Travaux dirigés suite :

Clonage, carte de restriction et séquençage

Exercice N°1 :

a) Citer les applications de la technique de l’électrophorèse ?

b) Expliquer la nomenclature des enzymes de restriction suivantes : Eco RI
et TaqI ? et quelle est le type de la coupure réalisée par ces deux enzymes
au niveau de la molécule d’ADN ?
c) Donnez le nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme procaryote
couramment utilisé au laboratoire comme hôte d’expression.

Exercice N°2

Le génome du bactériophage delta est un ADN circulaire double brin de

48502pb. Pour réaliser une banque d’ADN génomique de ce phage , nous
disposons d’une préparation de l’ADN génomique du bactériophage et d’un
vecteur de clonage bactérien de type plasmide pUC19 ( Figure 1).

Figure 1 : Structure de pUC19

 a) Définir précisément le rôle des quatre parties du vecteur pUC19 indiquées

par les flèches dans la figure ci-dessus.

Dans un premier temps , on réalise une digestion complète du génome du
bactériophage delta par l’enzyme de restriction BamHI.
b) Quelle est la séquence palindromique coupée par cette enzyme ?

c) Quels types d’extrémités qui sont obtenus ?

Les fragments d'ADN obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse en gel
d'agarose et visualisés sur un transluminateur à UV . On observe six bandes
correspondant à des fragments de taille variable.
d) Grâce à quelle molécule peut-on observer les bandes fluorescentes ?

A partir de la séquence complète du génome du phage delta, les tailles des

fragments obtenus ont été calculées et sont les suivantes: 5505 pb, 5626 pb,
6527 pb, 6770 pb, 7233 pb et 16841 pb.
e) D'après le nombre de fragments observés, combien y a t-il de sites BamHI

sur le génome du bactériophage delta?

f) Pourquoi est-il important de digérer le vecteur avec la même enzyme de

restriction ?
g) Quelle est l'activité enzymatique de la phosphatase?

h) Pour quelle raison est-il important de traiter le vecteur avec de la

phosphatase?
i) Quel est le rôle de la ligase? Combien de types de produits différents de
réaction seront-ils obtenus à l'issue de cette réaction de ligature?

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 Exercice N°3

On souhaite étudier le gène de la souris homologue au gène M qui a été cloné dans un
autre laboratoire. Pour cela, on essaie de cloner au site Eco RI du vecteur plasmidique
pBR330 ( Figure 1), un fragment Eco RI-Eco RI d'ADN génomique de souris portant
le gène homologue au gène M.

Figure 1 : Structure de pBR330

a) Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez

les clones recombinants.

Un des plasmides recombinants contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré par
les enzymes de restriction Bam HI et Eco RI. Après migration et séparation des
fragments d'ADN sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on
obtient les profils de restriction suivants (Figure 2) :

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 Figure 2 : profil éléctrophorétique après digestion

b) Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.

Exercice N°4
Le séquençage d'un ADN monobrin est effectué par la technique de Sanger,
avec une amorce sens. En examinant le schéma représentant une partie de
l'autoradiogramme du gel de migration ( Figure 1) , écrire :
1) la séquence nucléotidique lue directement sur ce schéma du film.
2) la séquence réelle du segment d'ADN monobrin correspondant.

Figure 3 : Résultat de l’autoradiogramme du gel de séquençage

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