia coli. BMC Biotechnol, 16(1), 68. doi:10.1186/s12896-016-0298-1
Schnetz, K., & Rak, B. (1992). IS5: a mobile enhancer of transcription in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci
U S A, 89(4), 1244-1248.
Wang, S., Wu, Y., & Outten, F. W. (2011). Fur and the novel regulator YqjI control transcription of the ferric
reductase gene yqjH in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 193(2), 563-574.
doi:10.1128/JB.01062-10