Les Mycobactéries.

Mycobacterium tuberculosis

Pr D. YALA
Institut Pasteur d’Algérie
Laboratoire de la tuberculose et des
Mycobactéries
 Introduction

BAAR
 HISTORIQUE :
• 1865 : VILLEMIN .
Montre que la tuberculose humaine est transmissible par inoculation au lapin et
au cobaye Maladie transmissible
• 1882: R. KOCH.
Découvre le bacille ( bacille de la tuberculose = B.K. )
• 1884: R. KOCH.
Culture du B.K. sur du sérum de bœuf coagulé
• 1889: RIVOLTA - MAFFUCI.
Bacille de la tuberculose aviaire .
• 1891: R. KOCH.
Décrit le phénomène immunologique de Koch.
Prépare la tuberculine.
• 1921: CALMETTE et GUERIN.
BCG. 13 ans de subcultures d’une souche de M.bovis sur de la pomme de
terre biliée et glycérinée. (230 passages)
• 1944: WAKSMAN
Streptomycine ( 1er ATB actif sur le bacille de la tuberculose ).
• 1949: PAS.
• 1952: INH. et après de nombreux autres ATB.
• 1967: RIF.
 GENERALITES :

Le genre Mycobacterium appartient à la famille des

Mycobacteriaceae dans l’ordre des Actinomycetales.
Taxonomie :
• 1898 : LACHNER et SANDOVAL
le genre Mycobacterium ,
le genre Corynébacterium ,
le genre Nocardia étaient regroupés dans la même famille.
• 1927 : LEHMANN et NEUMANN
ont classé ces trois genres sur la base de leur propriétés tinctoriales
dans la famille des PROACTINOMYCETACEAE.
• 1971 : TSUKAMURA
décrit le genre Gordona , comme membre de la famille .
• 1977 : GOOD FELLOW et ANDERSON
ont incorporé le genre Rhodococcus.
• 1988 : COLLINS et Col.
ont proposé le nouveau genre Tsukamurella , qui repose sur
l’analyse de l’ARNr 16 S.
Classiquement les mycobactéries sont des bacilles à Gram positif
(faiblement colorés ) , droits ou légèrement incurvés, de 0,2 à 0,6 mm de
large et de 1 à 10 mm de long , immobiles , aérobies , non sporulés et non
capsulés.
La croissance filamenteuse ou en forme de mycelium, produit la formation
d’éléments bacillaires et coccoides.

• Aujourd’hui la définition du genre Mycobacterium

repose sur trois critères (tableau1)

- Acido-Alcoolo-Résistance (AAR ) des bacilles

- Structure des acides mycoliques

- Détermination du contenu « Guanine-Cytosine »

(GC%) de l’ADN
Classification des espèces mycobactériennes 1

• Il existe trois classifications différentes

mais complémentaires
• 1. Selon la vitesse de croissance :
• Les mycobactéries sont divisées en
espèces à croissance rapide et à
croissance lente. (tableau: 2 )
• 2. Selon l’importance médicale :
• Les mycobactéries responsables de tuberculose
• Les mycobactéries atypiques; mycobactéries de
l’environnement
• Les mycobactéries responsables de la lèpre
Classification des espèces mycobactériennes 2
• Selon le risque d’infection tableau3.doc
• a/ Groupe de risque I :
Faible risque d’infection pour l’individu et la population .
Jamais ou rarement responsable de maladies chez
l’adulte normal .
• b/ Groupe de risque II :
Risque modéré pour l’individu ; espèces classées parmi
les pathogènes potentiels ou germes opportunistes .
• c/ Groupe de risque III :
Risque de transmission par voie aérienne. Maladies
sévères parfois mortelles. Ces espèces sont
généralement classées parmi les pathogènes stricts.
 Mycobacterium tuberculosis
• Habitat:
- Réservoir ( vecteur – victime)
- Agent infectant
• Epidémiologie :
• La tuberculose dans le monde :
1.7 M (2/3)
3Millions de DC
8 à 10 nouveau cas /an
En Algérie

• 1995 : 13487 cas 2010: 21732

• 1996 : 15358 cas 2011 :21532-59,9%
• 1997 : 16747 cas
• 1998 : 15334 cas
• 2000 : 16647 cas
• 2001 : 18250 cas
• 2002 : 18954 cas
• 2003 : 19730 cas
• Le risque annuel d’infection «RAI» a considérablement
baissé durant les 30 dernières années de 3% en 1965 à
0,4% en 1997.
Qu’en est-il de la tuberculose en Algérie en 2010??

Tuberculose toutes formes confondues :

21732 cas

Tuberculose pulmonaire :
10093

Tuberculose pulmonaire à microscopie positive :

8402 cas

Tuberculose extra Pulmonaire :

11118
51,2% de tous les cas
 Incidences en 2009

 Tuberculose toutes formes confondues :

63.3 cas/100 000 Hab

 Tuberculose pulmonaire à microscopie positive

24.5 cas /100 000 Hab

 Tuberculose extra Pulmonaire :

32.4 cas /100 000 Hab
Caractères bactériologiques

• Morphologie et
structure:
• 2 - 5 µm de long - 0,2 - 0,3
µm de large
• acapsulé - asporulé –
immobile
• Coloration de Gram : faible
• M.O.: Z.N -
auramine
• M.E.

Paroi

Periplasme

MC
Caractères culturaux 1

• Exigence nutritives
– Les milieux solides
• Loweinstein Jensen
• Milieu de coletsos (pyruvate)
• Milieu de Middlebrook (7H10 ; 7H11)
– Les milieux liquides :
• Milieu de Sauton
• Milieu de Youman’s
• Milieu de Dubos avec ou sans tween 80
• Milieu de Middlebrook (7H9)
• Milieu de Kirchner
Caractères culturaux 2

• Lenteur de croissance
• Aérobie strict
• T° de croissance 35 - 37°C
• pH physiologique 6,9
Caractères biochimiques (tableau4)

• Constitution chimique
et antigénique

• Les lipides
• Acides mycoliques : acides
gras ramifiés seules
constituants de l’acido
résistance du bacille.
• Les polysaccharides :
antigéniques
• Les protéines : support de
l’activité tuberculinique
Transmission de l’infection
• TPM+ 50 à 65%
• TPM- Peu Infectant
• TPM(+) : Toux 3500 particules
Parle 5mn 3500 particules
Eternue 1 million de particules
• TPM(+) = Tbc bacilliféres (tbc cavitaires)
µgttelettes = µg de Flugge
µgttelettes en se desséchant - doplet Nuclei de
Walls (2 à 10 µm de diamètre )
Le devenir du bacille dans l’organisme humain

• Alvéoles (BK: X en fonction de l’immunité innée) (Mo,

MonoCyte. Ly.NK)
• 1-2 mois 105 BK
• Coopération Ly. Mo, CD4 Hypersen + Immunité
antiTBC Sp.
• Nécrose caséeuse (Mo, tissu pulm.) arrêt de Xde BK
• Installation de l’immunité sp. Séro-conversion IDR tub.
• PI: PI Latente
PI Patente
• Durant cette phase latente (6 semaines) le passage du
BK par les lymphatiques au sang du poumon aux autres
organes
 Evolution de l’infection
• Dans la majorité des cas l’évolution est
favorable (90%)
• Dans les 10% restant, l’évolution est
défavorable
• depuis la P.I. (5%) en moyenne 2ans
(réinfection exogène)
Phénomène de Koch :
• Souris 10-14 Jours
lesion DC

• Souris infectée 24 – 48h Réaction puis guérison de

la lésion

• réaction précoce et transitoire: l’allergie tuberculeuse,

ou l’hypersensibilité tuberculinique.(24 à 48h)
• Le fait que la réaction soit transitoire témoigne d’un
état de surinfection: c’est l’immunité acquise (15j.à
2mois)
Diagnostic bactériologique1
• Examens microscopiques
– prélèvements
• prélèvements d’origine pulmonaire
• prélèvements d’origine extra pulmonaire
– confection du frottis (crachat)
– coloration de Ziehl Nelsen
– coloration à l’auramine
Diagnostic bactériologique2
• Mise en culture des prélèvements
– prélèvements contaminés
– prélèvements non contaminés
• test de sensibilité aux antituberculeux
– Méthode des proportions (Cannetti et Rist)
 Intérêt des nouveau tests
diagnostic de la tuberculose
D.Yala – N. Mezghiche
Service de la tuberculose
Institut Pasteur d’Algérie
 Introduction
• Diagnostic bactériologique de la tuberculose par
les techniques classiques restent le « gold
standard ». La microscopie est un test qui reste
rapide pour les TP. Le résultat de la culture des
échantillons est donné au minimum 28 jours
après. Chez les patients nécessitant un test de
sensibilité aux antibiotiques , les résultats ne sont
obtenus qu’au bout de 1 à 2 mois dans les
meilleurs descas.
• Des techniques de biologie moléculaire ont vu le
jour pour raccourcir le temps d’obtention de ces
résultats
RAPPE
LS
Diagnostic bactériologique de la
tuberculose
Mise en évidence du bacille de la
tuberculose par:
• Microscopie (rapide)
RAPPE
LS
Culture (1)
• Sur milieu Solide:
– Milieu de Lowenstein Jensen
– Technique lourde ( matériel, personnel)
– Résultats 28 - 42 – 60 jours
 Culture (2)

– Méthode MGIT (Mycobacterial Growth Indicator

Tube) BACTEC 960

Principe: émission de
fluorescence sous l’effet
de la baisse de la
tension de l’oxygène
dans le tube de culture
spécifique contenant un
indicateur fluorescent
Technique:
Relativement plus simple que le système Bactec
460
• Résultats disponibles en 5 à 20 jours (8 jours)
• Permet la culture et l’étude de la sensibilité
• Mais coût encore élevé matériel et milieux
 Apport de la biologie moléculaire dans
le diagnostic de la tuberculose (1)
PCR : Amplification enzymatique d’un fragment d’ADN « in vitro »
 Amplification génomique PCR
• Sensibilité :
culture + et selon l’ED:
– ED + : Sensibilité = 90 à 100%
– ED - : Sensibilité = 50% à 70%

• Spécificité : > 95%

• ATTENTION:
– Faux positifs (risque de contamination ++++)
– Faux négatifs

• Coût ?

Diagnostic clinique et bactériologique de la tuberculose. Rev Mal Respir 2003 ;20 :7S34-7S40.
Apport de la biologie moléculaire dans
le diagnostic de la tuberculose (2)
• Rappel : Test de sensibilité au antituberculeux
méthode des proportions
• A partir d’un crachat +
culture ( 2 mois)

• A partir d’un crachat à

M+++ (1 mois)
Mutation induisant la résistance

Sauvage
AT
B
mutation

?A T ?
B?
ADN
 MTB DR plus (Hain)
• Connaissant le gène et ses différentes
mutations, des techniques nouvelles de
détection rapide de cette résistance ont vu
le jour MTBDRplus Hain (Rif + Inh)
MTBDRsl Hain ( ATB mineurs)
 Principe de la technique
• C’est une technique qui repose sur la recherche
des mutations sur le gène rpoB qui code pour la
résistance à la Rifampicine et sur le gène katG
et le gène inhA qui code pour la résistance à
l’isoniazide.
• Elle permet l’identification des souches du
«complexe tuberculosis »
• Peut se faire sur les colonies de culture, et se
fait aussi sur les crachats (microscopie
positive).
• Elle repose sur une PCR multiplex suivi d’un
hybridation inverse et révélation
Bandelette du test MTB DR plus (HAIN)
• Sensibilité de la technique:
La littérature montre que la sensibilité de la
technique pour la détection de la résistance
à la rifampicine varie de 98% à 100 % .
Pour la détection de la résistance à
l’isoniazide est de 85%:
katG dans 60 à 90%
InhA dans 15 à 43 %
• Spécificité de la technique: 100%
Cibles des antituberculeux et mutations responsable
de résistance chez M. tuberculosis

INT J TUBERC LUNG DIS 13:1320–1330, 2009

Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis
Y. Zhang, W. W. Yew
Indications
 Patients suspects de résistance à la
rifampicine et à l’isoniazide (sujets
chroniques, échec thérapeutique, plusieurs
cures, traitement anarchique….

Sujets contacts avec un cas index connu

comme « MDR ».
 Xpert MTB/RIF
Principe:
• C’est un système automatisé conçu pour gérer
l'ensemble du déroulement des tests moléculaires
(filtration, extraction d’ADN, amplification, détection)
depuis le chargement de prélèvement jusqu’au rapport
final des résultats de test.

• Le test est basé sur une amplification en temps-réel

ayant pour cible le gène rpoB, avec une grande
spécificité et sensibilité qui permet:

 Identification du complexe M.tuberculosis (TP + TEP)

Détection de la résistance à la Rif.
 Xpert MTB/RIF
1-Liquéfaction et
inactivation de prélèvement
2:1 (non déco)
1 3:1 (déconta)

2-Transférer 2ml
d’échantillon dans la
cartouche.
4, 5, 6, 7,
3- Insérer la cartouche
dans MTB/RIF
2 plateforme.
8 4- Filtration et lavage
des microorganismes.

5- Extraction d’ADN
Ultrasonication.

6- Mix: ADN +
PCRréactifs

7- Amplification (real-
3 time) et Détection du
produits.

8- Affichage de
résultats.
Evaluation de la Sensibilité -
Spécificité du test MTB/RIF
1730 patients Peru, azerbaïdjan, S-Africa, India.
2008-2009
DIAGNOSTIC
1 prélèvement ED+ Culture + Xpert MTB/RIF 92,2%

1 prélèvement ED - Culture + + Xpert MTB/RIF 72%

3 prélèvements ED+ Culture + Xpert MTB/RIF 90,2%
RESISTANCE
RIF
Sensibilité 99,1%
Spécificité 100%
 Résultats
1
La sensibilité et la spécificité pour
le diagnostic de la tuberculose
Culture(
Culture (+)
Sensibilité 92.2% -)

Spécificité 99.2%
ED (+) ED (-) ED (-)

MTB
Détect 551 124 5
Xpert é
MTB/Ri
f
MTB
non
10 47 604
Détect
é
 Résultats
2
La sensibilité et la spécificité pour
le diagnostic de la résistance à la
Rif
Test de sensibilité Rif
Sensibilité 97.6%

Spécificité 98.1%
Rif (R) Rif (S)

Rif (R)
Détect 200 10
Xpert é
MTB/Ri
f Rif (S)
Détect 5 505
é

Catharina et all. N Engl J Med 2010

 Conclusion (1)
• 6920 cultures positives ( MGIT,
Lôwenstein-Jensen) le Xpert MTB/Rif est
indéterminé pour 381 cultures (5%).

• 20/2072 (1%) rifampicine résistant, Xpert

MTB/Rif est indéterminé.
 Recommandations???
Evaluer la méthode dans Laboratoire National de la
Tuberculose

Mettre à la disposition des laboratoires Régionaux de

Référence et les structures hospitalière (CHU) qui prennent
en charge les malades multi-résistants
Conclusion

Cet automate c’est

Mon rêve, mais

US$ 17 000 automate.

US$ 50/ test.
US$ 17 cartouche.
Maintenance ???
Apport de la biologie moléculaire dans la
tuberculose
– PCR
– BACTEC
– MGIT
• Typage du complexe tuberculosis
– Spoligotyping
– RFLP
 Tuberculose.
Nouvelles approches diagnostic
D.Yala
Service dfe la tuberculose
Institut Pasteur d’Algérie
• La tuberculose est une maladie infectieuse
et contagieuse
• Elle reste encore un problème de santé
publique
• Plus 20000 cas de tuberculose toute
forme confondue ont été recensé en 2009
 Diagnostic bactériologique de la
tuberculose
Diagnostic repose sur la mise en évidence
du bacille de la tuberculose par:
• Microscopie

• culture
 Apport des techniques moléculaires
au diagnostic de la tuberculose
Les méthodes moléculaires à visées
diagnostic et épidémiologique:

– La connaissance du
génome , Séquençage
complet de M.
tuberculosis H37Rv en
1998
Principales marqueurs d’ADN utilisés

- Séquences répétées réparties en différents

points du génome:
- Marqueur IS6110 : Séquences répétées
(RFLP, amplification génomique: PCR, )
- MIRUs-VNTR (PCR)
- Région DR (Spoligotypage)

- Portions de gènes:
- Gène codant pour ARN 16S (PCR)
- Gène rpo B (Résistance rifampicine)
- Gène Kat G , inhA (résistance à l’INH)
ADN répété ( séquences)
Principe de la PCR
L’amplification exponentiel de l’ADN lors de la PCR
 Place des techniques moléculaires dans le traitement
d ’un échantillon

Prélèvement Culture

Amplification -RFLP
génomique: PCR
- Spoligotypage ID
Hybridation - MIRU
Echantillon Séquençage
+/- ?

Identification
M.Tub
Identification Id. au sein du complexe
d ’espèce typage
 Amplification génomique PCR
• Sensibilité :
culture + et selon l’ED:
– ED + : Sensibilité = 90 à 100%
– ED - : Sensibilité = 50% à 70%

• Spécificité : > 95%

• ATTENTION:
– Faux positifs (risque de contamination ++++)
– Faux négatifs

Diagnostic clinique et bactériologique de la tuberculose. Rev Mal Respir 2003 ;20 :7S34-7S40.
Diagnostic rapide de la résistance de Mycobacterium
tuberculosis à la Rifampicine et à l’Isoniazide

• Dans le traitement de la tuberculose, l’isoniazide et la

rifampicine sont des antituberculeux majeurs .

• Chaque année le LNR prend en charge environ 60

patients ayant une souche «MDR» (NT/T)

• La transmission des souches multirésistante dans les

collectivités est sensiblement la même que les souches
sensibles.
• La détection de ce type de résistance par les techniques
classiques met au moins 02 mois (prélèvement à
l’antibiogramme), pendant cette période, le malade est
considéré comme un véritable réservoir qui dissémine
les bacilles dans la nature (cracheurs à microscopie
positive).
• la technique « MTB-DR plus » est utilisé
pour détecter la résistance à la RIF et à
l’INH
 Principe de MTB-DR plus
• Rechercher:
– Des mutations sur le gène rpoB qui codent pour la
résistance à la Rifampicine;

– Des mutations sur le gène katG et le gène inhA qui

codent pour la résistance à l’isoniazide.
• Test peut se faire:
– Crachat ++
– Colonies (culture)
 MTB D plus
PCR multiplexe suivi d’un
hybridation inverse et
révélation
MTB-DR plus
 En littérature la résistance à la rifampicine est codée
dans plus de 98% par le gène rpoB.
 La résistance à l’isoniazide est codée par deux gènes :
 katG dans 60 à 90%
 InhA dans 15 à 43 %
Indications:
 Patients suspects de résistance à la rifampicine et à
l’isoniazide (sujets chroniques, plusieurs cures,
traitement anarchique….

 Sujets contacts avec un cas index connu comme

« MDR » avec M+ .
 Épidémiologie et typage moléculaire
• Diagnostic d’espèce au sein du complexe tuberculosis par typage:
• RFLP
• MIRU-VNTR
• Spoligotyping

• Principe: souches à profil génomique identique 

 lien épidémiologique

• Condition: Marqueur génomique suffisamment

– Polymorphe pour distinguer des souches différentes
– Stable pour identifier les isolements d’une même souche

• Applications:
– Identifier les chaînes de transmission (communauté ou hôpital)
– Différencier réinfection et rechute
– Identification des cas de contamination de laboratoire ou de fibroscope
– Évolution des bacilles et structure des populations de bacilles selon les
zones géographiques, identification des familles émergentes de bacilles,
– Suivi des tuberculoses multirésistantes.
Exemple de profil RFLP IS6110
Typage par MIRU -VNTR
Spoligotyping
 Conclusion
• Le diagnostic par la bactériologie reste le
« gold standard » (microscopie/culture)
• L’amplification génomique (PCR) ne
donne pas les résultats escomptés
• L’épidémiologie moléculaire de la
tuberculose complète l’épidémiologie
classique.