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1292-1305 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. ©2002 Oxford University Press

ENQUÊTE ET RÉSUMÉ
La PCR en temps réel en virologie
Ian M. Mackay1,2,3,*, Katherine E. Arden4 et Andreas Nitsche5
1Unité de recherche en virologie clinique, Centre de recherche sur les virus Sir Albert Sakzewski, Royal Children's
Hospital, Brisbane, Australie, 2Département de pédiatrie et 3Centre de virologie médicale clinique, Université du
Queensland, Queensland, Australie, 4Laboratoire de transport membranaire, Division du cancer et de la biologie
cellulaire, Institut de recherche médicale du Queensland, Queensland, Australie et 5TIB MOLBIOL, Tempelhofer Weg
11-12, D-10829 Berlin, Allemagne.

Reçu le 31 octobre 2001 ; révisé le 2 janvier 2002 ; accepté le 14 janvier 2002.

utilisée comme le nouvel étalon-or pour détecter une grande

RÉSUMÉ
variété de modèles dans toute une série de spécialités
L'utilisation de la réaction en chaîne de la scientifiques, dont la virologie. La méthode utilise une paire
polymérase (PCR) dans les diagnostics d'oligonucléotides synthétiques ou amorces,
moléculaires a augmenté au point qu'elle est
maintenant acceptée comme la référence pour la
détection d'acides nucléiques d'origines diverses et
qu'elle est devenue un outil essentiel dans les
laboratoires de recherche. La PCR en temps réel a
entraîné une plus grande acceptation de la PCR en
raison de sa rapidité, de sa sensibilité et de sa
reproductibilité accrues, ainsi que de la réduction
du risque de contamination par transfert. Il existe
actuellement cinq principaux produits chimiques
utilisés pour la détection du produit de la PCR en
temps réel. Il s'agit des fluorophores de liaison à
l'ADN, de l'endonucléase 5, des oligosondes
linéaires et en épingle à cheveux adjacentes et des
amplificateurs autofluorescents, qui sont décrits en
détail. Nous abordons également les facteurs qui
ont limité le développement de la PCR en temps réel
multi plexes ainsi que le rôle de la PCR en temps réel
dans la quantification des acides nucléiques. Le
matériel d'amplification et les produits chimiques de
détection fluorogène ont évolué rapidement au fur
et à mesure que la compréhension de la PCR en
temps réel s'est développée et cette revue a pour
but de mettre à jour les scientifiques sur l'état actuel
de la technique. Nous décrivons le contexte, les
avantages et les limites de la PCR en temps réel et
nous passons en revue la littérature relative à la
détection des virus dans les laboratoires de routine
et de recherche afin de nous concentrer sur l'un des
nombreux domaines dans lesquels l'application de la
PCR en temps réel a apporté des avantages
méthodologiques significatifs et amélioré les
résultats pour les patients. Cependant, la technologie
discutée a été appliquée à d'autres domaines de la
microbiologie ainsi qu'à des études sur l'expression
des gènes et les maladies génétiques.

CONTEXTE
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1,2) a été

chacune s'hybridant à un brin d'un ADN double brin
(ADNdb) cible, la paire couvrant une région qui sera
reproduite de manière exponentielle. L'amorce hybridée sert
de substrat à une ADN polymérase (le plus souvent dérivée
de la bactérie thermophile Thermus aquaticus et appelée
Taq), qui crée un brin complémentaire par l'ajout séquentiel de
désoxynucléotides. Le processus peut être résumé en trois
étapes : (i) séparation de l'ADNdb à des températures >90C,
(ii) recuit de l'amorce à 50-75C, et (iii) extension optimale à
72-78C (Fig. 1A). Le taux de changement de température ou
rampe
la durée de l'incubation à chaque température et le nombre de
répétitions de chaque série de températures (ou cycle) sont
contrôlés par un thermocycleur programmable. Les technologies
actuelles ont considérablement réduit les temps de rampe en
utilisant des blocs chauffants à commande électronique ou
des flux d'air chauffé par ventilateur pour modérer la
température de la réaction. En conséquence, la PCR est en
train de remplacer certains des tests de référence en matière
de culture cellulaire, d'antigénémie et de sérologie (3). Les
combinaisons existantes de PCR et de tests de détection
(appelées ici "PCR conventionnelle") ont été utilisées pour
obtenir des données quantitatives avec des résultats
prometteurs. Cependant, ces approches ont souffert des
*À qui la correspondance doit être adressée : CVRU, SASVRC, Royal Children's Hospital, Herston Road, Herston, Queensland 4029, Australie. Tél :
+61 3636 8716 ; Fax : +61 3636 1401 ; Courriel : i.mackay@mailbox.uq.edu.au.
étapes laborieuses de manipulation post-PCR nécessaires pour
évaluer l'amplicon (4).
La détection traditionnelle de l'ADN amplifié repose sur
l'électrophorèse des acides nucléiques en présence de bromure
d'éthidium et l'analyse visuelle ou densitométrique des bandes
résultantes après irradiation par la lumière ultraviolette (5). La
détection de l'amplicon par Southern blot en utilisant
l'hybridation avec une sonde oligonucléotidique marquée
prend également beaucoup de temps et nécessite de multiples
étapes de manipulation du produit de la PCR, ce qui risque
encore plus de propager l'amplicon dans tout le laboratoire
(6). Une autre solution consiste à utiliser la PCR-ELISA pour
capturer l'amplicon sur une phase solide en utilisant des
amorces marquées à la biotine ou à la digoxigénine, des
sondes oligonucléotidiques (oligosondes) ou directement
après incorporation de la digoxigénine dans l'amplicon (7-12).
Une fois capturé, l'amplicon peut être détecté à l'aide d'une
molécule rapporteur avidine ou anti-digoxigénine marquée par
une enzyme, comme dans un format ELISA standard.
La possibilité de visualiser la détection de l'amplicon au fur
et à mesure de l'amplification, contrairement aux tests
conventionnels, était la bienvenue (13). Cette approche a
permis de mieux comprendre la cinétique de la réaction.
 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6 1293

des amplicons avec des molécules fluorogènes.

Figure 1. Amplification cinétique. (A) Tracé idéalisé de la température en

fonction du temps pendant un cycle PCR unique comprenant les étapes de
dénaturation (D), d'hybridation de l'amorce et de la sonde (A) et d'extension
de l'amorce (E). Aux valeurs optimales indiquées
Dans les plages de température, l'ADNdb est dénaturé ( TD), les oligosondes
sont recuites (TM-PROBE) et enfin les amorces sont recuites comme précurseur de
leur extension (TM-PRIMER). La température réelle, représentée par une ligne
pointillée, peut dépasser la température souhaitée à des degrés divers, en
fonction de la qualité du thermocycleur utilisé.
(B) La courbe d'amplification idéale d'une PCR en temps réel (en gras),
lorsqu'elle est tracée sous forme d'intensité de fluorescence en fonction du
nombre de cycles, est une courbe de croissance sigmoïdale typique.
L'amplification précoce ne peut pas être visualisée car le signal de détection
est indiscernable du fond. Cependant, lorsqu'une quantité suffisante
d'amplicon est présente, la progression exponentielle du test peut être suivie
car le taux d'amplification entre dans une phase log-linéaire (LP). Dans des
conditions idéales, la quantité d'amplicon augmente à un rythme d'environ un
log10 tous les trois cycles. Au fur et à mesure que les amorces et l'enzyme
deviennent limitantes et que les produits inhibiteurs de la PCR s'accumulent,
la réaction ralentit, entre dans une phase de transition (TP) et atteint
finalement la phase de plateau (PP) où l'augmentation du rendement en
produits est faible ou nulle. Le point auquel la fluorescence passe d'un niveau
insignifiant à un niveau clairement détectable est appelé le cycle de seuil ( CT ;
indiqué par un signe
flèche), et cette valeur est utilisée dans le calcul de la quantité de gabarits lors
de la mise en œuvre de l'opération.
PCR quantitative en temps réel. Sont également représentées les courbes
représentant un titrage optimal de la matrice (en gris), consistant en des
concentrations initiales de matrice plus élevées et plus faibles, qui produisent
des valeurs de CT plus faibles ou plus élevées, respectivement. Les données
pour la construction d'une courbe standard sont extraites du LP, ce qui permet
ensuite de déterminer la concentration d'échantillons inconnus.

et c'est le fondement de la PCR cinétique ou "en temps réel"

(Fig. 1B) (6,14-17). La PCR en temps réel a déjà fait ses preuves
dans les laboratoires du monde entier, en s'appuyant sur
l'énorme quantité de données générées par les tests PCR
conventionnels.
Le suivi de l'accumulation d'amplicons en temps réel a été
rendu possible par le marquage des amorces, des sondes ou
 Dans la section suivante, nous nous concentrerons sur les
Les oligosondes radiogènes présentent des avantages par processus de détection qui distinguent la PCR en temps réel
rapport aux oligosondes radiogènes, notamment l'absence de la PCR classique.
d'émissions radioactives, la facilité d'élimination et une durée
de conservation prolongée (18).
La rapidité accrue de la PCR en temps réel est largement
due à la réduction des temps de cycle, à la suppression des
procédures de détection post-PCR et à l'utilisation de
marqueurs fluorogènes et de méthodes sensibles de détection
de leurs émissions (19,20). La réduction de la taille des
amplicons généralement recommandée par les créateurs de
tests commerciaux en temps réel peut également jouer un
rôle dans cette rapidité, cependant nous avons montré que la
diminution de la taille des produits n'améliore pas
nécessairement l'efficacité de la PCR (21).
Les inconvénients de l'utilisation de la PCR en temps réel
par rapport à la PCR classique comprennent l'impossibilité de
contrôler la taille de l'amplicon sans ouvrir le système,
l'incompatibilité de certaines plates-formes avec certains
produits chimiques fluorogènes et les capacités multiplex
relativement limitées des applications actuelles. En outre, les
frais de démarrage de la PCR en temps réel peuvent être
prohibitifs lorsqu'elle est utilisée dans des laboratoires à
faible débit. Ces inconvénients sont principalement dus aux
limitations du matériel du système ou des colorants
fluorogènes ou "fluorophores" disponibles, qui seront tous
deux examinés plus en détail.
Comme la plupart des méthodes de PCR en temps réel les
plus répandues dépendent de l'hybridation d'une oligosonde à
sa séquence complémentaire sur l'un des brins de l'amplicon,
l'utilisation d'une plus grande quantité de l'amorce qui crée ce
brin est bénéfique pour la génération d'un signal fluorescent
accru (22). Il a été démontré que la PCR asymétrique, comme
on l'appelle, produit une meilleure fluorescence à partir d'une
PCR d'oligosondes en épingle à cheveux (23) et nous avons
constaté qu'elle était directement applicable à d'autres essais
d'hybridation d'oligosondes.
Les oligosondes fluorogènes les plus couramment utilisées
reposent sur le transfert d'énergie par résonance de
fluorescence (FRET ; figure 2) entre les marqueurs
fluorogènes ou entre un fluorophore et un quencher non
fluorescent (NFQ) sombre ou à " trou noir ", qui disperse
l'énergie sous forme de chaleur plutôt que de fluorescence.
Le FRET est un processus spectroscopique par lequel
l'énergie est transmise entre des molécules séparées de 10 à
100 Å et dont les spectres d'émission et d'absorption se
chevauchent (24,25). Förster a principalement développé la
théorie derrière ce processus : le mécanisme est une
interaction dipôle induite non radiative (26). L'efficacité du
transfert d'énergie est proportionnelle à la sixième puissance
inverse de la distance (R) entre les fluorophores donneur et
accepteur (1/R6) (27,28).
La manipulation post-amplification de l'amplicon n'est pas
nécessaire pour la PCR en temps réel, c'est pourquoi ces tests
sont décrits comme des systèmes "fermés" ou homogènes.
Les avantages des systèmes homogènes sont notamment la
réduction du délai d'obtention des résultats, la minimisation
du potentiel de contamination par transfert et la possibilité
d'examiner de près les performances du test (29). En outre, la
PCR en temps réel s'est avérée rentable lorsqu'elle est mise
en œuvre dans un laboratoire à haut débit (30), en particulier
lorsqu'elle remplace les approches conventionnelles de
détection des virus basées sur la culture.
Dans la suite de cet article, la théorie qui sous-tend la PCR
en temps réel sera examinée et son utilisation rapidement
croissante dans les domaines de la virologie humaine sera
utilisée comme illustration.

DÉTECTION DES AMPLICONS

1294 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6

Cette approche

Figure 2. Mécanismes fluorogéniques. Lorsque le rapporteur (R) et le

quencher (Q, ouvert) d'une sonde nucléasique  sont à proximité l'un de
l'autre, comme dans la figure (A), le quencher "détourne" les émissions
résultant de l'excitation du rapporteur par la source lumineuse de l'instrument.
Le quencher émet alors cette énergie (flèches pleines). Lorsque les
fluorophores sont séparés au-delà d'une certaine distance, comme c'est le cas
lors de l'hydrolyse décrite en (B), le quencher n'exerce plus aucune influence
et le rapporteur émet à une longueur d'onde distincte (flèches pointillées) qui
est enregistrée par l'instrument. Dans le processus inverse illustré en (C), en
utilisant des oligosondes adjacentes, les fluorophores commencent comme
des entités séparées. Un signal provenant de l'accepteur (A) ne peut être
généré que lorsque le donneur (D) est à proximité, comme illustré en (D).
Cela se produit à la suite de l'hybridation adjacente des oligosondes à
l'amplicon cible. En (E), une autre forme d'extinction est montrée, causée par
le contact intime de marqueurs attachés à des oligosondes en épingle à
cheveux (balise moléculaire, sunrise ou scorpion). Le fluorophore (F) et un
NFQ (Q, fermé) interagissent davantage par collision que par FRET,
perturbant la structure électronique de l'autre et transmettant directement
l'énergie d'excitation qui est dissipée sous forme de chaleur (flèches en
pointillés). Lorsque les étiquettes sont séparées par la rupture de l'épingle à
cheveux, comme c'est le cas en (F), le fluorophore est libre de fluo- réser
(flèches en pointillés).

Essais de PCR. Cinq grandes chimies sont actuellement

utilisées et peuvent être classées en méthodes de détection par
PCR en temps réel spécifiques ou non spécifiques de la
séquence de l'amplicon (31). Chacune de ces chimies a une
nomenclature associée pour décrire les marqueurs
fluorescents ; cependant, pour la discussion générale, le terme
fluorophore continuera à être utilisé pour décrire ces entités.
Bien que cet examen se concentre sur l'utilisation de ces
produits chimiques dans les applications en temps réel, ils
peuvent également être utilisés comme marqueurs pour la
détection d'amplicons au point final.

Fluorophores se liant à l'ADN

La base des méthodes de détection non spécifique des
séquences est la molécule fluorogène se liant à l'ADN. Les
approches les plus anciennes et les plus simples de la PCR en
temps réel font partie de ce groupe. Le bromure d'éthidium
(32), YO-PRO-1 (33,34) et le vert SYBR® 1
(35) sont tous fluorescents lorsqu'ils sont associés à l'ADNdb
qui est exposé à une longueur d'onde de lumière appropriée.
 amplicon, ce système peut effectuer un génotypage à tube
nécessite moins de connaissances spécialisées que la unique. Cette capacité, qui fait appel à l'analyse de la courbe
conception d'oligosondes fluorogéniques, est moins coûteuse et de fusion fluorescente, fournit des informations importantes
ne souffre pas de la variation de la séquence de la matrice, qui sur la séquence à laquelle les oligosondes se lient. La ou les
peut annuler l'hybridation d'une oligosonde (36). La formation mutations sous l'une ou les deux oligosondes peuvent être
d'amorce-dimère (37) est courante et, avec la formation de déterminées par la diminution de la courbe de fusion.
produits spécifiques, est fortement associée à l'entrée de la
PCR dans la phase de plateau (Fig. 1B) (38,39). L'association
d'un fluorophore de liaison à l'ADN avec un dimère d'amorce
ou d'autres produits d'amplification non spécifiques peut
rendre l'interprétation des résultats confuse. L'ajout d'une
courte incubation à température plus élevée après l'étape
d'extension au cours de laquelle les données de fluorescence
sont acquises minimise la contribution de ces produits au
signal de fluorescence (40). Le problème des amorces-
dimères peut également être abordé à l'aide d'un logiciel
capable d'analyser les courbes de fusion fluorescentes. Cette
méthode fait appel à la température à laquelle l'amplicon
d'ADNdb est
dénaturé (TD ; Fig. 1A). L'amorce-dimère plus courte peut
être distinguée par sa TD réduite par rapport à l'amplicon
complet. L'analyse des courbes de fusion de l'amplicon en
présence de SYBR green 1 a démontré que la sensibilité
pratique des fluorophores liant l'ADN est limitée par une
amplification non spécifique à de faibles concentrations initiales
de matrice.
Les fluorophores se liant à l'ADN augmentent également le
TD et élargissent la transition de fusion, ce qui nécessite une
modification substantielle de la séquence pour produire un
changement du TD. Les oligosondes sont capables de
discriminer
mutations en un seul point en utilisant la température à
laquelle 50% des
les duplex oligosonde-cible se séparent (41). Cette
température est appelée température de fusion (TM) et dépend
de la concentration de l'ADNdb, de sa longueur, des
nucléotides, de la taille de l'ADNdb et de la taille de la cible.
et la composition du solvant, et est souvent confondu avec le
TD (Fig. 1A) (42).

Oligosondes linéaires
L'utilisation d'une paire d'oligosondes d'hybridation
fluorogènes adjacentes a été décrite pour la première fois à la
fin des années 1980 (43,44) et, maintenant connues sous le
nom de "HybProbes", elles sont devenues la méthode de
choix pour le LightCycler™ (Roche Molecular
Biochemicals, Allemagne), un fluorimètre et thermocycleur
capillaire à microvolume avec contrôle rapide de la
température (20,45). L'oligosonde en amont est marquée
avec un fluorophore donneur  (FITC) et la sonde en aval est
généralement marquée avec un fluorophore accepteur
LightCycler Red 640 ou Red 705 à l'extrémité  de sorte que
lorsque les deux oligosondes sont hybridées, les deux
fluorophores sont situés à moins de 10 nt l'un de l'autre, ce
qui leur vaut parfois le nom de sondes "kissing" (figures 2C,
D et 3C). Les capillaires composites en plastique et en verre
sont optiquement clairs et font office de cuvettes pour
l'analyse de la fluorescence, tout en facilitant le transfert
rapide de la chaleur. Les capillaires sont tournés devant une
diode émettrice de lumière bleue et la fluorescence est
surveillée par trois diodes de photodétection avec des filtres
de longueurs d'onde différentes. La température est modifiée
en chauffant et en refroidissant rapidement l'air à l'aide d'un
élément chauffant et d'un ventilateur qui produisent des taux
de rampe de 20C/s, ce qui prolonge la survie de la
polymérase (46). En outre, comme les oligosondes ne sont
pas hydrolysées de manière significative pendant
l'amplification (47) et que le LightCycler est capable de
surveiller les changements de l'émission de fluorescence
pendant la dénaturation des oligosondes adjacentes de leur
 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6 1295

Figure 3. Chimie des oligosondes. (A) Oligosondes Nucléase 5. Lorsque l'ADN polymérase (pol) progresse le long du brin concerné, elle déplace puis hydrolyse
l'oligosonde via son activité endonucléase 53. Une fois que le rapporteur (R) est soustrait à l'influence extinctrice du quencher (Q, ouvert), il peut libérer l'énergie
d'excitation à une longueur d'onde contrôlée par l'instrument et différente des émissions du quencher. L'encart montre la molécule NFQ et MGB qui constituent
les oligosondes nucléasiques MGB améliorées. (B) Oligosondes en épingle à cheveux. L'hybridation de l'oligosonde à la cible sépare suffisamment le
fluorophore (F) et le quencher non fluorescent (Q, fermé) pour permettre l'émission du fluorophore excité, qui est contrôlée. L'encart montre une oligosonde en
épingle à cheveux à décalage de longueur d'onde incorporant une molécule de capture. (C) Oligosondes adjacentes. L'hybridation adjacente entraîne un signal
FRET dû à l'interaction entre le donneur et le récepteur.
(D) et les fluorophores de l'accepteur (A). Ce système bimoléculaire acquiert ses données à partir des émissions de l'accepteur de manière opposée à la fonction
de la chimie des oligosondes nucléasiques. (D) amorces Sunrise. Le brin opposé est dupliqué afin que la structure en épingle à cheveux de l'amorce puisse être
perturbée. Cela sépare les marqueurs, éliminant l'extinction d'une manière similaire à celle de l'oligosonde en épingle à cheveux. (E) Amorces Scorpion. L'amorce ne
nécessite pas l'extension du brin complémentaire ; en fait, elle bloque l'extension pour garantir que l'épingle à cheveux de la sonde n'est perturbée que par une
hybridation spécifique avec une séquence complémentaire conçue pour se trouver en aval de son propre brin naissant. L'encart montre un scorpion duplex qui
échange la structure tige-boucle contre un élément d'amorce marqué à l'extrémité par le fluorophore et un oligonucléotide complémentaire distinct marqué par
un quencher à l'extrémité 5.

La température qu'ils subissent en raison de la déstabilisation
du duplex oligo-sonde/cible (Fig. 4). Cela a permis
d'améliorer considérablement la rapidité du diagnostic des
maladies génétiques et d'accroître le nombre d'approches PCR
multiplex pour le diagnostic des maladies génétiques.
la détection d'agents pathogènes viraux apparentés. Malgré le
fait que l'hybridation n'atteigne pas l'équilibre avec ces
vitesses de rampe, les valeurs apparentes du TM sont à la fois
reproductibles et fiables.
caractéristique d'un duplex sonde/cible donné (48). Cependant,
1296 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6
Figure 4. Analyse de la courbe de fusion par fluorescence. A la fin d'une
PCR en temps réel utilisant une paire d'oligosondes adjacentes, la réaction
peut être refroidie à une température inférieure au TM attendu des oligosondes
puis chauffée au-dessus de 85C à une fraction de degré par seconde (B).
Pendant le chauffage, les émissions de l'accepteur peuvent être acquises en
permanence (C). Le logiciel calcule la dérivée négative de la fluorescence en
fonction du temps, produisant des pics clairs qui indiquent le TM de la
transition de fusion oligosonde-cible (D). Lorsqu'une ou plusieurs mutations
sont
présent sous l'une ou les deux oligosondes (A), ce TM est décalé et ce décalage
peut être utilisé à des fins diagnostiques pour discriminer les polymorphismes
à nucléotide unique dans les
modèle. Idéalement, l'une des oligosondes, l'ancre, est conçue pour se lier à
une région de séquence stable, tandis que l'autre, le capteur, couvrira le
mésappariement. Les mésappariements près du centre de la sonde et flanqués
de paires G:C sont plus déstabilisants que les mésappariements près des
extrémités de l'oligosonde flanquées de paires A:T.
les capillaires sont fragiles et nécessitent une certaine
expérience pour être manipulés (49).
Lorsque l'on compare les signaux des différentes chimies, la
destruction des oligosondes nucléasiques se poursuit malgré un
plateau dans l'accumulation des produits, tandis que la
fluorescence du vert SYBR 1 dans le contrôle sans matrice
augmente généralement de manière non spécifique au cours
des derniers cycles. La fluorescence des oligosondes adjacentes
commence à diminuer à mesure que le taux de collision entre
le nombre croissant de brins d'amplicons complémentaires
augmente, favorisant la formation d'ADNdb plutôt que
l'hybridation de l'oligosonde à son brin d'ADN cible. En outre,
il est possible que
une partie de l'oligosonde est consommée par l'activité
endonucléasique liée à la séquence (50,51). Les trois chimies
d'oligosondes (SYBR Green I, nucléase et oligosondes
adjacentes) semblent capables de détecter le produit amplifié
avec approximativement la même sensibilité (20).
Des combinaisons des approches ci-dessus apparaissent
aujourd'hui à mesure que les utilisateurs de l'instrumentation
se familiarisent avec les concepts de la PCR en temps réel et
contribuent à la littérature. Si une oligosonde linéaire marquée
par un fluorophore et spécifique à une séquence est ajoutée à
un mélange SYBR green 1, actuellement appelé système Bi-
probe, une FRET se produira et une couche supplémentaire de
spécificité peut être obtenue (44,52,53). Un test utilisant une
oligosonde marquée au BODIPY®FL- a été adapté pour être
exécuté dans le LightCycler en utilisant une séquence cible de
-globine (54). La sonde a été conçue de manière à ce que le
fluorophore soit situé sur une cytosine terminale et soit éteint
par la proximité d'une guanine complémentaire. L'essai a
démontré que l'extinction varie linéairement avec la
concentration de la matrice dans une gamme de concentration
définie. Le fluorophore FITC couramment utilisé est
intrinsèquement éteint par les nucléotides désoxyguanosine.
Le niveau d'extinction peut être augmenté si davantage de
guanines sont présentes ou si une seule guanine est située
dans la première position de surplomb, 1 nt au-delà de
l'extrémité de la sonde marquée par le fluorophore. Cette
approche de la détection des amplicons est plus facile à
concevoir que les oligosondes fluorogéniques, plus simple à
synthétiser et à utiliser dans la PCR en temps réel et ne
nécessite pas d'ADN polymérase à activité nucléasique (55).
La sonde lumineuse est un acide nucléique peptidique
auquel est attaché le fluorophore asymétrique cyanine thiazole
orange (56). Lorsqu'elle s'hybride avec une cible d'acide
nucléique, sous forme de duplex ou de triplex, selon la
séquence de l'oligosonde, le fluorophore devient fortement
fluorescent. Ces sondes n'interfèrent pas avec la PCR, ne
nécessitent pas de changement de conformation, sont
sensibles aux mésappariements nucléotidiques uniques
permettant une analyse de fusion de fluorescence, et parce
qu'un seul rapporteur est utilisé, une mesure directe de la
fluorescence peut être faite au lieu de la mesure d'un
changement de fluorescence entre deux fluorophores (56,57).
Cependant, une fluorescence non spécifique a été signalée lors
de cycles ultérieurs utilisant ces sondes (58).
 Nucléase oligosondes
À la fin des années 1980, les tests homogènes étaient rares,
mais les progrès rapides de l'instrumentation des
thermocycleurs et de la chimie de la manipulation des acides
nucléiques ont depuis rendu ces tests courants. Le succès de
ces tests repose sur la modification rapide et mesurable d'un
signal lors de l'hybridation d'une sonde à sa cible (59). En
utilisant un excès, le temps nécessaire à l'hybridation d'une
oligosonde à sa cible, en particulier lorsque la quantité de
cette cible a été augmentée par PCR ou par un autre processus
d'amplification, est considérablement réduit (41,59).
En 1991, Holland et al. (6) ont décrit une technique qui
allait constituer la base de la PCR homogène utilisant des
oligosondes fluorogènes. L'amplicon était détecté en
surveillant l'effet de l'activité endonucléase  de l'ADN
polymérase Taq sur des duplex oligosonde/ADN cible
spécifiques. Les produits radiomarqués ont été examinés par
chromatographie sur couche mince et la présence ou l'absence
d'hydrolyse a été utilisée comme indicateur de la formation de
duplex. Ces oligosondes contenaient une fraction phos- phate
3, qui a bloqué leur extension par l'activité de la
 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6 1297

La fraction du nombre de cycles à laquelle le signal de

polymérase, mais n'a pas eu d'autre effet sur le rendement de fluorescence en temps réel reflète la progression de la réaction
l'amplicon. au-dessus du bruit de fond a été utilisée comme indicateur de
Les critères souhaitables pour un marqueur oligosonde sont la réussite de la réaction.
(i) la fixation facile du marqueur à l'ADN, (ii) la détectabilité l'amplification de la cible (63). Ce cycle seuil ( CT) est défini
à de faibles concentrations, (iii) la détectabilité à l'aide d'une comme le cycle de PCR au cours duquel le gain de
instrumentation simple, fluorescence généré
(iv) production d'un signal altéré lors de l'hybridation spécifique,
(v) sécurité biologique, vi) stabilité à des températures élevées
et
(vii) une absence d'interférence avec l'activité de la
polymérase (6,18).
Une approche innovante a utilisé la PCR de nick-translation
en combinaison avec des oligosondes marquées par un double
fluorophore (14). Dans le premier test véritablement homogène
de ce type, un fluorophore a été ajouté à l'extrémité  et un
autre au milieu d'une sonde oligonucléotidique spécifique à la
séquence. Lorsqu'il se trouve à proximité immédiate, le
fluorophore rapporteur  (6-carboxy-fluoroscéine) transfère
l'énergie d'excitation induite par le laser par FRET au
fluorophore extincteur  (6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine ;
TAMRA), qui réduit la durée de vie de l'état excité du
rapporteur en prenant son énergie excédentaire et en l'émettant
comme un signal fluorescent propre (Fig. 2A et B). Le
TAMRA a émis la nouvelle énergie à une longueur d'onde qui
a été surveillée mais non utilisée dans la présentation des
données. Cependant, lorsque l'oligosonde s'hybride à son
modèle, les fluorophores sont libérés en raison de l'hydrolyse
du composant oligosonde du duplex sonde/cible. Une fois les
marqueurs séparés, les émissions du rapporteur ne sont plus
étouffées et l'instrument surveille la fluorescence qui en
résulte. Ces oligosondes ont été appelées  nucléase,
hydrolyse ou oligosondes TaqMan® (Fig. 3A). Les oligosondes
de nucléase ont des exigences de conception qui s'appliquent
aux autres chimies d'oligosondes linéaires, notamment (i) une
longueur de 20-40 nt, (ii) une teneur en GC de 40-60%, (iii) pas
de parcours d'un seul nucléotide, en particulier G, (iv) pas de
motifs de séquence répétés, (v) une absence d'hybridation ou
de chevauchement avec les oligosondes TaqMan®.
des amorces avant ou arrière et (vi) un TM supérieur d'au
moins 5C à celui des amorces, pour s'assurer que l'oligosonde
s'est bien liée à
le modèle avant que l'extension des amorces puisse se produire
(60).
Cette technologie nécessitait toutefois le développement
d'une plateforme permettant d'exciter et de détecter la
fluorescence ainsi que d'effectuer des cycles thermiques. Un
dispositif à couplage de charge avait été décrit en 1992 pour la
quantification des produits conventionnels de la transcription
inverse (RT)-PCR (61). En 1993, cette approche a été
combinée à un thermocycleur, ce qui a donné naissance à la
première plateforme d'excitation et de détection de
fluorescence pour la PCR en temps réel (29). À ce jour, le
système de détection de séquences ABI Prism® 7700 (Perkin
Elmer Corporation/Applied Biosystems, États-Unis) a été le
principal instrument utilisé pour   oligosondes de
nucléase. Les fluctuations de fluorescence non liées à la PCR
ont été normalisées en utilisant un fluorophore de référence
interne non participant ou "passif" (6-carboxy-
N,N− ; ROX). Les valeurs
corrigées, obtenues à partir d'un rapport entre l'intensité
d'émission du signal rapporteur et celle de ROX, sont
appelées RQ+. Pour mieux contrôler les fluctuations de
l'amplification, la fluorescence d'une réaction de contrôle
"sans matrice" (RQ-) est soustraite de RQ+, ce qui donne la
valeur RQ qui indique l'ampleur du signal généré pour la PCR
donnée (62).
 fonction (47).
par l'amplicon qui s'accumule dépasse 10 écarts types de la
fluorescence moyenne de base, en utilisant des données
prises des cycles 3 à 15 (Fig. 1B) (64). Le CT est
proportionnel à la
le nombre de copies cibles présentes dans l'échantillon (17).
Une amélioration récente de l'oligosonde nucléase a donné
naissance aux oligosondes MGB (minor groove binding)
(Fig. 3A, encadré). Cette chimie remplace le quencher
TAMRA standard par un NFQ et incorpore une molécule qui
stabilise le duplex oligosonde-cible en se repliant dans le
sillon mineur de l'ADNdb (65). Cela permet d'utiliser des
oligosondes très courtes (14 nt), qui sont idéales pour la
détection des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP).
Une utilisation connexe des séquences d'oligonucléotides à
double marquage a consisté à fournir la partie génératrice de
signal du système DzyNA-PCR (66). Dans ce cas, le
rapporteur et le quencher sont séparés après clivage de la
sonde par un ADNzyme, qui est créé pendant la PCR comme
complément d'une séquence d'ADNzyme antisens incluse
dans la queue  de l'une des amorces. Lors du clivage, le
substrat à double marquage libère les fluorophores et génère
un signal de manière analogue à la sonde nucléase 5.

Oligosondes en épingle à cheveux

Les balises moléculaires ont été les premières oligosondes en
épingle à cheveux et sont une variante de l'oligosonde
nucléase à double marquage (figure 3B). Les marqueurs
fluorogènes de l'oligosonde en épingle à cheveux sont
appelés fluorophore et quencher, et ils sont positionnés aux
extrémités de l'oligosonde. Les marqueurs sont maintenus à
proximité immédiate par des régions de tige distale
d'appariement de bases homologues délibérément conçues pour
créer une structure en épingle à cheveux qui entraîne une
extinction soit par FRET, soit par un transfert d'énergie direct
par un mécanisme de collision en raison de la proximité intime
des marqueurs (Fig. 2E et F) (67). En présence d'une
séquence complémentaire, conçue pour se trouver dans les
limites des sites de liaison de l'amorce, l'oligosonde
s'hybride, passant à une configuration ouverte. Le
fluorophore est maintenant soustrait dans l'espace à
l'influence du quencher et les émissions fluorescentes sont
surveillées pendant chaque cycle (68). L'apparition d'un
mésappariement entre une oligosonde en épingle à cheveux
et sa cible a un effet déstabilisant plus important sur le
duplex que l'introduction d'un mésappariement équivalent
entre la cible et une oligosonde linéaire. Cela est dû au fait
que la structure en épingle à cheveux fournit une
conformation alternative très stable. Il a donc été démontré
que les oligosondes en épingle à cheveux sont plus
spécifiques que les oligosondes linéaires plus courantes, ce
qui en fait des candidats idéaux pour la détection des SNP
(67). Le quencher, 4-(−−)-
benzène (DABCYL), diffère de celui décrit pour les
oligosondes nucléasiques car il s'agit d'un NFQ.
La sonde en épingle à cheveux à décalage de longueur
d'onde est une amélioration récente de cette chimie qui fait
appel à un second fluorophore. Le collecteur transmet
l'énergie d'excitation acquise à partir d'une source de lumière
bleue et la libère sous forme d'énergie fluorescente dans les
longueurs d'onde du rouge lointain. L'énergie peut alors être
utilisée par un fluorophore "émetteur" réceptif qui produit de
la lumière à des longueurs d'onde caractéristiques (figure 3B,
encadré). Ceci offre la possibilité d'améliorer la PCR
multiplex en temps réel et l'analyse SNP (Fig. 4), en utilisant
les instruments actuellement disponibles (69). Comme la
fonction de ces oligosondes dépend de l'hybridation correcte
de la tige, une conception précise est cruciale pour leur
1298 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6

coûteuse, la PCR en temps réel est bien plus pratique, fiable et

Amplicon auto-fluorescent mieux adaptée à une prise de décision rapide en situation
clinique (77,78). En effet, la PCR compétitive quantitative
Le concept de l'amplicon auto-amorçant est similaire à celui conventionnelle (qcPCR) nécessite un développement et une
de l'oligosonde en épingle à cheveux, sauf que le marqueur est optimisation importants pour garantir une performance
incorporé de manière irréversible dans le produit de la PCR reproductible et une efficacité optimale.
(Fig. 3D et E). Deux approches ont été décrites : les amorces
sunrise (désormais appelées commercialement amorces en
épingle à cheveux Amplifluor™) et les amorces scorpion
(31,70). L'amorce sunrise se compose d'un fluorophore  et
d'un NFQ DABCYL. Les étiquettes sont séparées par des
tronçons de séquence complémentaires qui créent une tige
lorsque l'amorce sunrise est fermée. À l'extrémité de  se
trouve une séquence d'amorce spécifique à la cible. La
séquence de l'amorce sunrise est destinée à être dupliquée par
le brin complémentaire naissant et, de cette façon, la tige est
déstabilisée, les deux fluorophores sont maintenus en place.
distants de ~20 nt (70 Å) et le fluorophore est libre d'émettre
son énergie d'excitation pour le suivi (70). Ce système
pourrait souffrir d'une fluorescence non spécifique due à la
duplication de la séquence d'amorce de l'aube pendant la
formation de l'amorce-dimère.
L'amorce scorpion est de conception presque identique, à
l'exception d'une molécule adjacente d'hexéthylène glycol qui
bloque la duplication de la partie de signalisation du scorpion.
Outre la différence de structure, la fonction des amorces
scorpion diffère légèrement en ce que la région  de
l'oligonucléotide est conçue pour s'hybrider à une région
complémentaire dans l'amplicon. Cette hybridation force les
étiquettes à s'écarter, perturbant l'épingle à cheveux et
permettant l'émission de la même manière que les sondes en
épingle à cheveux (31).

QUANTIFICATION VIRALE
La majorité des tests PCR de diagnostic rapportés à ce jour
ont été utilisés dans un format qualitatif, ou "oui/non". Le
développement de la PCR en temps réel a fait sortir la
véritable quantification des acides nucléiques cibles du
laboratoire de recherche pure pour la mettre au service du
laboratoire de diagnostic.
La détermination de la quantité de matrice par PCR peut
être effectuée de deux manières : en tant que quantification
relative et en tant que quantification absolue. La quantification
relative décrit les changements dans la quantité d'une
séquence cible par rapport à son niveau dans une matrice
apparentée. La quantification absolue indique le nombre exact
de cibles d'acide nucléique présentes dans l'échantillon par
rapport à une unité spécifique (71). En général, la
quantification relative fournit des informations suffisantes et
est plus simple à mettre au point. Cependant, lors du suivi de
l'évolution d'une infection, la quantification absolue est utile pour
exprimer les résultats dans des unités communes aux
scientifiques et aux cliniciens et sur différentes plateformes.
La quantification absolue peut également s'avérer nécessaire
en l'absence d'échantillons séquentiels permettant de
démontrer les changements dans les niveaux de virus, en
l'absence de réactif de référence standardisé approprié ou
lorsque la charge virale est utilisée pour différencier une
infection active d'une infection persistante.
Une approche très précise de la quantification absolue par
PCR consiste à utiliser la co-amplification compétitive d'un
acide nucléique témoin interne de concentration connue et
d'un acide nucléique cible de type sauvage de concentration
inconnue, le premier étant conçu ou choisi pour s'amplifier
avec une efficacité égale au second (72-76). Cependant, si la
PCR compétitive conventionnelle est relativement peu
 dynamique sont combinées, il est possible de quantifier le
gamme dynamique prédéterminée pour les composants modèle à partir d'échantillons contenant une large gamme de
d'amplification et de détection (79). concentrations, comme c'est souvent le cas dans les
Bien qu'une comparaison des courbes standard absolues, échantillons de patients. Cela permet d'éviter la dilution de
des courbes standard relatives et des valeurs CT produise des l'échantillon.
valeurs finales similaires (80), la croyance générale reste
qu'un contrôle interne en
La combinaison avec des répliques de chaque échantillon est
essentielle pour une quantification fiable par PCR (38,39).
Malheureusement, les logiciels de PCR en temps réel
capables de calculer la concentration d'un inconnu en
comparant les signaux générés par une cible amplifiée et un
contrôle interne ne font que commencer à apparaître. Nous
espérons que ce problème sera abordé dans les prochaines
versions commerciales (81). Par conséquent, la meilleure
approche suivante pour la quantification par PCR est
l'utilisation d'une courbe standard externe. Cette approche
repose sur le titrage d'un modèle amplifié de manière
identique, dans une matrice d'échantillon apparentée, au
cours de la même série d'expériences. Bien que la courbe
standard externe soit l'approche la plus couramment décrite,
elle souffre de variations inter-tubes non contrôlées et non
surveillées. En raison de cette omission, ces expériences
doivent être décrites comme semi-quantitatives. Malgré cette
approche sous-optimale, les données de fluorescence sont
généralement recueillies à partir des cycles de PCR qui
couvrent la partie d'amplification linéaire de la réaction où le
signal fluorescent et l'ADN accumulé sont proportionnels.
Comme les émissions des produits chimiques fluorescents
dépendent de la température, les données ne sont
généralement acquises qu'une seule fois par cycle à la même
températue.
afin de contrôler le rendement en amplicons (45). La CT de
l'échantillon à une valeur de fluorescence spécifique peut
ensuite être comparée à des données similaires recueillies à
partir d'une série de normes par la méthode de la
le calcul d'une courbe standard. La détermination de la CT
dépend de la sensibilité et de la capacité de l'instrument à
distinguer la fluorescence spécifique du bruit de fond, de la
la concentration et la nature du composant générant la
fluorescence et la quantité de matrice initialement présente.
La PCR en temps réel offre des améliorations significatives
à la quantification de la charge virale en raison de son
énorme plage dynamique qui peut accueillir au moins huit
log10 copies de matrice d'acide nucléique (33,52,77,82-89).
Cela est possible parce que les données sont choisies dans la
phase linéaire (LP ; Fig. 1B) de l'amplification où les
conditions sont optimales, plutôt qu'au point final où la
quantité finale d'amplicon présente peut avoir été affectée par
des inhibiteurs, des conditions de réaction mal optimisées ou
une saturation par des sous-produits inhibiteurs de la PCR et
de l'amplicon double brin. Le résultat de la prise de données
à partir du point final est qu'il peut ne pas y avoir de relation
entre la matrice initiale et les concentrations finales
d'amplicon.
La PCR en temps réel est également une alternative
attrayante à la PCR conventionnelle pour l'étude de la charge
virale en raison de sa faible variabilité inter- et intra-essai
(77,87,90) et de sa sensibilité analytique équivalente ou
supérieure à celle de la culture virale traditionnelle ou de la
PCR conventionnelle à un tour et nichée (77,85,91-96). On a
signalé que la PCR en temps réel était au moins aussi
sensible que le transfert de Southern (92). Cependant, ces
rapports pourraient être surestimés en raison du choix de
cibles plus petites, qui s'amplifient plus efficacement, ou en
raison de l'utilisation d'amorces différentes ou améliorées pour
les tests en temps réel, car l'utilisation de logiciels pour
concevoir des amorces et des oligosondes optimisées est plus
courante.
Lorsque cette sensibilité accrue et cette large gamme
 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6 1299

discrimination de plusieurs amplicons. Le transfert de cette

amplicon avant la détection conventionnelle ou la répétition technique s'est avéré problématique en raison du nombre limité
du test en utilisant un échantillon dilué parce que le premier de fluorophores disponibles (14) et de l'utilisation courante
résultat se situe en dehors des limites du test. Ce sont des d'une source lumineuse d'excitation monochromatique. Bien
problèmes rencontrés lors de l'utilisation de certains kits de que l'excitation par une seule
test qcPCR classiques, qui ne peuvent pas prendre en charge
des charges virales élevées tout en conservant une sensibilité
adéquate (52,97-99). La flexibilité de la PCR en temps réel est
également démontrée par sa capacité à détecter une cible en
présence d'un vaste excès d'une autre cible dans les tests
duplexés (84).
La charge virale est également un indicateur utile de
l'étendue de l'infection active, des interactions virus-hôte et de
la réponse au traitement antiviral, autant d'éléments qui
peuvent jouer un rôle dans le choix du régime thérapeutique
(100,101). La PCR quantitative classique a déjà démontré les
avantages de l'application de l'amplification des acides
nucléiques à la surveillance de la charge virale en tant que
marqueur utile de la progression de la maladie et en tant que
composante des études sur l'efficacité des composés
antiviraux (74,100,102-104). Il a été démontré que la gravité
de certaines maladies est en corrélation avec la charge virale, ce
qui rend la quantification par PCR en temps réel utile pour
étudier non seulement la présence d'un virus mais aussi le rôle
de la réactivation ou de la persistance virale dans la
progression de la maladie (78,82,91,105-112).
Un exemple des avantages que la PCR en temps réel a
apporté à la détection quantitative du cytomégalovirus (CMV)
humain est observé chez les patients immunodéprimés après
une transplantation d'organe solide ou de moelle osseuse. Bien
que la détection qualitative de l'ADN du CMV par PCR ait été
utilisée comme indicateur du succès d'une thérapie antivirale,
les tests quantitatifs sont préférables afin de surveiller les
réponses thérapeutiques des patients. De plus, comme il a été
postulé que le suivi de la réplication virale dans le temps est
un indicateur plus fiable du développement d'une maladie
virale que la déterminationdesquantités virales absolues à un moment
donné, plusieurs tests quantitatifs ont été établis et évalués
pour augmenter la précision du diagnostic. Les tests
quantitatifs compétitifs basés sur l'analyse du point final ont
affiché des limites de détection de 5 101 équivalents
génomiques (ge) par test et une gamme dynamique de 5 101-
5 104 ge/essai (113). Les tests basés sur l'hybridation
couvraient approximativement la même gamme dynamique de
quatre ordres de grandeur avec des limites de détection de 20
ge/essai (114,115). Bien que ces tests possèdent des plages
dynamiques qui peuvent être suffisantes pour la plupart des
applications cliniques, ils présentent une variabilité inter- et
intra-essai élevée, pouvant atteindre 40 % (115).
En revanche, l'un des premiers tests PCR en temps réel
publiés pour la détection de l'ADN du CMV a pu être réalisé
en <90 min, a couvert une gamme dynamique de six à sept
ordres de grandeur avec une limite de détection d'au moins 10
ge/essai et une variabilité inter-essai et intra-essai de <10% et
<5%, respectivement, en utilisant des échantillons de plasma
provenant de patients ayant subi une greffe de moelle osseuse
(116).

PCR MULTIPLEX EN TEMPS RÉEL

Le multiplexage (utilisation de plusieurs amorces pour
permettre l'amplification de plusieurs modèles dans une seule
réaction) est une application utile de la PCR classique (117).
Cependant, son transfert à la PCR en temps réel a semé la
confusion dans sa terminologie traditionnelle. Le terme PCR en
temps réel multiplex est plus couramment utilisé pour décrire
l'utilisation de plusieurs oligosondes fluorogènes pour la
 Une autre RT-PCR oligosonde nucléase multiplexée à tube
produit des émissions lumineuses à partir d'un fluorophore unique a permis de détecter simultanément l'influenza A et B
sélectionné de manière appropriée, ce qui limite le nombre de dans les échantillons respiratoires des patients.
fluorophores qui peuvent être inclus (69). Les récentes
améliorations apportées à la conception des amorces en
épingle à cheveux, des oligosondes en épingle à cheveux et
des nucléases, ainsi que les nouvelles combinaisons de
fluorophores, comme dans les systèmes de sondes bi-sondes
et de sondes lumineuses, ont promis la capacité de
discriminer un nombre croissant de cibles.
La découverte et l'application des quenchers non
fluorescents ont libéré certaines longueurs d'onde qui étaient
auparavant occupées par les émissions des premiers quenchers
eux-mêmes. Cette avancée a permis d'inclure un plus grand
nombre d'oligosondes spectralement discernables par réactionet a
mis en évidence la nécessité de disposer d'un seul quenchers
non fluorescent, capable d'éteindre une large gamme de
longueurs d'onde d'émission (par exemple, 400-600 nm). Les
premiers systèmes PCR en temps réel contenaient des filtres
optimisés pour minimiser le chevauchement des spectres
d'émission des fluorophores. Malgré cela, le nombre de
fluorophores qui pouvaient être combinés et clairement
distingués était limité par rapport aux capacités de
discrimination de la PCR multiplex conventionnelle. Des
formes plus récentes de PCR en temps réel ont incorporé soit
plusieurs diodes électroluminescentes pour couvrir
l'ensemble du spectre visible, soit une source lumineuse en
tungstène, qui émet de la lumière sur une large gamme de
longueurs d'onde. Lorsque ces plates-formes intègrent des
filtres optiques de haute qualité, il est possible d'appliquer
tous les produits chimiques de détection PCR en temps réel
actuels sur une seule machine. Néanmoins, ces améliorations
ne permettent généralement que le multiplexage
d'oligosondes à quatre couleurs, dont une couleur est
idéalement réservée à un contrôle interne pour surveiller
l'inhibition et peut-être même agir comme un concurrent co-
amplifié. Certains modèles de PCR en temps réel ont utilisé
des changements nucléotidiques simples ou multiples entre
des modèles similaires pour permettre leur différenciation par
TM (Fig. 4).
en évitant le recours à plusieurs fluorophores (49,91,118-122).
Cette approche a été utilisée beaucoup plus couramment dans
la détection des maladies génétiques humaines où jusqu'à 27
substitutions possibles de nucléotides ont été détectées en
utilisant seulement un ou deux fluorophores (48,123-128).
À ce jour, seule une poignée de tests PCR en temps réel
véritablement multiplexés ont été décrits dans la littérature et
peu d'entre eux ont été appliqués au diagnostic des maladies
infectieuses. Certaines de ces approches ne peuvent pas,
techniquement, être considérées comme des tests homogènes
en temps réel car elles nécessitent une interruption de la
procédure pour transférer la matrice, leur fluorescence est
détectée par une analyse finale ou les tests ne sont pas
effectués dans le même tube. L'un des meilleurs protocoles de
PCR virale multiplex en temps réel peut discriminer quatre
séquences cibles rétrovirales (129), mais la PCR multiplex
classique utilisant la détection du point final peut facilement
discriminer plus de cinq séquences amplifiées différentes, ce
qui indique une plus grande flexibilité par rapport à la PCR
en temps réel (130-133).
Malgré ces limites, un certain nombre de tests ont été
appliqués à la détection de plusieurs génomes viraux à la
fois, notamment l'utilisation d'un marqueur non spécifique, le
vert SYBR 1, pour détecter les virus de l'herpès simplex
(HSV), le virus de la varicelle et du zona (VZV) ou le CMV
dans des tubes séparés (134) ou, par adaptation d'une PCR
multiplex classique, pour identifier les HSV-1 et HSV-2, le
VZV et les entérovirus dans un seul capillaire en appliquant
une analyse de la courbe de fusion par fluorescence (121).
1300 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 6

cervicale (190-192) et les troubles lymphoprolifératifs

avec une meilleure sensibilité par rapport à la culture
conventionnelle ou à la culture en coquille (95).
Les développements futurs de nouveaux produits
chimiques, tels que les marqueurs de transfert d'énergie de
fluorescence combinés (135), et les améliorations apportées à
la conception des instruments et des logiciels en temps réel
amélioreront considérablement l'avenir de la PCR multiplex
en temps réel.
(193,194) peuvent être étudiées relativement facilement pour
rechercher des liens directs ou indirects avec l'infection virale.
Ces études ont ciblé des virus, notamment les flavivirus
(33,36,96,109,195), les hepadnaviridae (52,97), les herpèsvirus
(21,77,78,82-84,91,92,98,105,106,108,

APPLICATIONS À LA VIROLOGIE
La PCR en temps réel s'est avérée extrêmement utile pour
étudier les agents viraux des maladies infectieuses et pour
aider à clarifier les processus de maladies infectieuses
contestés. La plupart des tests présentés dans la littérature
permettent une fréquence accrue de détection des virus par
rapport aux techniques conventionnelles, ce qui rend la mise
en œuvre de la PCR en temps réel attrayante pour de
nombreux domaines de la virologie.
Bien entendu, la PCR en temps réel s'est avérée de plus en
plus précieuse pour les études virologiques générales, bien
que ces applications soient de plus en plus difficiles à examiner
en raison de la nature de leur utilisation en tant qu'outil plutôt
que de l'objet de l'étude publiée. Ces études ont permis
d'étudier le rôle des virus dans une série de maladies en
confirmant simplement la présence ou l'absence du virus
(136,137) ou, à l'avenir, en surveillant les niveaux d'activité
de gènes spécifiques (138) à la suite d'une croissance dans des
conditions manipulées. L'altération de l'entrée ou de la
réplication virale, causée par la modification des tissus cibles,
peut également être suivie à l'aide de la PCR en temps réel,
tout comme les liens entre la réplication virale et l'expression
des gènes cellulaires (139-141).
La PCR en temps réel a amélioré la vitesse et la portée de la
mesure des différences de souches et de titres viraux chez les
patients présentant des syndromes différents dus à des variétés
du même virus (106). De même, les études épidémiologiques
ont gagné en rapidité et en portée grâce à l'utilisation de la
PCR en temps réel, car elle permet de mesurer de manière
fiable la quantité de deux acides nucléiques cibles dans une
seule réaction (91,142). De nouvelles chimies ont permis une
meilleure discrimination de multiples génotypes viraux dans
un seul récipient de réaction (143) et ont fourni une
alternative aux méthodes de détection du virus basées sur des
tests de morbidité et de mortalité.
L'utilisation de la PCR en temps réel a permis de
comprendre le(s) rôle(s) de certains composés dans
l'inhibition de la PCR et de mettre en lumière l'efficacité de
différentes méthodes d'extraction des acides nucléiques, à
partir d'une gamme variée de types d'échantillons (144-146).
Cette capacité à utiliser des matrices provenant de divers
types d'échantillons répond à une exigence d'un système de
détection idéal, à savoir la possibilité d'appliquer une
technologie unique à de nombreux domaines. Cette flexibilité
est mise en évidence par la détection d'acides nucléiques
viraux dérivés, de différentes manières, de plantes (147-149),
d'animaux (86,89,94,150-152), de boues urbaines (85,153), de
cultures de tissus (23,77,96,154-160), divers tissus solides
(108,118,161-166), du liquide céphalorachidien (49,167,168),
des cellules mononucléaires du sang périphérique
(82,93,105,112,169-171), du plasma (81,88,90,172-176), du
sérum (30,33,36,87,97,99,109,177-181),
écouvillons (182, 183), de la salive (106) et de l'urine (78, 122,
184, 185).
De même, des affections chroniques telles que le sarcome (186-
189), le carcinome (92,111), la néoplasie intraépithéliale
 d'une plus grande sophistication, flexibilité et capacité à
111,112,144,167,171), les orthomyxovirus (95), les parvovirus générer des données quantitatives de haute qualité. Le
(88) les papovavirus (122,143,145), les paramyxovirus (94), développement de tests capables
picornavirus (85,86), rétrovirus (90,93,156,196,197) et virus
TT (137). La surveillance de la charge virale par PCR en
temps réel s'est également avérée bénéfique pour l'étude des
patients après une transplantation d'organe (21,83,107,198-
201).
Cette technologie est désormais devenue un outil essentiel
pour l'évaluation approfondie des vecteurs viraux de thérapie
génique avant leur utilisation dans les essais cliniques. Les
oligosondes nucléasiques ont été le plus souvent utilisées
pour ces études, qui évaluent la biodisponibilité, la fonction
et la pureté de ces préparations médicamenteuses
(164,197,202-205).
De plus, l'étude des virus émergents a été compliquée par
l'utilisation de la PCR en temps réel comme outil pour
démontrer les liens entre les séquences virales uniques et les
signes et symptômes cliniques des patients
(94,96,150,160,206,207).
La rapidité et la flexibilité de la PCR en temps réel se sont
également avérées utiles pour les intérêts commerciaux pour
le dépistage de la contamination microbienne des
préparations de réactifs à grande échelle produites à partir de
systèmes d'expression eucaryotes (208,209).

CONCLUSIONS ET RÉSUMÉ
Les progrès réalisés dans le développement des fluorophores,
des chimies de marquage des nucléotides et les nouvelles
applications de l'hybridation des oligosondes ont fourni à la
technologie PCR en temps réel une base suffisamment large
pour assurer son acceptation. Récemment, on a vu apparaître
des instruments capables de réaliser des cycles
incroyablement courts, tout en étant capables de détecter et de
différencier plusieurs amplicons. Les nouveaux instruments
sont également suffisamment flexibles pour permettre
l'utilisation de tous les produits chimiques décrits dans cette
revue, ce qui fait de l'amplification de l'acide nucléique en
temps réel une proposition de plus en plus attrayante et
viable pour les laboratoires de diagnostic de routine. Dans de
nombreux cas, ces laboratoires réalisent des cultures de tissus
pour isoler le virus et des méthodes sérologiques pour
confirmer l'identité de l'isolat, ce qui peut prendre un temps
considérable et cliniquement pertinent.
La familiarité qui conduit à une utilisation confortable et
routinière d'une technologie se manifeste aujourd'hui par
l'inclusion des chimies d'oligosondes fluorogènes dans de
nombreux laboratoires. D'après la littérature, le format le plus
utilisé est l'oligosonde endonucléase 5, mais cela est
probablement dû à sa maturité commerciale. Les oligosondes
chimiques développées plus récemment ont été utilisées dans
un certain nombre d'applications innovantes et il est évident,
au vu du nombre et du contenu des publications relatives à la
PCR en temps réel, qu'elles sont de plus en plus acceptées.
Les développements récents de la PCR multiplex en temps
réel laissent entrevoir un avenir dans lequel l'identification, le
génotypage et la quantification aisés de cibles virales en une
seule réaction rapide seront monnaie courante. Bien entendu,
cette technologie ne se limite pas à la virologie, puisque des
progrès importants ont été réalisés dans le domaine de la
détection des mutations, en appliquant tous les avantages
décrits ci-dessus pour améliorer la détection des maladies
génétiques et, le cas échéant, permettre la quantification de
l'étendue de ces changements génétiques.
La technologie des micro- et macro-réseaux jouera
certainement un rôle chimérique dans la PCR en temps réel
de la recherche future, mais pour l'instant, il existe un
potentiel important pour la routine, la recherche et les intérêts
commerciaux pour remodeler les systèmes existants en vue

La PCR en temps réel, capable de distinguer autant de cibles
que les tests PCR multiplex conventionnels, tout en produisant
des données quantitatives à une vitesse considérablement
accrue, fera de l'amplification fluorée des acides nucléiques
un outil de routine pour le laboratoire de demain.
REMERCIEMENTS
Ce travail a été soutenu par la Fondation de l'Hôpital Royal des
Enfants, subvention numéro 922- 034, sponsorisée par la
campagne Woolworth's 'Care for Kids'. Il s'agit de la publication
numéro 139 du Centre de recherche sur le virus Sir Albert
Sakzewski.
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