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Cellules2014,3, 1102-1115 ; doi:10.3390/cells3041102

ACCÈS LIBRE

cellules
ISSN 2073-4409
www.mdpi.com/journal/cellules
Article

Intensification d'ELISpot : analyse multiniveaux dans les dosages FluoroSpot

Sylvia Janetzki1,*, Markus Rueger2et Tomas Dillenbeck3

1
ZellNet Consulting, Inc., 555 North Avenue, Suite 25-S, Fort Lee, NJ 07024, États-Unis
2
Autoimmun Diagnostika GmbH, Ebinger Strasse 4, D-72479 Strassberg, Allemagne ;
Courriel : rueger@aid-diagnostika.com
3
Mabtech AB, Box 1233, SE-131 28 Nacka Strand, Suède ;
Courriel : Tomas.Dillenbeck@mabtech.com

* Auteur à qui la correspondance doit être adressée ; Courriel : sylvia@zellnet.com ; Tél. :

+1-201-346-0710 ; Télécopie : +1-201-346-0715.

Editeur externe : Alexander E. Kalyuzhny

Reçu : 8 octobre 2014 ; sous forme révisée : 13 novembre 2014 / Accepté : 14 novembre 2014 /
Publié : 27 novembre 2014

Résumé:ELISpot est l'un des tests de surveillance immunitaire les plus couramment utilisés, qui permet
l'évaluation fonctionnelle du système immunitaire au niveau de la cellule unique. Avec sa sensibilité
exceptionnelle et sa facilité d'exécution, le test est récemment passé de la simple analyse cellulaire à
fonction unique à l'analyse multifonctionnelle en mettant en œuvre des réactifs de détection marqués
avec des fluorophores (FluoroSpot), permettant la détection des schémas de sécrétion de deux analytes
ou plus dans un seul puits. Cependant, l'évaluation automatisée de ces tests présente divers défis pour
l'analyse d'images. Ici, nous disséquons les exigences techniques et méthodologiques pour une analyse
fiable des dosages FluoroSpot, introduisons d'importantes mesures de contrôle de la qualité et
fournissons des conseils pour une interprétation correcte des résultats obtenus par les systèmes
d'imagerie automatisés.

Mots clés:FluoroSpot ; ELISpot ; immunosurveillance; l'analyse d'image; les fluorochromes;

fluorophores
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1. Introduction

Après sa première description en 1983 [1], le test ELISpot (solid-phase enzyme-linked

immunospot) est devenu l'un des tests de surveillance immunitaire les plus couramment utilisés en
recherche fondamentale et translationnelle dans de nombreux domaines de l'immunologie [2].
Outre de nombreuses applications de recherche, elle est aujourd'hui également appliquée dans des
essais cliniques pour rechercher des biomarqueurs révélateurs du succès d'interventions
immunothérapeutiques [3], voire comme outil de diagnostic [4]. L'importance du test ELISpot est
encore soulignée par la richesse des projets menés et en cours qui visent la qualité des
performances du test et sa reproductibilité dans tous les laboratoires [5–11]. Les directives
d'harmonisation ELISpot établies ont réduit la variabilité des résultats rapportés [12],
L'utilisation généralisée d'ELISpot au cours des dernières décennies peut principalement être attribuée à sa sensibilité

exceptionnelle, sa facilité de mise en œuvre et sa robustesse. De plus, la technique elle-même ne varie que peu, voire pas du

tout, pour l'analyse d'une grande variété de cytokines, d'anticorps et d'autres protéines sécrétées, par exemple les

chimiokines ou les apolipoprotéines [14,15]. Ce n'était donc qu'une question de temps avant que les capacités d'analyse

polyfonctionnelle d'ELISpot ne soient abordées en examinant la sécrétion simultanée de deux analytes dans un puits. Cela a

été tenté à l'origine avec la mise en place de tests ELISpot enzymatiques bicolores [16]. Les plaques ont été revêtues et

développées avec deux paires d'anticorps ayant des affinités pour différentes cytokines, par exemple, IFNɣ et IL-2 [17]. Les

taches ont été développées en utilisant deux combinaisons différentes d'enzymes et de substrats (par exemple, phosphatase

alcaline à substrat chromogénique tacheté bleu pour le premier analyte et peroxydase de raifort à substrat tacheté rouge

pour le second). De tels tests ont ouvert la possibilité de déterminer le nombre de cellules sécrétant l'un des deux analytes

ou les deux analytes simultanément en utilisant la couleur d'accompagnement pour différencier les trois populations

cellulaires. Les cellules à double sécrétion produiraient des taches de couleur violette tandis que les cellules à sécrétion

simple donneraient des taches bleues ou rouges. Cependant, il est devenu évident très tôt que ces taches sont difficiles à

interpréter [2,16] car leur couleur peut varier dans toutes les nuances de violet, du complètement rouge au complètement

bleu. Plus précisément, le problème réside dans un biais vers une sécrétion unique pour les taches bicolores avec une

différence considérable de taille et/ou d'intensité, où une tache plus faible dans une couleur est facilement masquée par une

tache plus forte dans une deuxième couleur (Figure 1). Cela peut conduire à une sous-estimation du nombre de points

doubles, mais également à une sous-estimation du nombre total de points dans chaque couleur, car des points doubles

faibles peuvent être complètement manqués.

L'introduction du test FluoroSpot [18, 19], avec visualisation des taches par des fluorophores au lieu de combinaisons
d'enzymes et de substrats, a conduit à une amélioration de la détection des taches à double coloration [19]. Mais encore, à
cette époque, l'analyse de dosage par des systèmes automatisés de comptage de points était basée sur la couleur des
points. Ce n'est qu'avec l'introduction d'une nouvelle technologie d'analyse d'image à deux niveaux qu'une différenciation
sans ambiguïté entre les taches colorées simples et doubles (ou même triples) est devenue possible. Nous fournissons ici
une description détaillée de la technologie d'analyse améliorée pour une évaluation précise de FluoroSpot, des exigences
techniques liées aux fluorophores et au système d'imagerie automatisé, des contrôles importants pour juger un système
d'imagerie adapté à l'évaluation de FluoroSpot, et une évaluation des résultats obtenus avec l'évaluation automatisée de
FluoroSpot dosages.
Cellules2014,3 1104

Figure 1.Biais de couleur dans le test ELISpot colorimétrique bicolore. L'évaluation des tests ELISpot

enzymatiques bicolores est uniquement basée sur la couleur des points, les points de cytokine unique étant

rouges ou bleus et les points de cytokine double théoriquement violets. Les points doubles à haute intensité

dans une seule couleur risquent d'être interprétés à tort comme des points uniques, car le point le plus fort

obscurcit le plus faible. Cela entraînera une sous-estimation du nombre de cellules à double sécrétion ainsi

qu'une sous-estimation du nombre total de taches pour la couleur la plus faible.

Dosage ELISpot colorimétrique bicolore : Une image = une analyse de niveau

2. Section expérimentale

Cette section est rédigée conformément aux directives MIATA pour un reporting transparent [20]. L'échantillon:Des

cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été préparées par centrifugation de densité Ficoll de couches

leucocytaires obtenues à partir de sang héparinisé de deux donneurs de sang sains anonymes à l'hôpital Karolinska, Solna,

Suède. Le délai entre le prélèvement sanguin et l'isolement des PBMC était en moyenne de 20 h. Les PBMC ont été congelés

à -80 °C dans 20 % de sérum de veau fœtal (FCS)/10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à l'aide d'un appareil Mr. Frosty, puis

transférés et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation ultérieure (dans un délai < 1 an). Les PBMC ont été

décongelés et lavés deux fois avant de les laisser reposer pendant deux heures à 37 °C et 5 % de CO2. La concentration et la

viabilité des cellules ont été déterminées par le test Guava ViaCount (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). La viabilité

était > 90 %.
Le dosage: RPMI 1640, HEPES, pénicilline/streptomycine et FCS à faible endotoxine ont été achetés
chez Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Le lot de sérum a été prétesté pour vérifier les
effets indésirables. Plaques FluoroSpot IFNɣ/IL-2 humaines pré-enduites (anticorps monoclonaux (mAbs)
1-D1K et MT2A91/2C95), plaques FluoroSpot IFNɣ/IL-22/IL-17A humain pré-enduites (mAbs 1-D1K,
MT12A3 et MT44.6), réactifs de détection : 7-B6-1-FS-FITC, 7-B6-1-biotine, 7-B6-1-BAM, MT8G10-biotine,
MT7B27-biotine, MT504-BAM, anti-FITC- 490, streptavidine-550 (SA-550), anti-BAM-640 et amplificateur de
fluorescence, ainsi que des stimuli : pool de peptides CEF, mAb anti-CD3 et mAb anti-CD28, ont tous été
obtenus auprès de Mabtech, Nacka Strand, Suède (kit Mabtech pour IFNɣ/IL-2 : cat# FSP-0102, et pour
IFNɣ/IL-22/IL-17A : cat# FSP-011803). Les plaques FluoroSpot, qui contiennent une membrane PVDF
faiblement autofluorescente, Candida albicansl'extrait a été obtenu auprès de Greer, Lenoir, NC, USA. Les
plaques IFNɣ/IL-2 FluoroSpot humaines pré-enduites ont été lavées cinq fois avec 200 µL/puits de solution
saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) et bloquées pendant 1 h avec 200 µL/puits de milieu de
culture cellulaire (RPMI 1640 additionné de 10 % de chaleur -FCS inactivé, glutamine 1 mM, pénicilline 100
unités/mL, streptomycine 100 µg/mL et HEPES 0,5 mM). Le milieu de blocage a été retiré et 100 µL/puits
de nouveau milieu avec 0,1 µg/mL
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mAb anti-CD28 (pour contrecarrer l'effet d'absorption de l'IL-2 qui entraîne une diminution de la
costimulation et potentiellement une baisse du nombre de spots IFNɣ), avec ou sans stimuli (2 µg/mL CEF)
ajoutés à chaque puits. Des PBMC reposés ont été ajoutés à 250 000 cellules dans 100 µL à chaque puits,
avec chaque échantillon et condition analysés en triple. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 20
h à 37 °C et 5 % de CO2. Le lendemain, les cellules ont été retirées par lavage cinq fois avec du PBS (200
µL/puits) dans un laveur ELISA automatisé (Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). Pour la détection
de puits colorés uniques, les anticorps conjugués au FITC, à la biotine ou au peptide BAM ont été dilués
individuellement dans du PBS avec 0,1 % de BSA (PBS/BSA) à 1 µg/mL, et 100 µL ont été ajoutés à chaque
puits pendant deux heures d'incubation à la pièce température (TA). Les plaques ont ensuite été lavées
cinq fois comme décrit ci-dessus avant l'ajout de l'un des réactifs secondaires : anti-FITC-490, SA-550 ou
anti-BAM-640 (chacun dilué au 1/200 dans du PBS/BSA), suivi d'un incubation d'une heure à température
ambiante. Les plaques ont de nouveau été lavées comme décrit ci-dessus, et 50 µL/puits d'amplificateur
de fluorescence ont été ajoutés pour une incubation de 15 min.
Pour IFNɣ/IL-2 double FluoroSpot, les mAb de détection anti-IFNɣ (7-B6-1-FS-FITC, dilué 1:200) et anti-IL-2 (MT8G10-

biotine, dilué à 1 µg/ML) étaient ensemble ajouté à chaque puits dans 100 µL de PBS/BSA pour une incubation de deux

heures à température ambiante. Après lavage, anti-FITC-490 et SA-550 (tous deux dilués à 1:200) ont été ajoutés à tous les

puits et incubés pendant une heure à température ambiante.

Pour IFNɣ/IL-22/IL-17A triple FluoroSpot, 300 000 PBMC ont été ensemencés par puits et incubés pendant deux
nuits avec ou sansCandida albicansextrait (20 µg/mL), compte tenu de la cinétique de sécrétion plus lente notamment
pour l'IL-17A avec l'agent stimulant donné. Le troisième jour, les cellules ont été lavées comme décrit ci-dessus, et
anti-IFNɣ (7-B6-1-FS-FITC, dilué 1:200), anti-IL-22 (MT7B27-biotine, dilué à 0,5 µg/mL) , et des mAb de détection anti-
IL-17A (MT504-BAM, dilué 1:200) ont été mélangés et 100 µL ont été ajoutés à chaque puits pendant deux heures
d'incubation à température ambiante. Les plaques ont été lavées et les réactifs secondaires : anti-FITC-490, SA-550 et
anti-BAM-640 ont tous été dilués au 1/200 et ajoutés à tous les puits pour une incubation d'une heure à température
ambiante.
L'acquisition des données: L'analyse et le comptage des spots ont été effectués avec un système de
lecteur FluoroSpot (iSpot Spectrum, AID, Strassberg, Allemagne) avec la version logicielle 7.0, build 14790,
où les spots fluorescents ont été comptés en utilisant des filtres séparés pour FITC, Cy3 et Cy5. Les
paramètres de l'appareil photo (exposition et gain) ont été adaptés pour chaque filtre afin d'obtenir des
images ponctuelles de haute qualité évitant la surexposition ou la sous-exposition. Les paramètres de
spot spécifiques au fluorophore ont été définis en utilisant la taille du spot, l'intensité du spot et le
gradient du spot (décoloration de l'intensité de la coloration du centre à la périphérie du spot); et un
algorithme de séparation des points a été appliqué pour une détection optimale des points. Les
paramètres ont été affinés en comparant les puits témoins négatifs (PBMC seuls) et les puits contenant
des PBMC stimulés par CEF. Des images supplémentaires ont été prises par un lecteur Zeiss ELISpot (Carl
Zeiss, Inc., Thornwood, NY,
Détermination des données et de la réponse :Les données brutes peuvent être mises à disposition sur demande. Aucune analyse

statistique ou détermination de la réponse n'a été effectuée pour cette étude.

Opérations de laboratoire: Les expériences ont été réalisées conformément aux procédures opératoires normalisées
(SOP) établies et avec des réactifs validés dans un laboratoire d'investigation qui fonctionne conformément à la norme ISO
9001/ISO 13485. Le laboratoire participe aux panels de compétence ELISpot menés par le
Cellules2014,3 1106

Cancer Immunotherapy Consortium (CIC), l'Association for Cancer Immunotherapy (CIMT) et

Immudex.

3. Résultats et discussion

3.1. L'analyse multidimensionnelle FluoroSpot

L'introduction d'une nouvelle approche pour l'analyse FluoroSpot a été motivée par la nécessité de surmonter les limites

de l'analyse ponctuelle par couleur (tableau 1).

Tableau 1.Résumé des avantages et des inconvénients de l'évaluation automatisée des différents formats de test

ELISpot.

ELISpot Double ELISpot FluoroSpot

Qualités de dosage

Stabilité du signal + + +
Sensibilité du dosage + + +
Haut débit + (+) +
Quantité de données générées par échantillon + ++ +++
Robustesse + − +
Niveau d'analyse
Analytes simultanés − + ++
Analyse de sous-population − (+) +
Compatibilité du lecteur
Lecteur ELISpot standard Lecteur + + −
FluoroSpot standard (jeux de filtres, + + +
source de lumière forte et
analyse d'images multi-niveaux)

− pas possible ou applicable ; (+) limité ; + bon ou applicable ; ++ très bien; +++ exceptionnel.

L'analyse par couleur peut conduire soit à des taches monochromes faussement définies (la tache la plus faible ne se distingue tout

simplement pas en raison de la superposition par la tache la plus forte), soit à des taches bicolores faussement définies lorsque la tache la

plus grande recouvre partiellement une tache plus petite située dans son périphérie, mais qui est produit par une cellule différente (Figure 2).

En outre, des taches de très haute intensité (par exemple, pour Cy3, généralement orange foncé à rouge avec la plupart des filtres à large

bande) peuvent apparaître avec un centre jaune, impliquant à tort une tache bicolore (Figure 2). Enfin, étant donné que les paramètres de la

caméra ne peuvent pas être définis individuellement pour deux fluorophores lors de l'utilisation d'un filtre à double bande, des taches d'une

couleur (par exemple, des taches vertes pour FITC) peuvent apparaître comme des signaux faibles tandis que des taches d'une autre couleur

(par exemple, des taches orange-rouge pour Cy3 ) peut être surexposé (Figure 2).
Cellules2014,3 1107

Figure 2.Défis de l'analyse des filtres à large bande des plaques FluoroSpot. Les PBMC ont été stimulées avec

le pool de peptides CEF (UN) ou anti-CD3 (B) et testés simultanément pour la sécrétion d'IFNɣ et d'IL-2 à l'aide
de fluorophores FITC (pour IFNɣ) et Cy3 (pour IL-2). Les images ont été prises avec un lecteur Zeiss utilisant un

filtre à double bande pour FITC et Rhodamine. Les signaux FITC sont faibles et petits, tandis que les signaux
Cy3 sont forts et plus grands, recouvrant des points FITC plus petits (B), conduisant à de faux comptages bas

pour les taches vertes. Dans le panneau (UN), la flèche bleue pointe vers une tache jaune susceptible d'être

causée par la double sécrétion de cytokine par une cellule (voir l'encart pour le gros plan). Des signaux jaunes

similaires peuvent également être trouvés au centre de points rouges plus grands et de haute intensité
(flèches vertes), conduisant à des comptages de points doubles faussement élevés (voir l'encart pour un gros

plan). Les défis d'une telle analyse FluoroSpot à un niveau sont illustrés à droite.

Figure 3.Analyse FluoroSpot à deux niveaux. Les PBMC ont été stimulés avec le pool de peptides CEF et testés

simultanément pour la sécrétion d'IFNɣ et d'IL-2 à l'aide de fluorophores FITC (pour IFNɣ) et Cy3 (pour IL-2).

Les images ont été prises avec un analyseur d'imagerie AID utilisant des filtres à bande étroite pour chaque

fluorophore. Panneau (UN) montre les deux images distinctes prises du même puits (analyse de niveau un).

Les taches sont analysées, par exemple, pour la taille de la tache, l'intensité de la tache et l'emplacement. Les

images sont ensuite superposées et un algorithme de localisation est appliqué qui permet l'identification des

spots résultant de cellules productrices de cytokines simples et doubles en fonction des paramètres de

localisation exacts de chaque centre de spot (analyse de niveau deux, panel (B)).

L'innovation clé introduite pour l'évaluation des plaques FluoroSpot est une analyse à deux niveaux de chaque puits

(Figure 3). Au premier niveau, des images séparées de chaque analyte/fluorophore sont acquises et analysées. Dans le cas

d'un FluoroSpot bicolore, deux images distinctes sont prises ; en cas de FluoroSpot triple couleur, trois
Cellules2014,3 1108

des images séparées sont prisesetc.Il est important de noter que les paramètres de la caméra (par exemple, l'exposition, le gain) peuvent être ajustés

pour chaque analyte/fluorophore afin de compenser les différentes intensités fluorescentes.

Deux conditions préalables sont essentielles pour une évaluation réussie de FluoroSpot :

1. Filtres à bande étroite avec une plage de longueurs d'onde d'excitation et d'émission spécifique pour chaque fluorophore

afin d'éviter le débordement entre différents fluorophores (Figure 4) ;

2. Caractéristiques du logiciel pour l'identification de la position exacte de chaque point dans un système de
coordonnées bidimensionnel.

Figure 4. Plages d'excitation et d'émission pour les filtres à bande étroite sélectionnés.Une sélection de

filtres à bande étroite tels qu'utilisés dans l'analyseur d'imagerie AID pour l'évaluation des dosages FluoroSpot

est représentée. Il convient de noter que ces filtres assurent une filtration à deux niveaux : 1. Filtrage de la

lumière d'excitation entrante pour empêcher l'excitation des fluorophores avec chevauchement spectral

partiel, et 2. Filtrage des signaux émis pour obtenir des images ponctuelles définies.

Filtres AID FluoroSpot

Cy5
Filtre d'excitation
Cy3
Filtre d'émission

FITC

450 nm 500 nm 550 nm 600 nm 650 nm 700 nm 750 nm

Longueur d'onde

Au niveau un, l'analyse de chaque image obtenue par puits est effectuée séparément avec des paramètres spécifiques à

l'analyte/fluorophore tels que définis par l'utilisateur suivant des étapes spécifiques au laboratoire ou définies par SOP (voir

également la section Matériels et méthodes, Acquisition de données).

Au cours du deuxième niveau d'analyse, les positions des spots comptés dans les images séparées sont comparées par un

algorithme de localisation. Si des spots dans différentes images (pour différents fluorophores) du même puits ont des positions

identiques telles que définies par l'emplacement du centre du spot, ils sont détectés comme des spots multi-colorés, sinon ils sont

comptés comme des spots colorés uniques de l'analyte/fluorophore respectif ( Figure 3). Pour cette approche, il est important que le

système de lecteur automatisé i. se verrouille dans la plaque à une position de puits spécifiquement désignée, et ii. permet un

changement automatisé de filtres tel que défini par les fluorophores utilisés dans le dosage. Le logiciel d'imagerie appliqué doit en

outre permettre la définition de l'espace maximal acceptable entre les centres des taches détectées pour différents fluorophores

pour l'identification des taches multicolores. En d'autres termes, les différentes cinétiques de sécrétion de cytokines (liées au début,

à la vitesse, à la durée, à la force) ainsi que le mouvement des cellules pendant l'incubation peuvent entraîner un déplacement

minimal des centres de taches pour un analyte donné (généralement dans la gamme des µm) qui doit être pris en considération

pour les cellules sécrétant plus d'un analyte lors de la stimulation. Des causes techniques doivent également être prises en compte,

qui peuvent, par exemple, être liées à l'alignement de l'image. Rebhahn être lié à l'alignement de l'image. Rebhahn être lié à

l'alignement de l'image. Rebhahnet coll.ont abordé ce sujet en détail précédemment [21]. Les auteurs montrent que, probablement

pour les raisons évoquées ci-dessus, une tache n'est pas parfaitement ronde. Différentes valeurs de circularité pour les spots

superposés, telles que déterminées par les mesures de la variabilité radiale (distance des pixels avec la plus haute intensité [à savoir

la masse centrale du spot] à tous les pixels

Cellules2014,3 1109

répartis dans sa périphérie), conduisent par conséquent à de légers déplacements des centres des taches. Ils abordent en outre la

superposition aléatoire de spots en déterminant une limite de coïncidence à l'aide de superpositions d'images appariées et non

appariées. Dans nos expériences, il a été déterminé empiriquement que pour les spots de taille moyenne, comme le montrent les

figures 3, 5 à 7, un décalage de pixel avec le lecteur AID Spectrum de l'application. cinq pixels (environ 15 µm) fonctionnent bien

pour capturer les vrais sécréteurs doubles tout en maintenant le taux de superposition aléatoire au minimum.

3.2. Fluorophores et test des systèmes d'imagerie pour le débordement du signal

Actuellement, il n'y a qu'un nombre limité de fluorophores utilisés dans FluoroSpot, et leur sélection est principalement

motivée par l'objectif d'obtenir une force et une stabilité de signal efficaces tout en étant capable d'empêcher les signaux de

débordement, voir également [22]. Les fluorophores les plus couramment utilisés sont FITC, Cy3 et Cy5. Un chevauchement

significatif des spectres d'excitation et d'émission existe pour ces trois fluorophores. Cependant, l'utilisation de filtres à

bande étroite pour l'excitation ainsi que l'émission peut empêcher efficacement le débordement (Figure 4).

Figure 5.Test des systèmes d'imagerie FluoroSpot pour le débordement du signal. Les PBMC ont été stimulés

avec CEF et testés pour la sécrétion d'IFNɣ à l'aide de différents systèmes de détection marqués au

fluorophore. Les images de niveau 1 pour chaque système de détection et filtre sont affichées (rangée

supérieure : spots FITC avec tous les filtres ; rangée du milieu : spots Cy3 avec tous les filtres ; rangée

inférieure : spots Cy5 avec tous les filtres). Seuls les spots de filtre appropriés sont détectés. Il n'y a pas de

signaux apparents pour le même puits lorsque d'autres filtres sont utilisés.

Filtre FITC Filtre Cy3 Filtre Cy5

(~490/520 nm) (~550/570 nm) (~640/660 nm)

Fluorophore : FITC
Analyte : IFNγ
Réactifs de détection :
7‐B6‐1‐FS‐FITC / anti‐FITC‐490

Fluorophore : Cy3
Analyte : IFNγ
Réactifs de détection :
7‐B6‐1‐biotine / SA‐550

Fluorophore : Cy5
Analyte : IFNγ
Réactifs de détection :
7‐B6‐1‐BAM / anti‐BAM‐640

Il est conseillé de tester si le système d'imagerie automatisé choisi pour l'analyse FluoroSpot empêche
effectivement le débordement du signal et offre ainsi des capacités d'analyse de plaque précises. Ceci est réalisé
efficacement, par exemple, en utilisant un seul fluorophore par puits pour la détection de la sécrétion de cytokines,
Cellules2014,3 1110

mais en évaluant chaque puits avec tous les filtres. Aucun signal ne doit être détecté lors de l'utilisation d'un filtre
autre que celui désigné pour le fluorophore utilisé (Figure 5).

3.3. La véritable signification de la couleur dans l'analyse FluoroSpot

Il est important de réaliser que - contrairement aux dosages ELISpot colorimétriques et à l'analyse FluoroSpot par couleur (voir

Figures 1 et 2) - la couleur du spot dans l'image capturée n'a aucune importance pour l'analyse FluoroSpot. Les signaux fluorescents

sont séparés par des filtres (comme indiqué ci-dessus) et la couleur de l'image n'affectera que la visualisation graphique des

données. L'analyse des dosages FluoroSpot telle que décrite pour cette technologie à deux niveaux utilise les valeurs de gris des

taches pour leur identification et est basée sur des paramètres de taches tels que la taille, l'intensité et la position des taches dans le

premier niveau d'analyse. Dans le traitement de l'imagerie, il s'agit d'une approche courante pour calculer les intensités des objets

sur une image en la convertissant en niveaux de gris. La traduction d'une image en niveaux de gris 8 bits en une image binaire

donne 256 possibilités (de 0 à 255, 0 étant le noir et 255 le blanc). La couleur de l'image dans les tests FluoroSpot a un aspect de

visualisation pure et les couleurs peuvent être remplacées par l'utilisateur du logiciel en fonction de ses préférences personnelles

pour fournir une présentation plus claire et plus intuitive des différents types de spots ou populations de cellules (voir les figures 6

et 7). La prudence est recommandée pour les rapports existants sur plus de trois ou quatre capacités de couleur Fluorospot, qui

peuvent simplement se référer aux différentes sous-populations détectables, qui sont marquées avec des couleurs différentes par

l'opérateur à l'aide des fonctionnalités logicielles appropriées (voir également la figure 7E).

Figure 6.Influence de la couleur des points sur le nombre de points. Les images superposées d'un puits de PBMC

stimulées avec le pool de peptides CEF colorés pour la sécrétion d'IFNɣ (FITC) et d'IL-2 (Cy3) sont présentées avec des

couleurs apparaissant naturellement (image de gauche), une substitution de couleur pour les taches Cy3 (image

centrale) et la substitution des deux FITC et Cy3 avec valeurs de gris (image de droite). Le nombre de points pour

chaque cytokine dans chacun des trois schémas de couleurs est présenté dans le graphique, indiquant

qu'indépendamment des ajustements de couleur aux points, les résultats d'évaluation globaux sont les mêmes pour

chaque cytokine et pour la double sécrétion.

Cellules2014,3 1111

Figure 7.Dosage FluoroSpot triple cytokine. Les PBMC ont été stimulées avecCandida albicans extrait et testé
pour la sécrétion d'IFNɣ (FITC), d'IL-22 (Cy3) et d'IL-17A (Cy5). Les images de niveau un pour les fluorophores
séparés sont représentées dans le panneau (UN)–(C). La superposition d'image de niveau deux et la
superposition de couleur à des fins de visualisation sont affichées dans le panneau (ré) et (E), respectivement.
Les dénombrements ponctuels globaux pour les sept sous-populations sont présentés.

3.4. Discussion

L'introduction de systèmes de détection utilisant des fluorophores pour la technique ELISpot a ouvert la porte à l'analyse réussie de plusieurs analytes sécrétés dans un

même puits. Pour l'acquisition de données, les systèmes d'imagerie existants doivent être équipés d'une source de lumière puissante et de filtres spéciaux. Il est devenu évident

assez rapidement que l'évaluation des plaques FluoroSpot basée sur la différenciation des couleurs des spots présentait des défis insurmontables. La solution a été trouvée

dans une approche d'analyse à deux niveaux au cours de laquelle une image distincte est prise pour chaque fluorophore, l'image est évaluée pour les points spécifiques au

fluorophore et l'emplacement du point est enregistré. Les images séparées pour le même puits sont ensuite vérifiées pour les taches avec les mêmes coordonnées pour définir

les sécréteurs simples et doubles (ou plus). Cette approche a déjà été appliquée avec succès dans divers domaines, comme la recherche sur la tuberculose [23], la recherche sur

le VIH [24], la recherche liée à d'autres maladies infectieuses [25], ainsi que la vaccination et la recherche translationnelle [26–28]. L'un des éléments clés de cette approche

d'évaluation est l'utilisation de filtres à bande étroite pour l'excitation et l'émission. Les fluorophores couramment utilisés FITC, Cy3 et Cy5 présentent un chevauchement

spectral important, mais en utilisant des filtres spécifiques, le débordement entre les signaux peut être réduit à des niveaux sans conséquence. De tels filtres sont largement

disponibles de nos jours, et divers imageurs FluoroSpot peuvent être facilement étendus pour Les fluorophores couramment utilisés FITC, Cy3 et Cy5 présentent un

chevauchement spectral important, mais en utilisant des filtres spécifiques, le débordement entre les signaux peut être réduit à des niveaux sans conséquence. De tels filtres

sont largement disponibles de nos jours, et divers imageurs FluoroSpot peuvent être facilement étendus pour Les fluorophores couramment utilisés FITC, Cy3 et Cy5 présentent

un chevauchement spectral important, mais en utilisant des filtres spécifiques, le débordement entre les signaux peut être réduit à des niveaux sans conséquence. De tels filtres

sont largement disponibles de nos jours, et divers imageurs FluoroSpot peuvent être facilement étendus pour
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l'utilisation simultanée de plusieurs filtres. Par conséquent, le matériel requis pour l'analyse complexe FluoroSpot ne
limite pas la technique FluoroSpot à la détection de seulement deux analytes.
De plus, la grande capacité de liaison des anticorps des plaques FluoroSpot (environ 100 µg/puits) permet généralement
d'augmenter le nombre de cytokines testées par puits, compte tenu de l'utilisation moyenne de seulement 1 à 2 µg par puits
d'anticorps de revêtement pour un analyte spécifique . Un examen des caractéristiques chimiques des membranes PVDF
appliquées pour les dosages ELISpot et FluoroSpot a été donné ailleurs [29], et démontre le mécanisme de liaison efficace
des protéines par la membrane PVDF si elle est prétraitée avec de l'éthanol, et leur stabilisation pendant des périodes
prolongées lorsque le revêtement La procédure est suivie par l'ajout de protéines (comme cela se fait par "blocage" tel
qu'inclus dans la plupart des protocoles Elispot, ou l'ajout de solutions de stabilisateur, comme cela est fait pour les plaques
pré-enduites disponibles dans le commerce). Une situation hypothétique dans laquelle une région de la membrane lie
efficacement un mAb de capture mais pas les deux autres mAb de capture, entraînant des taches colorées simples plutôt
que des taches colorées doubles ou triples, est hautement improbable. Si la membrane présentait une variation aussi
drastique de la liaison protéique à travers un puits, les résultats dans, par exemple, des triplicats afficheraient une variation
élevée inhabituelle. Ailleurs dans ce numéro, Dillenbecket coll.décrivent une comparaison entre les résultats obtenus à partir
de FluoroSpot simple et triple pour IFN-ɣ, IL-17A et IL-22. Les deux méthodes ont donné une forte corrélation avec des
nombres de points similaires ainsi que des intensités et une qualité de points similaires. Cela soutient également l'excellente
capacité de liaison des membranes PVDF pour les mAbs de capture multiples.

Actuellement, il existe des kits commerciaux disponibles qui testent simultanément le schéma
de sécrétion de trois cytokines dans un puits. Cette approche triple cytokine FluoroSpot est
examinée ailleurs dans ce numéro (Dillenbecket coll.). Lorsque l'on examine plusieurs schémas
de sécrétion dans FluoroSpot avec plus de deux cytokines, il devient évident que l'évaluation des
plaques avec une approche à deux niveaux est essentielle pour une analyse précise. L'analyse
des modèles de sécrétion pour trois cytokines dans un puits révélera sept sous-populations de
cellules (trois sécréteurs simples, trois combinaisons de sécréteurs doubles et un sécréteur
triple) (Figure 7), qui seront impossibles à séparer par couleur d'accompagnement. De plus, pour
chaque fluorophore supplémentaire introduit, le nombre de sous-populations potentielles
doublera environ, ce qui, dans le cas d'un quatrième analyte, nécessitera que le logiciel identifie
15 sous-populations individuelles (quatre sécréteurs simples, six combinaisons de sécréteurs
doubles, quatre combinaisons de sécréteurs triples, et un quadruple sécréteur).

La principale limitation actuelle pour les tests FluoroSpot plus complexes est la disponibilité de réactifs de
détection de haute qualité, avec une sensibilité et une photostabilité élevées. Les mêmes principes utilisés pour
l'analyse des dosages FluoroSpot à deux et trois couleurs peuvent être adaptés pour gérer des analytes
supplémentaires dans des dosages avec plus de couleurs. Considérant qu'un test FluoroSpot évaluant simultanément
deux ou trois analytes est principalement aussi facile et simple à réaliser qu'un test ELISpot enzymatique monocolore
et présente une sensibilité comparable, ce ne peut être qu'une question de temps avant que l'analyse complexe
FluoroSpot n'entre sur le marché à grande échelle. échelle [30]. Les principes d'acquisition et d'analyse des données
ont déjà été développés, comme décrit ici, et sont en place pour une expansion future de la technologie FluoroSpot.
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Les contributions de l'auteur

Recherche conçue par SJ, MR, TD ; SJ et TD ont effectué des recherches et analysé les données ; SJ, MR, TD ont
rédigé l'article. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Les conflits d'intérêts

SJ est le président de ZellNet Consulting, une société de conseil ELISpot. MR est employé par Autoimmun
Diagnostika GmbH, une société fournissant des imageurs automatisés pour l'analyse ELISpot et FluoroSpot. TD
est employé par Mabtech, une société fournissant les kits ELISpot et FluoroSpot.

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