UNIVERSITE MARIEN NGOUABI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DE LICENCE
PARCOURS DE BIOLOGIE

LICENCE III : BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE (BCM)

EXPOSE DE BIOPHYSIQUE
La PCR classique et le Séquençage (NGS) : Techniques d’analyses des
molécules d’ADN

Présenté par le groupe III constitué de :

1- BOUNGA Claid
2- BOUNGOUHT Brad
3- ELENGA Erudit
4- EOUASSE Kathia
5- ESSIE Céleste
6- LEBAKI Rosane
7- MIKALA John Olivier
8- MOUNIANGA Guercia
9- NGOMA MAKOSSO Babine Benicia
10- OMBELI Rêche

Responsable du cours :

Dr. Aimé Christian KAYATH

 SOMMAIRE
Introduction………………………………………………………………3
I-PCR classique ……………………………………………………….…3
1. Définition…………………………………………………………..3
2. Principe…………………………………………………………….3
3. Caractéristique……………………………………………………..4
4. Paramètres physicochimiques……………………….…….……….4
5. Lois physiques………………………………………….…………..4
II- pyroséquençage…………………………………………….………….5
a) Définition ……………………………………………….………….5
b) Principe…………………………………………………….……….5
c) Caractéristique…………………………………………….………..5

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 Introduction
Les acides nucléiques (en particulier l’ADN), sont des macromolécules contenant
l’information génétique à l’origine du développement, du fonctionnement, et de la
reproduction conforme des êtres vivants. L’analyse de ce dernier nous renseignera sur
l’identité de l’individu mais pas seulement, il sera aussi bénéfique dans d’autres
domaines tels que la médecine légale, et bien d’autre.

Afin d’analyser cet ADN, il faut l’isoler des autres constituants cellulaires puis le
purifier. Après avoir obtenu un ADN pur, nous pouvons ainsi procéder a différentes
méthodes d’analyses ; parmi lesquelles la PCR et le séquençage (NGS).

LA PCR CLASSIQUE

1. Définitions :
La réaction en chaine par polymérisation (PCR) est une technique d’amplification
ciblée in vitro de l’ADN permettant à partir des quantités peu abondante d’obtenir
d’importante quantité d’ADN.

2. Principe :
Le principe consiste à amplifier une région spécifique d’une séquence d’ADN à partir
des amorces spécifiques capable de s’hybrider avec notre séquence en présence
de l’ADN polymérase.

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 3. Caractéristiques:
Dans le mélange réactionnel de la PCR est constitué de :
 L’ADN matriciel contenant la séquence à amplifier souvent double brin
 Les desoxyribonucléotides triphosphates qui ont pour fonction de synthétiser
un nouveau brin complémentaire
 Tampon qui apporte une stabilité PH à l’enzyme
 ADN polymérase thermorésistante (la Taq polymérase) qui permet la
synthèse des brins complémentaires néoformés
 Les oligonucléotides ou les amorces (up et down) complémentaires aux
extrémités 3’ de la région à amplifier. Ces derniers sont nécessaires pour
l’amplification, car la Taq polymérase ne peut reconnaitre que les régions
double brins.

La PCR se déroule ont trois étapes parmi lesquelles :

 La dénaturation qui consiste à la séparation des brins d’ADN sous l’effet

de l’augmentation de la température à environ 95°C
 L’hybridation correspondant à la fixation des amorces sur les brins
d’ADN à faible température 60°C à 65°C ;
 L’élongation est une étape de synthèse de nouveau brin complémentaire
à la séquence choisi, la durée de cette étape dépond de la rapidité de
l’enzyme et de la taille du fragment avec la taq polymérase elle se fait à
72°C.

Ces trois étapes vont ainsi constituer un cycle, la PCR va alors s’effectuer en cycles
qui vont être calibrés par un appareil programmable : le termocycleur. A la fin de ces
cycles, on obtient le produit de PCR(les amplicons) constitué de nombreux fragment
d’ADN. Ces amplicons peuvent alors être visualisés par une électrophorèse en gel
d’agarose en fonction de leur taille.

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 4. Paramètres
plusieurs paramètres sont mis en évidences parmi lesquels : la température, le pH ,
l’intensité et la tension provenant du thermocycleur.

5. Lois physiques :
La température ‘ chaleur émise lors de la réaction :
 La variation d’enthalpie: Δ𝐻 = Δ𝑈 + Δ𝑃𝑉 avec Δ𝐻 = 0, par ce que
l’enzyme fournie elle-même son énergie d’activation
Δ𝐻 = Δ𝑃𝑉

Le pH : la Taq polymérase étant une enzyme qui agit à un pH donné, le tampon et

les sels de magnésium qui assurent la stabilité du pH réactionnel
PH = - log[H3O +]

 L’intensité du générateur délivre une tension des résistances : loi d’hom

𝑼
R= ; elle caractérise la tension aux bornes d’une résistance par rapport à
𝑰

l’intensité de la traversant
 Les lois de Kirch off (loi de mailles et des nœuds) qui donnent les relations
entre les différentes grandeurs physiques.

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 Il est nécessaire de noter que la PCR ne nous permet pas de voir la qualité de
l’ADN. Une méthode à partir de laquelle on peut observer la qualité de l’ADN
et ces modifications est le séquençage ; ce dernier permet d’observer si le
fragment obtenu après la PCR est le bon.
Le séquençage est une méthode qui permet de déterminer la succession linéaire des
nucléotides. Il existe plusieurs méthodes de séquençages parmi lesquelles :
 La méthode chimique : c’est la technique de Maxam et Gilbert basé sur une
dégradation chimique de l’ADN.
 La méthode enzymatique : c’est une technique de Sanger qui consiste à
polymériser l’ADN à l’aide des amorces, l’ADN polymérase, les dNTP,
les ddNTP fluorescent. L’élongation de l’amorce est réalisée par la Taq
polymérase en ajoutant aléatoirement des dNTP et des ddNTP qui vont
arrêter la synthèse de brin

Outre ces méthodes, il y a une méthode de séquençage haut débit encore appelé the
New génération séquensing (NGS) qui est une adaptation de la méthode de Sanger,
les NGS rassemblent les méthodes de pyroséquençage, séquençage de polonie et bien
d’autre.

II- Pyroséquencage

a) Définition :
le pyroséquencage est une technique de séquençage de l’ADN qui permet
d’effectuer un séquençage plus rapide que la méthode de Sanger.

b) Principe :
Le pyroséquençage est base sur le séquençage par synthèse en détectant le
nucléotide incorpore par l’ADN polymérase.
c) Caractéristiques :

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Le pyroséquençage nécessite 4 enzymes : la polymérase, la sulfurylase, la luciférase
et l’apyrase. En effet, une fois que l’amorce s’hybride en extrémité 3’ OH de notre
simple brin, l’ADN polymérase commence à incorporé les dNTP, et à chaque fois
qu’un dNTP est incorporé, une molécule de pyrophosphate est libéré, le
pyrophosphate libéré va s’associé à une molécule APS, cette réaction catalysée par
l’ATP sulfurase va conduire à la libération d’un ATP ; en présence de ce dernier la
luciférase convertie la luciférine en oxylucéferine, un photon est émis et la lumière
captée par le capteur CCD .

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