Moyer Priscilla TDA – TP1

TD fluorescence
Article 1 : Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A
comprehensive review
1. Présentez les techniques conventionnelles pouvant être utilisée pour la détection de pathogènes.

Le documents présente 4 grandes techniques « conventionnelles » pour la détection d’agents

pathogènes.

• La culture cellulaire :

Cette technique consiste à mettre en culture un échantillon afin de mettre en évidence la présence
d’un agent pathogène. La réalisation de cette technique nécessite de bonnes connaissances en
microbiologie ainsi que l’utilisation de milieux de culture adaptés. En effet, si la recherche est orientée
vers le mauvais germe avec utilisation d’un milieu de culture inadapté, des temps d’incubation et une
température pas optimaux, il y a un risque de faux négatif. De plus, les résultats de cette techniques
sont limités par le temps d’incubation bactérien qui peut être relativement long.

• Les tests biochimiques :

Ces tests se basent sur les caractéristiques biochimiques des bactéries (mode respiratoire,
consommation des sucres, enzymes respiratoires…). Les tests sont souvent chromogéniques et
nécessite la mise en cultures des bactéries dans des milieux particuliers (galerie macroscopique). Le
délai d’obtention des résultats est donc limité par le temps de culture bactérienne. Cependant, il s’agit
d’une méthode qui permet d’identifier de manière précise et spécifique un germe lorsque l’on possède
une bonne connaissance des germes recherchés.

• Les méthodes immunologiques :

Cette technique est basée sur la mise en évidence d’un antigène grâce à l’utilisation d’anticorps
spécifique. Elle est comporte en premier lieu une étape de reconnaissance des épitopes par les
anticorps puis une étape de révélation qui permet de mettre en évidence la réaction immunitaire. De
nombreuses méthodes qui s’appuient sur ce principe ont été développées en varient la formation des
complexes immuns (utilisation de bille de latex, méthode sandwich…) ou encore les méthode de
révélation (enzymatique, fluorescence…). Le développement de ces méthodes a parfois été nécessaire
pour réduire les coûts ou encore les risques pour les intervenants. Par exemple, le remplacement
d’anticorps radiomarqué par des techniques enzymatiques reste plus idéal pour le technicien ainsi que
pour la gestion des risques au sein du laboratoire.

• Les méthodes basées sur les acides nucléiques :

Cette méthode consiste à mettre en évidence, ou non, la présence du matériel génétique du pathogène
étudié. Pour cela, la technique la plus utilisée est la PCR avec de nombreuses variantes possibles
permettant d’améliorer certains paramètres. La plus connue est la PCR en temps pendant laquelle on
va pouvoir suivre l’amplification de l’ADN grâce à un agent intercalent de l’ADN qui va émettre un signal
fluorescent lorsqu’il se positionne sur de l’ADN bicaténaire. Cette technique, bien que relativement
rapide (de l’ordre de quelques minutes à quelques heures) nécessite l’utilisation d’amorces spécifiques
dont la fabrication peut avoir un coût très élevé. Par ailleurs, il est nécessaire de choisir les amorces
adaptés afin d’avoir le bon équilibre entre sensibilité et spécificité.

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2. Présentez de façon schématique le résultat final d’un ELISA positif pour la présence de S.aureus
dans l’échantillon testé.

3. Expliquez l’intérêt de la PCR nichée (nested PCR) comparé à une PCR classique.

La PCR nichée permet, grâce à l’utilisation d’une deuxième étape de PCR (= amplification du produit de
la première PCR), de diminuer le risque de faux positif et ainsi d’augmenter la spécificité de l’analyse.

4. Pourquoi la méthode d’hybridation est une bonne technique pour la détection de germes dans les
produits alimentaires ?

C’est une méthode qui permet une bonne spécificité car elle est basée sur l’hybridation d’une sonde
spécifique à l’ADN cible. L’utilisation de sondes adaptées (bon pourcentage CG, bonne longueur, bon
Tm…) permet d’avoir une bonne stabilité de l’hybridation. Par ailleurs, cette technique est relativement
rapide car elle ne nécessite pas la mise en culture de souches bactériennes. Selon la technique de
révélation employée, nous pouvons nous affranchir des étapes de lavage et donc augmenter la rapidité
de la technique. Pour finir, des méthodes d’amplification du signal peuvent permettre d’augmenter la
sensibilité.

5. Comment pourrait-on mettre en œuvre une telle méthode (écrire un petit protocole, sous forme
de logigramme ou autre) pour rechercher la présence de S.aureus dans un échantillon de viande.

Hybridation en milieu solide :

• Extraction de l’ADN bactérien par lyse enzymatique

• Dénaturation de l’ADN à l’aide de la température pour le rendre monocaténaire

• Adsorption de l’ADN bactérien sur une membrane de nitrocellulose puis la fixation est rendue
irréversible (chauffer à 80°C pendant 2h)

• Lavage pour retirer les débris cellulaire

• Ajout de sonde marquées par un fluorophore

• Lavage pour retirer les sondes non hybridées

• Révélation des sondes hybridées grâce à un luminomètre

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Article 2 : Simultaneous Detection of Three Foodborne Pathogens Based on

Immunomagnetic Nanoparticles and Fluorescent Quantum Dots
6. Qu’est-ce qu’un Quantum Dot ?

Les Quantum Dots (QDs) sont des nanoparticules qui peuvent être excité à n’importe quelle longueur
d’onde (tant qu’elle reste inférieure au pic d’émission) et qui émettra toujours à la même longueur
d’onde. Cette propriété permet de détecter simultanément plusieurs pics d’émission, lorsque des QDs
de différentes tailles sont excités avec la même longueur d’onde.

7. A l’aide des informations de l’article, légendez de façon plus précise la figure 1.

La première étape de l’expérience A(a), consiste en la fabrication de billes immunomagnétique par

l’assemblage de billes magnétiques avec des polypeptides spécifiques des bactéries que nous
souhaitons cibler.

La deuxième étape A(b), permet l’obtention de nanosonde fluorescentes. Des aptamer spécifiques des
bactéries à cibler sont couplés à des QDs de tel sorte à ce que chaque aptamer spécifique d’une
bactérie possède un QDs de taille différente de ceux qui sont couplé aux autres aptamers.

Réalisation de l’expérience (B) :

Dans un premier temps, les billes immunomagnétiques sont positionnées dans un tube en présence
de l’échantillon. Si les bactéries cibles sont présentes, elles vont venir se fixer sur les billes
immunomagnétiques. Par la suite, les nanosondes fluorescentes sont rajoutée. Elles vont alors venir se
fixer via les aptamers sur les bactéries cibles, si elles sont présentes dans l’échantillon. Pour finir un
aimant est positionné en bas du tube permet d’attirer les billes immunomagnétiques en bas du tubes.
Ainsi il restera dans le surnageant les nanosondes qui n’ont pas pu se fixer au bactéries. Pour finir, la
fluorescence du surnagent est mesurée et est représenté sur un spectre.

8. A l’aide de la figure 8A et 8E, expliquez pourquoi la fluorescence diminue lorsque la concentration

bactérienne augmente.

Sur la figure 8E nous pouvons voir la bactérie qui est fixée à une bille immunomagnétiques mais
également à une nanosonde QD. Lors de la mesure de la fluorescence, le positionnement d’un aiment
en bas du tube réactionnel attire les billes immunomagnétiques vers le bas ainsi que les bactéries et
nanosonde qui y sont fixées. En l’absence de bactérie les billes ainsi que les nanosonde restent
présentent dans le surnagent. La fluorescence mesurée étant celle du surnagent, lorsqu’il y a des
bactéries les nanosondes sont concentrées en bas du tubes et donc il y aura moins de fluorescence

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dans le surnagent. Ce mécanisme explique ainsi la diminution de la fluorescence lors d’une

augmentation de la concentration bactérienne, comme représenté sur la figure 8A.

9. Expliquez les contrôles qui ont été faits durant cette étude.

Durant cette étude plusieurs contrôles ont été effectué afin de s’assurer de la sensibilité et de spécificité
de la méthode.

• Test de sensibilité :

Afin de connaitre les limites hautes et basses de détection de la méthode, l’expérience a été réalisée
avec tout une gamme de dilution de suspension bactérienne.

• Test de spécificité :

Pour s’assurer de la spécificité de la fixation des bactéries sur les billes immunomagnétiques,
l’expérience a été réalisée avec d’autres souches bactériennes. Les souches choisies font partie, pour
la plupart, de la famille des Enterobacteriacea tout comme E.Coli qui fait partie de nos bactéries cibles.
De même, les bactéries choisies sont celles que nous pouvons rencontrer fréquemment comme
pathogène dans l’industrie alimentaire (ex : Salmonella). Ainsi, si une diminution significative de la
fluorescence est constatée avec un autre germe que celui cible, alors on pourra considérer que la
méthode n’est pas très spécifique.

• Test de fluorescence du solvant :

L’expérience a également été réalisée avec une autre matrice tel que le lait. Cela a été important afin
de s’assurer que les protéines présentes dans la matrice, n’interfèrent pas avec la méthode.

10. A l’aide de la figure 9, justifiez que la méthode est spécifique.

Sur la figure 9A, nous pouvons observer la mesure de l’intensité de la fluorescence en fonction de la
longueur d’onde pour plusieurs souches bactériennes. Nous pouvons remarquer que lors de
l’expérience avec nos 3 bactéries cibles, la fluorescence est significativement inférieure que pour les

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autres bactéries étudiées. Ainsi, cela signifie que dans le cas de la réalisation des expériences avec les
bactéries non ciblée, il n’y aura pas fixation de ces dernières ni sur les billes immunomagnétiques ni
sur les nanosondes. Ainsi les QDs resterons dans le surnageant et il n’y aura pas de diminution de la
fluorescence par rapport au blanc. Nous pouvons donc confirmer que cette méthode est spécifique.