Devoir Maison- Génie Génétique, L3 Biochimie section A et B.

Mme KHORSI. Juillet 2020

Durée estimée: 1 heure, mais vous disposez de 3 H pour renvoyer votre travail par E-mail avant
le 02/07/2020 à 18h, en indiquant votre nom, prénom, matricule, section et group et en vous
mettant en copie du mail sur l’adresse E-mail suivante :
l3biochimie2020@gmail.com
Informations à lire avant de commencer le devoir:
- Lire l’ensemble du contenu avant de commencer à répondre.
- Lire impérativement les questions 3 et 4 avant de répondre à la question 7.
- Si vous n’avez pas la possibilité de rendre le devoir sous une version numérique, veuillez
rédiger de façon manuscrite et envoyer sous forme de photos claires, lisibles, avec votre nom
sur chaque photo ou page manuscrite.
- Les manuscrits doivent être gardés précieusement et remis à la rentrée.

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- Dans un laboratoire de recherche en sciences végétales, on projette d’étudier une enzyme Z,

qui présente un intérêt dans un processus de biotransformation.
L’enzyme Z est codée par le gène « zer » porté par le chromosome 4 d’une plante. Le schéma
ci-dessous (Figure 1) représente un fragment de 15 kb du chromosome 4 sur lequel se trouve
le gène « zer », sur ce schéma sont représentées aussi les positions des sites de restriction des 3
enzymes suivantes : EcoRI G/AATTC, BamHI G/GATCC et AluI AG/CT
1- Quel est la particularité de ces enzymes ? 1.5pts
Endonucléases du groupe II (les trois), reconnaissent un site palindromique (doté de
plans de symétries), le clivage ou restriction ou digestion se fait au niveau du site de
reconnaissance.
2- Quels types d’extrémités génèrent ces enzymes (séquences à l’appui)? 2.5pts (avec les
séquences comme sur l’image)
EcoRI et BamHI génèrent des extrémités 5’ cohésives ou collantes.
AluI génère des extrémités franches.
 Position des sites de restriction
AluI BamHI EcoRI BamHI AluI BamHI EcoRI
1kb 3.3kb 6.5kb 8.3kb 10kb 13.3kb 14,5kb
1pb 15kb
Gène « zer »

Figure1 : Fragment chromosomique portant le gène « zer » et positions des sites de restriction
pour EcoRI, BamHI et AluI.

3- Ce fragment est soumis à une digestion simple complète par chacune des enzymes
EcoRI, BamHI et AluI , et à des double digestions complètes EcoRI+BamHI, AluI+
EcoRI, BamHI+AluI et une triple digestion avec EcoRI+BamHI+AluI. Les fragments
obtenus sont séparés par électrophorèse et visualisés par coloration au BET.
- Donnez le résultat de l’éléctrophorégramme attendus dans chacun des cas? 7pts (1pt
par réponse)

4- Le gène « zer » est ensuite détecté grâce à une sonde marquée et extrait à partir du gel.
Quel est l’enzyme ou la combinaison d’enzymes qui permet de récupérer le gène cible
avec le minimum de région indésirable ? 1pt
Il vous a été demandé de bien lire les questions 3 et 4 avant de répondre, voici
l’explication :
 AluI coupe le gène d’intérêt au milieu, donc toutes les possibilités qui l’incluent sont
rejetées.
EcoRI seul : le gène d’intérêt est sur un fragment de 8kb, beaucoup de régions
indésirables.
BamHI seul : le gène zer est sur un fragment de 5kb, mais sur le gel d’électrophorèse 2
fragments de 5 sont superposés, impossible de les séparés et les différenciés.
BamHI + EcoRI : le gène zer est sur le fragment de 5kb (EcoRI a permis la digestion
du deuxième). Donc c’est la seule possibilité d’avoir le gène zer avec le minimum de
régions voisines et sans ambiguïté.
5- Donnez la séquence des extrémités du fragment qui porte le gène d’intérêt ? 0.5pt

6- Une fois le gène récupéré, l’expérimentateur souhaite le cloner dans E. coli à l’aide d’un
vecteur plasmidique pMAC. La carte de restriction de ce plasmide n’étant pas connue,
établir une carte de ce plasmide pour les enzymes BglII, MspI et PstI à l’aide des
données du tableau 1. 4pts
Tableau 1 : Taille des fragments de restriction du plasmide pMAC

Enzymes Site de Taille des fragments générés (en pb)

restriction
BglII A/GATCT 4000
MspI C/CGG 1200, 1320, 1480
PstI CTGCA/G 1160, 1300, 1540
BglII+MspI / 547, 773, 1200, 1480
BglII+PstI / 293, 1160,1247, 1300
MspI+PstI / 480, 500, 680, 700, 800, 840
BglII +PstI+ MspI / 293, 480, 500, 547, 680, 700, 800
7- Quel site de restriction choisirez-vous pour l’insertion du fragment d’intérêt et
pourquoi ? 0.5pts
BglII, extrémités monocaténaire 5’ compatible avec les extrémités de BamHI
8- Donnez la séquence du site de ligation entre l’extrémité plasmidique et l’extrémité du
fragment d’intérêt (un seul site) ? 1pts

Après clonage et expression, l’expérimentateur a démontré que l’enzyme Z possédait

l’activité requise ; cependant, la vitesse de réaction était faible. Il souhaite développer
des variants de l’enzyme avec une cinétique plus rapide; à cette fin, il détermine une
région du gène (R1-R2) de 500pb sur laquelle il va opérer des modifications (Figure 2).
9- Quelle technique de mutagénèse permet de provoquer des mutations dans cette région.
Donnez le principe de cette méthode et la raison de son choix.
 R1
R2

pMAC

Figure 2 : Schéma du plasmide pMAC recombinant portant le gène «zer», la région

entre les sites de restriction R1 et R2 est de 500 pb.

Erreur-prone PCR sur cassette ou casette mutagénéisante. 2pts

Principe : basés sur les propriétés de la taq a généré des mutations (1 mutaion/1000pb)

Un changement au niveau des concentrations des dNTP ou MgCl2 ou l’ajout de MnCL2

entraine l’augmentation du nombre de mutations (7 m/1000pb).

Comme sa concerne uniquement une portion du gène donc on parle de mutagénèse sur
casette. On vas obtenir à la fin un pool de cassette dégénérés ou mutés qu’on va ligué sur le
plasmide.