L3 Biochimie et Biologie Moléculaire 2023-2024

TD1 de Génie Génétique

Exercice n° 1 :

On étudie la réponse au stress salin chez le radis (Raphanus sativus). Cette étude a
montré que les plantes de radis cultivées pendant trois semaines sur un milieu contenant 100
mM de sel (NaCl) accumulaient dans leurs feuilles une protéine appelée P22 qui n'était pas
détectée chez les plantes cultivées sur un milieu normal (sans NaCl). Cette protéine a été
purifiée et les séquences de ses extrémités NH2 et COOH terminales ont été déterminées :

(NH2)-Met-Asp-Val-Phe-Trp-Ala----------//---------Glu-Met-Cys-Trp-Asp-(COOH)

1) Détermination de séquences nucléotidiques à partir de séquences protéiques.

a- Ecrire toutes les séquences d'ADN qui peuvent coder les motifs protéiques (indiqués ci-
dessus) qui correspondent aux extrémités de la protéine P22, donner le nombre de ces
séquences.
b- Ecrire ensuite la séquence unique (séquence "consensus") qui symbolise l'ensemble des
différentes séquences en utilisant le code d'ambiguïté suivant :

R = A ou G ; Y = C ou T ; M = A ou C ; K = G ou T ; S = G ou C ; W = A ou T
H = A, C ou T; B = C, G ou T ; V = A, C ou G ; D = A, G ou T ; N = A, C, G ou T

(exemple : les séquences suivantes, pour lesquelles il y a quatre possibilités à la troisième position, deux à la
sixième et trois à la septième :
GGCGGGAAA
A CC
T G
G
peuvent être schématisées par la séquence "consensus" : GGNGGSVAA)

Code génétique :

AGA UUA AGC

AGG UUG AGU
GCA CGA GGA CUA CCA UCA ACA GUA
GCG CGG GGG AUA CUG CCG UCG ACG GUG UAA
GCC CGC GAC AAC UGC GAA CAA GGC CAC AUC CUC AAA UUC CCC UCC ACC UAC GUC UAG
GCU CGU GAU AAU UGU GAG CAG GGU CAU AUU CUU AAG AUG UUU CCU UCU ACU UGG UAU GUU UGA

ALA ARG ASP ASN CYS GLU GLN GLY HIS ILE LEU LYS MET PHE PRO SER THR TRP TYR VAL Stop

2) Amplification spécifique de séquence.

On souhaite utiliser l'information obtenue dans la question 1 pour amplifier le fragment

d'ADN correspondant à la séquence codante de la protéine P22. Bien entendu, on ne connaît
pas avec précision les séquences nucléotidiques qui correspondent réellement aux extrémités
de la séquence codante que l'on veut amplifier ; on réalise donc l'amplification avec un
mélange d'amorces susceptibles d'amplifier le fragment désiré.

a- Ecrire la séquence de deux amorces (en utilisant le code dégénéré) utilisables pour
amplifier le fragment d'ADN correspondant à la séquence codant la protéine.

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b- Proposer un protocole d'amplification (température des différentes étapes, nombre de

cycle). Schématiser ce qui se passe lors des trois premiers cycles d'amplification en utilisant
vos amorces comme exemple.

3) Carte de restriction du fragment amplifié par PCR.

On réalise ensuite la carte de restriction du fragment amplifié avec les enzymes de restriction
Eco RI, Bam HI, Nco I et Xba I. Les tailles des fragments obtenus sont (en kilo paires de
bases) :

Eco RI Bam HI Nco I Xba I Eco RI – Xba I Eco RI – Nco I Xba I – Nco I
0,4 ND 0,8 0,3 0,3 0,4 0,3
1,4 1 1,5 0,4 1 0,7
1,1 0,8

Ou ND = non digéré

Donner la carte de restriction du fragment amplifié par PCR.

4) Clonage du fragment amplifié par PCR.

On souhaite ensuite cloner le fragment amplifié dans le vecteur pBR331.

Sma I
Résistance à
la kanamycine

Résistance à
l'ampicilline

Bam HI
Origine de
réplication

Les enzymes de restriction disponibles sont : Sma I : CCC*GGG Bam HI : G*GATCC

Proposer une stratégie de clonage (bien indiquer toutes les étapes).

Exercice n° 2 :
Un étudiant qui effectue son premier stage dans un laboratoire de génétique moléculaire se voit
proposer comme sujet de recherche le clonage d'un fragment d'ADN portant le gène cat, qui confère aux
bactéries la résistance au chloramphénicol (ces bactéries sont appelées CmR), dans le plasmide pSB 119.
Le vecteur plasmidique pSB 119 confère aux bactéries qui le renferment la résistance à l'ampicilline (ApR) et
porte une batterie de sites uniques pour plusieurs endonucléases de restriction. Les cartes de restriction du
fragment d'ADN portant le gène cat et de pSB 119 sont représentées dans la figure 1.

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A) Décrire succinctement les étapes du protocole expérimental permettant d'obtenir un clone renfermant
un plasmide recombiné.
B) Quelle est, en paire de bases (pb), la taille de ce plasmide ?
C) En réalisant l'expérience dans des conditions ou un seul fragment d'ADN est inséré dans le vecteur,
deux types de plasmides recombinés, A et B, sont attendus dans cette manipulation. Quels sont-ils ?
Décrire le protocole nécessaire pour leur identification. Quels sont les résultats attendus ? Donner le
nombre et la taille (en pb) des fragments d'ADN générés lors de cette identification.

Avec un des plasmides, A ou B, l'étudiant réalise le protocole suivant :

1- Digestion totale de l'ADN par l'endonucléase Hind III puis inactivation de l'enzyme.
2- Chauffage des produits de la digestion 5 minutes à 70 °C.
3- Recircularisation des molécules par l'enzyme ligase.
4- Transformation de bactéries sensibles à l'ampicilline et au chloramphénicol (Ap S et CmS).
5- Etalement des bactéries transformées sur un milieu contenant de l'ampicilline.
6- Réplique de cent clones ApR sur milieu additionné de chloramphénicol.

Les cent clones ApR se répartissent en 80 clones CmS et 20 clones CmR.

D) Interpréter cette répartition.

E) Les ADN issus des 20 clones CmR sont-ils tous semblables ? Si non, quelles sont les proportions
théoriques des diverses catégories ?
F) Si l'étape n° 2 du protocole est omise tous les clones Ap R obtenus sont CmR. Sachant que l'enzymes
Hind III coupe une liaison phosphodiester sur l'un et l'autre brin avec un décalage de 4 nucléotides,
quelle interprétation peut-on proposer ?

Hind III 5'-----------A A G C T T-----------3'

3'-----------T T C G A A-----------5'

L'étudiant rapporte ses résultats et les conclusions qu'il en a tirées à son directeur de recherche qui le
félicite puis, amusé, lui conseille de reproduire le même protocole en substituant l'enzyme Eco RI à
l'endonucléase Hind III. Il lui prédit des proportions différentes.
Effectivement sur 100 clones ApR analysés, il n'y en a plus que 10 CmR.

G) Pourquoi la proportion de clones CmR a-t-elle changé ?

H) Les ADN issus des 90 clones CmS sont-ils tous semblables ? Si non, quelles sont les proportions
théoriques des diverses catégories ?
FIGURE 1

ORI
ApR

pSB 119
2692 pb Pst I Eco RI Mlu I Pst I

2692 cat
1 403 616 1060 1614 1810

Hind III
Hind III
2296
2236
Eco RI
Pst I
2287 3
2248 Sal I Bam HI
Sma I
2254 2266
2271
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Exercice 3 :

Un expérimentateur souhaite réaliser l'amplification d'un fragment d'ADN génomique par la

technique de PCR (Polymerase Chain Reaction). Il voudrait ensuite cloner ce fragment dans un
vecteur afin d'en réaliser ultérieurement le séquençage. Le vecteur choisi comporte le site multiple de
clonage suivant :

Pst I Bam HI Eco RI Kpn I Xho I

TCTGCAGGATCCCGGGAATTCGGTACCCTCGAG
Sma I

L'enzyme SmaI coupe le site CCCGGG en générant des extrémités franches. Les enzymes BamHI et
EcoRI coupent respectivement les sites GGATCC et GAATTC en générant des extrémités
débordantes.
Peu habitué à ces techniques, l'expérimentateur décide de suivre simultanément deux stratégies pour
mener à bien la première étape de son projet, c'est-à-dire l'amplification par PCR.
Dans la première, il utilise deux oligonucléotides amorces de 21 nucléotides. L'un porte la séquence
d'un fragment d'ADNc dont il souhaite étudier le gène ; il est orienté de 5' vers 3' (oligo 1, figure 1).
L'autre porte la séquence inverse complémentaire (orientée de 3' vers 5'), d'un fragment d'un même
ADNc, située à 350 paires de bases du précédent (oligo 2, figure 1).
Dans la seconde stratégie, il utilise les mêmes oligonucléotides auxquels ont été ajoutés 10 nucléotides
supplémentaires en position 5'. Ces nucléotides constituent un site de restriction différent dans chacun
des deux oligonucléotides. Le site BamHI est introduit en amont de l'oligonucléotide 1 pour former
l'oligo B1 et le site EcoRI en amont de l'oligonucléotide 2 pour former l'oligo E2 (figure 1).
Il est rappelé que les oligonucléotides synthétisés par voie chimique ne sont pas phosphorylés à leur
extrémité 5'.
Oligo B1
TCTAGGATCC

Oligo 1
5' 3'
3' 5'
Oligo 2

GAATTCATCT
Oligo E2

350 paires de bases

Figure 1 : Position des oligonucléotides utilisés pour les amplifications par PCR.

Après la réaction de PCR, les produits sont analysés sur gel d'agarose. Dans les deux expériences, on
observe une seule bande dont la taille est de 350 paires de bases environ.
Le produit amplifié grâce aux oligo 1 et 2 est purifié, puis divisé en deux lots. L'un est incubé avec la
polynucléotide kinase en présence d'ATP (lot 12K) ; l'autre non (lot 12).
Le résultat de l'amplification par les oligo B1 et E2 est soumis à une digestion par EcoRI et BamHI. Le
produit de la réaction est purifié et constitue le lot B1E2.
Chacun de ces lots sera ensuite introduit par ligation dans l'un des vecteurs suivants : Le vecteur V est
destiné à recevoir le produit de PCR 12 ou 12K ; le vecteur V' recevra le fragment B1E2. les vecteurs
V et V' sont préparés par l'action d'endonucléases de restriction appropriées de façon à permettre
l'insertion des produits de PCR. Chaque mélange réactionnel est ensuite scindé en deux lots de volume
égal. L'un est soumis à l'action de la phosphatase alcaline (pour donner VPA et V'PA), l'autre non (V
et V').

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Chaque ligation est effectuée avec les mêmes quantités de vecteur et de fragment de PCR. Les
réactions de ligation suivantes sont réalisées :
(V+12) ; (VPA + 12) ; (V + 12K) ; (VPA + 12K) ; (V' + B1E2) ; (V'PA + B1E2)

Les produits de la ligation sont ensuite introduits dans des bactéries hôtes par une méthode chimique.
Ces bactéries transformées sont finalement étalées sur une boîte de milieu nutritif contenant un
antibiotique afin de sélectionner les germes ayant incorporé le vecteur ou ses dérivés issus de la
ligation. Le tableau 1 donne le résultat du dénombrement et l'analyse des colonies bactériennes
obtenues. L'analyse des colonies a été réalisée en digérant les plasmides extraits de ces colonies par
deux enzymes de restriction permettant de libérer un éventuel fragment inséré dans le vecteur.

Tableau 1

Ligation Réactions Nombre de % de colonies avec % de colonies avec

de ligation colonies vecteur et fragment vecteur sans
de 350 pb fragment de 350 pb
1 V + 12 10 000 <1 > 99
2 VPA + 12 0 - -
3 V + 12K 10 000 <1 > 99
4 VPA + 12K 320 92 8
5 V' + B1E2 4000 88 12
6 V'PA + B1E2 3500 > 99 <1

1- Par quelles endonucléases de restriction doit-on traiter le vecteur pour obtenir les produits V et
V' ?
2- Quel est l'intérêt de faire agir la polynucléotide kinase sur le produit 12 ?
3- Pourquoi est-il inutile de faire agir la polynucléotide kinase sur le produit B1E2 ?
4- Analyser et comparer les résultats des ligations 1 à 4. Quelle(s) informations pouvez-vous
déduire ?
5- Quel est selon vous l'intérêt du traitement du vecteur par la phosphatase alcaline ?
6- Ce traitement offre-t-il le même intérêt dans le cas des vecteurs V et V' ?
7- Selon vous, quelle est la meilleure stratégie pour cloner un fragment de PCR ? Argumentez.

Exercice n°4 :
Une protéine (masse moléculaire 20 kDa) purifiée à partir de cellules musculaires humaines a été
partiellement séquencée après hydrolyse ménagée par des enzymes protéolytiques. Parmi les polypeptides
obtenus, la séquence en acides aminés, indiquée ci-dessous, de l'un d'entre eux a été déterminée :

Tyr-Ser-Gly-Val-Leu-Trp-Met-Lys-Cys-Trp-Glu-Val-Ser-Cys-Ala-Cys

Le but recherché est de cloner l'ADN complémentaire (ADNc) codant pour cette protéine, par la technique de
PCR.

1) D'après la séquence en acides aminés qui vous est donnée et en tenant compte qu'il vous faut des
oligonucléotides d'au moins 17 nucléotides pour amplifier spécifiquement la séquence d'ADNc d'intérêt,
comment allez-vous choisir cet oligonucléotide ? Proposez une séquence type en vous aidant du tableau du code
génétique.
2) Imaginez un protocole expérimental utilisant la PCR permettant d'isoler une partie de l'ADNc codant
pour cette protéine. Donnez-en les grandes étapes en explicitant leurs logiques.
3) Par cette technique de PCR, un fragment de 340 paires de bases (pb) a pu être amplifié. Pourquoi ce
fragment ne peut-il représenter l'ADNc complet ? Quelle est la partie manquante ?
4) Comment procéderiez-vous pour obtenir l'ADNc complet ? Donnez une réponse concise sans
développer les méthodologies mais expliciter la logique de votre démarche.
5) Cet ADNc étant isolé, il a pu être montré que son expression était spécifique des seules cellules
musculaires. Comment, à votre avis, ce résultat a-t-il pu être obtenu ?