Ministère de la santé et de la protection sociale

Institut Supérieure des Professions Infirmiers et

Techniques de Santé de Casablanca

Techniques D’analyse Au Laboratoire

De Biologie Médicale

Dr Samiha JADDAOUI

2023-2024
⚫ Lestests sérologiques visent à déterminer la présence
actuelle ou ancienne d’une infection par un
microorganisme. Pour y parvenir, on mesure le taux
de protéines présent dans la partie liquide du sang.
Ces protéines sont généralement des anticorps.
 Technique ELISA :

• La technique ELISA «Enzyme Linked Immunosorbent

Assay» est utilisée afin d’évaluer et /ou quantifier la
présence de protéines, d’anticorps ou d’antigènes, dans
un échantillon donné.
• Elle est, à titre d’exemple, utilisée pour le dépistage du
HIV, et permet de ce fait de déterminer la
concentration sérique d’anticorps dirigés contre le
virus.
• Il existe plusieurs variétés de tests ELISA selon
l’objectif recherché.
 POURQUOI L’ELISA ?
EXEMPLE D’APPLICATION : HIV Screening TEST

• Plus de 40 kits d’ELISA sont disponibles, mais

seulement environ 10 sont homologués par la « FDA ou
food and drug administration » pour une utilisation aux
États-Unis.
• Une caractéristique commune de toutes les variétés
d'ELISA est l'utilisation de conjugués enzymatiques qui
se lient à un anticorps spécifique du VIH.
• Il s’agit, en général, d’un test ELISA indirect dans lequel
l'antigène du VIH est fixée à un puits d'une plaque de
96 puits.
 POURQUOI L’ELISA ?
EXEMPLE D’APPLICATION : HIV Screening TEST

• D’autres méthodes ELISA se base sur une compétition. Dans

ce cas, l’anticorps spécifique du VIH entre en compétition avec
un deuxième anticorps lié à l'enzyme pour les sites d'antigène
sur la phase solid

• Dans ce procédé, le développement de couleur est

inversement proportionnelle à la concentration d'anticorps
spécifiques du VIH.
 POURQUOI L’ELISA ?
EXEMPLE D’APPLICATION : HIV Screening TEST
 POURQUOI L’ELISA ?
EXEMPLE D’APPLICATION : HIV Screening TEST

• Récemment, une nouvelle méthode a été introduite, la

méthode sandwich antigène dans laquelle l’enzyme
(phosphatase alcaline ou la peroxydase) est conjugué à un
antigène du VIH (similaire à l'antigène immobilisé sur la phase
solide). L'anticorps dans l'échantillon est "pris en sandwich"
entre les 2 molécules d'antigène, un immobilisé sur la phase
solide et un contenant l'enzyme.
 POURQUOI L’ELISA ?
EXEMPLE D’APPLICATION : HIV Screening TEST

• L'addition du substrat résulte en une coloration

proportionnelle à la concentration d'anticorps.
• Cette méthode est considérée comme la méthode de
criblage la plus sensible, compte tenu de sa capacité à
détecter toutes les isotypes d'anticorps (y compris des
IgM).
• Un inconvénient de ce procédé est la nécessité
d’utiliser un volume relativement grand (150 uL) de
l'échantillon, ce qui peut rendre la répétition des essais
délicate.
 Principe de la technique ELISA :

• Le principe de l’ELISA dit indirect consiste à détecter la

présence d’un anticorps spécifique dans un échantillon
donné.
• Dans ce cas, le manipulateur aura besoin : - D’un antigène
connu spécifique de l’anticorps recherché. - D’un
échantillon à doser.
• - D’un anticorps secondaire anti-IgG couplé à une enzyme
comme la peroxydase (cet anticorps va reconnaitre
spécifiquement les anticorps IgG) - Le substrat spécifique à
l’enzyme choisi en l’occurrence, TMB (tétra-méthyl
benzidine).
Principales étapes de la technique
ELISA indirect :
 La technique se déroule en quatre
étapes principales :
• 1) Fixation de l’antigène : L’antigène connu, spécifique à
l’anticorps recherché, est incubé sur une plaque 96 puits.
L’antigène va se fixer de manière électrostatique au fond des
puits. Ils sont ensuite rincés pour éliminer l’excès des
antigènes non fixés.

• 2) Fixation de l’anticorps à doser : On incube notre

échantillon à doser (ex. sérum contenant l’anticorps), ainsi
que nos standards (solution contenant des concentrations
connues d’anticorps). Les anticorps spécifiques vont se fixer
aux antigènes. Un lavage des puits est nécessaire pour
éliminer l’excès des anticorps non fixés.
 La technique se déroule en quatre
étapes principales :
• 3) Fixation de l’anticorps de détection : On incube ensuite un
anticorps secondaire couplé à une enzyme, peroxydase. C’est
un anti-IgG qui va donc reconnaitre l’anticorps primaire. Un
lavage des puits est nécessaire pour éliminer l’excès des
anticorps secondaires non fixés.

• 4) Révélation : On incube un substrat spécifique à l’enzyme

qui, si la réaction est positive (présence de l’anticorps
recherché), va être transformé et induire une coloration
bleue. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la
quantité d’enzyme présente et donc à la concentration
d’anticorps recherchés.
 La technique se déroule en quatre
étapes principales :

• Enzyme peroxydase :
Elle permet la dégradation des peroxydes et la production d’un
composé chromogénique à coloration bleue.
 Technique ELISA

• Exemple de résultats obtenus :

 Technique ELISA

Plaque 96 Puits pour

test ELISA

Lecteur plaque ELISA

 Technique ELISA

Test ELISA direct

 Immunoprécipitation
Objectif : L’Immunoprécipitation (IP) peut être utilisée pour :
• l’isolement d’une protéine d’intérêt à partir d’un extrait cellulaire.
• Pour concentrer une protéine présente en faible quantité.
• Elle constitue l’une des méthodes les plus utilisés pour la détection
d'antigène et sa purification.

Principe:
• Utilisation d’un Ac spécifique de la protéine d’intérêt.
• Précipitation du complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de
protéines se liant aux anticorps (ex : Protéine G)
• Centrifugation de la suspension pour séparation de la protéine
d’intérêt.
Immunoprécipitation
 Immunocytochimie
• C’est une méthode d’analyse des cellules in situ par une
technique d’immunofluorescence.

Objectif : Evaluer l’expression d’une (ou plusieurs) protéine(s) à

l’échelle cellulaire en utilisant des anticorps spécifiques
(monoclonaux ou polyclonaux).

Principe: Utilisation d’un fluorochrome couplé à:

- anticorps primaire = immunofluorecence directe
- anticorps secondaire = immunofluorecence
indirecte
 Immunocytochimie
Marquage par :
- Anticorps primaire anti-tubuline
-Anticorps secondaire couplé à la fluorescéine.

FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine

- Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm
- Fluorescence verte

Mise en évidence du cytosquelette

 Immunocytochimie
Méthode :
Fixation des tissus : étape cruciale
• La fixation est une étape critique dans la
préparation de coupes histologiques. Elle permet
de préserver les tissus biologiques de la
décomposition.
• La structure d'un tissu est déterminée par les
formes et tailles de macromolécules dans et
autour des cellules.
• La fixation arrête toutes réactions biochimiques
en cours.
• Elle peut également augmenter la résistance
mécanique ou la stabilité des tissus traités.
 Fluorochromes : Quelques Exemples

• DAPI
- Excitation à 365 nm; émission à 420 nm
- Contre-coloration de fond des noyaux
- Fluorescence bleue

• FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine

- Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm
- Fluorescence verte

• TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate

- Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm
- Fluorescence rouge
 Cytométrie en flux

• Qu’est ce que la Cytométrie en flux (CMF) ?

Il s’agit d’une technologie qui permet la mesure simultanée de
plusieurs caractéristiques physiques d’une cellule.

• Quelles sont les informations apportées par l’approche CMF

?
• La taille relative (Forward Scatter),
• La granulosité ou la complexité interne relative (Side Scatter),
• L’intensité relative de fluorescence.
Cytométrie en flux
 Cytométrie en flux
Le fonctionnement d’un cytomètre se base sur la
combinaison de trois éléments :

• Fluidique : Pour introduire et canaliser les cellules.

• Optique : Une source d’excitation et de
récupération des signaux émis.
• Electronique : Pour convertir les signaux optiques
en des signaux électroniques et les numériser pour
permettre l’analyse avec un ordinateur.
 Cytométrie en flux
Définition de la CMF :
• La cytométrie en flux
permet l’étude précise de
cellules isolées entraînées
dans un flux liquide. Les
cellules, alignées les unes
derrière les autres, sont
analysées une par une
• en défilant à grande vitesse
(plus de 30Km/h) devant
une source lumineuse (un
laser).
 Caractéristiques de la
Cytométrie en flux

C’est une technique rapide qui permet une

caractérisation :
- individuelle (de chaque cellule)
- quantitative (réalisation de statistique)
- qualitative et multiparamétriques
(morphologie de la cellule et phénotypage)
 OPTIQUE DU CYTOMETRE

La source d’excitation consiste en :

- Un laser ou une lampe.
- Des lentilles pour mettre en forme et focaliser la source
d’excitation.

La collection des signaux consiste en :

 Un système de miroirs et de filtres permettant de diriger et
sélectionner certaines longueurs d’onde vers les détecteurs.
 Principe de la Cytométrie en flux
• Propulsion des cellules une à une à
grande vitesse dans un flux
hydrodynamique.

• Passage devant une source lumineuse

(Laser).

• Adaptée aux cellules en suspensions et

donc à l’analyse de liquides biologiques :

• Récupération de la fluorescence issu

d’un immunomarquage des cellules.

• Possibilité tout de même d’analyser des

cellules tissulaires après dissociation.
 Paramètres FSC/SSC
Mesures de phénomènes de
diffusion lumineuse :
- Forward Scatter (FSC) : la
lumière diffractée est
collectée sous un petit
angle (1 à 10°). Le signal
est relatif à la taille de la
cellule.
- - Side Scatter (SSC) : la
lumière est collectée à 90°
de l’axe du laser. Le signal
est relatif à la granulosité
de la cellule.
 Types de marquage cellulaire

• L’utilisation des anticorps monoclonaux , dirigés contre des

molécules membranaires précises, permet de distinguer des
sous-populations lymphocytaires.
 Appareils

Mini Vidas

Cobas e 411
 Lecteur de microplaques
• Le lecteur de microplaques, aussi appelé ≪ lecteur
photométrique pour microplaques ≫ ou ≪ lecteur
ELISA ≫ est un spectrophotomètre spécialisé dans la
lecture des résultats des tests ELISA, une technique
utilisée pour détecter la présence d’anticorps ou
d’antigenes spécifiques dans des échantillons.

• La technique repose sur la détection d’un antigène ou

d’un anticorps captures sur une surface solide au
moyen d’anticorps directs ou secondaires marques, ce
qui donne une réaction dont le produit peut être lu
avec un spectrophotomètre.
Lecteur de microplaques
 A QUOI SERT UN LECTEUR DE MICROPLAQUES

• Le lecteur de microplaques est utilise pour lire les

résultats des tests ELISA.
• Cette technique a des applications directes en
immunologie et en sérologie. Parmi ses autres
applications figurent la confirmation de la
présence d’anticorps ou d’antigènes spécifiques
d’un agent infectieux, d’anticorps présents a la
suite d’une vaccination ou d’auto-anticorps, par
exemple dans la polyarthrite rhumatoïde.
 PRINCIPES DE FONCTIONNEMENT
• Le lecteur de microplaques est un spectrophotomètre spécialisé.
Contrairement au spectrophotomètre classique qui permet la lecture sur
un large éventail de longueurs d’onde, le lecteur de microplaques possède
des filtres ou des grilles de diffraction qui limitent la gamme de longueurs
d’onde a celles utilisées dans les tests ELISA, en général entre 400 et 750
nm (nanomètres).
• Certains lecteurs travaillent dans l’ultraviolet et effectuent des analyses
entre 340 et 700 nm. Le système optique adopté par de nombreux
fabricants utilise des fibres optiques qui conduisent la lumière dans les
puits des microplaques contenant les échantillons. Le faisceau lumineux
qui traverse l’echantillon a un diamètre de 1 a 3 mm. Un système de
detection capte la lumière venant de l’echantillon, amplifie le signal et
détermine l’absorbance (ou densité optique) de l’echantillon. Un système
de lecture convertit cette valeur en données permettant d’interpreter les
résultats du test.
• Certains lecteurs de microplaques utilisent un système lumineux a double
faisceau.
 Hépatite C (VHC)
⚫ L’hépatite C, due à un virus à ARN simple brin, se
transmet habituellement par le sang : elle est fréquente
chez les toxicomanes…
⚫ Les marqueurs de l’hépatite C comprennent d’une part l’ARN
du virus VHC, d’autre part les anticorps anti-VHC. L’ARN
du VHC peut être recherché (test de détection qualitative) ou
dosé (on parle alors de charge virale). Les anticorps anti-VHC
sont recherchés en ELISA
⚫ Prélèvement 5 cc du sang dans un tube sec.
 Hépatite B (VHB)
• Il existe plusieurs examens utiles pour détecter la présence
d’anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite B (virus à ADN de la
famille des Hepadnavirdae). Ces anticorps sont produits par le patient
afin de permettre une protection contre les antigènes.
⚫ L’antigène viral HBs (HBs Ag) est une protéine d’enveloppe (« s »
pour surface). Elle apparaît 4 à 12 semaines après le contage…
⚫ L’antigène c (HBc) est un antigène de capside (c ) qui n’est pas
exprimé dans le sang…
⚫ Prélèvement 5 cc du sang dans un tue sec
⚫ Indications: hépatites

• NB: Les anticorps dirigés contre les antigènes de surface (anti-HBs)

sont l’examen le plus usuel.
 ASLO
⚫ ASLO: Recherche des anticorps
antistreptococciques
⚫ Prélèvement: 5 cc du sang dans un tube sec
⚫ Indications: RAA, glomérulonéphrite, atteinte
cardiaques, angine à répétition ….
 Sérologie Widal
⚫ Mise en évidence du salmonelle typhique et
paratyphique A et B ou bacille d’Eberth
(Salmonella enterica Typhi)
⚫ Prélèvement: 5 cc du sang dans un tube sec, avec
le traitement
⚫ Indications: fièvre typhoïde et paratyphoïde
 VIH
⚫ Virus d’immunodéficience humaine est le virus responsable de la maladie SIDA
(syndrome d'immunodéficience acquise), il s’agit d’un virus à ARN qui attaque
le système immunitaire de l’Homme.
⚫ Prélèvement: 2 à 5 cc dans un tube sec pour test rapide ou dans un tube EDTA pour
le test de confirmation (Elisa et western blot) et pour étudier de la charge virale.
⚫ Indication: SIDA
⚫ Résultats: Le dépistage est réalisé forcément par 2 techniques différentes : un test de
dépistage immuno-enzymatique (techniques ELISA) et western blot ou PCR.
◾Si la recherche par les 2 techniques est négative, le sujet est séronégatif.
◾Si l'un des tests un nouveau prélèvement est demandé pour effectuer un test
de confirmation. Une fois le test de confirmation est positif, la
séropositivité du sujet au VIH est certaine.
NB: Le SIDA est la conséquence de l'infection au VIH ,son diagnostic se fait par la
détection des
anticorps dans le sang qui apparaissent entre 2 et 12 semaines après la contamination (
séropositivité).