TD qPCR

Exercice 1 :

-1/ Quel est l’échantillon de cDNA le plus concentré et

combien de fois? Sachant que le gène de référence est le
18S rRNA
- 2/ Quel organe exprime le plus d’IL10 et combien de
fois plus?
Partie 1:

Le CT du gène endogène est un reflet de la quantité de

cDNA dans l’échantillons

Ici le 18S rRNA est le gène endogène ou gène de

ménage

L’échantillon le plus concentré est celui qui a le CT le

plus petit donc le cerveau.

Il existe une différence de 16 -14 = 2 cycles entre les 2

échantillons

22 = 4 donc l’échantillon du cerveau est 4 fois plus

concentré que celui du foie
Partie 2:
On compare les DCT des 2 échantillons :

l’IL10 est plus exprimé dans le foie que dans le cerveau

Il existe une différence de 6 CT entre les 2 échantillons

donc l’IL-10 est exprimé 64 fois plus dans le foie
Exemple 2:
Une culture cellulaire subit un traitement par une drogue.
On compare l’expression d’un gène au cours du temps après
traitement.

Quelle est l’action de la drogue sur l’expression du gène

d’intérêt, en fonction du temps?
 On calcule les DCT pour chaque temps

DCT t0 = 35-15 =20

DCT t12= 30-15 =15
DCT t24 = 24-9 =15
DCT t48 = 34-14 =20
T12= DCT t12- DCT t0= -5 25=32
T24= 15-20= -5
T48= 20-20=0

Conclusion: la drogue active l’expression du gène

d’intérêt d’un facteur 32 entre 12 et 24h après
administration. On constate un retour à l’expression
basale 48h après traitement.
Correction TD2
•Quelles sont les différentes étapes d’une réaction de
PCR?
Le PCR est constitué trois étapes : Dénaturation d’ADN,
hybridation des amorces, élongation
A quoi servent-elles?
Pour amplifier l’ADN ou pour cibler un segment d’ADN
particulier dans le génome
•Quels sont les différents constituants nécessaires à la
réaction de PCR?
L’ADN matrice, dNTP, Taq polymérase, les amorces,
tampon, Mg2+
Comment désigner les amorces (spécifiques) ?

•L’amorce doit faire une vingtaine de paires de bases

•Riche en GC pour avoir des liaisons hydrogènes plus solide

•Température de fusion des deux amorces doivent être plus ou

moins identiques et proches de (65°), l’hybridation se faisant
à 60°C environ soit un Tm – 4 °C environ.

•En fin les amorces ne doivent pas s’hybrider entre elle (pas
de dimérisation)
 Oligonucléotides à synthétiser

Sens: 5’ CAGGAGCAGGGAGGGCAG 3’
Anti sens: 5’ GTCTCCACATGCCCAGTTTC 3’

Tm sens  : 13x4+ 5x2 = 52 + 10 = 62

Tm antisen  : 11x4 +9X2 = 44 + 18 = 62

Taille fragment PCR : (302-36)+1=267 paires de bases

Programme de PCR

1’ 94°C

45X

[1’ 95°C
1’ 62°C
1’ 72°C]

3’ 72°C