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MYCOBACTERIES

Dr Messala
I- HISTORIQUE :
 La tuberculose existe au moins depuis 120 siècles.
 Elle était reconnue par les médecines grecque, chinoise, égyptienne et indienne.
 Hippocrate décrit des tubercules, des ulcérations et des pleurésies ainsi que les premiers « traitements ».
 1865 : Villemin montre que la tuberculose humaine est une maladie transmissible.
 1882 : Découverte du bacille de Koch (actuellement nommé M. tuberculosis)
 1902 : Dorset (milieu de culture à l'oeuf qui sera amélioré par (Lôwenstein, Jensen, Coletsos, Petragnani).
 1902 : Découverte de M. bovis, agent de la TBC bovine.
 1921 : Calmette et Guérin: vaccin (B.C.G.), après 13 ans de subculture d'une souche de M. bovis sur pomme de
terre glycérinée.
 1944 : Waksman découvre la streptomycine.
 1950 : Découverte du rôle pathogène
d'autres Mycobactéries dites atypiques.

II- CLASSIFICATION :
 Les Mycobactéries appartiennent
a la famille des Mycobacteriacae dans l’ordre des Actinomycètales. Elle comprend un seul genre: Mycobacterium lui-
même subdivisé actuellement en plus de 90 espèces.
 Parmi ces espèces 3 sont responsable de tuberculose chez l’homme et forment le complexe tuberculosis :
1- M.tuberculosis: dont le réservoir est l’homme, c’est le plus fréquent en Algérie.
2- M.bovis: Responsable de tuberculose bovine transmisse à l’homme.
3- M.africanum: Agent de tuberculose en Afrique centrale et orientale.
 Mycobacterium.leprae est responsable de la lèpre, sévit principalement dans les pays du tiers monde situés en
zone intertropicale
 Les autres Mycobactéries sont dites atypiques, elles sont agent de mycobactériose chez l’immunodéprimé et
sont peu ou pas pathogènes chez le sujet sain.

III- STRUCTURE:
 Les mycobactéries sont riches en lipides. Leur structure de base est un peptidoglycane lié de manière covalente
à un mycolate d'arabinogalactane.
1. Peptidoglycane.
2. Arabinogalactane: polyoside.
3. Acides mycoliques: acides gras ramifiés et hydroxylés responsables de l'acido-alcoolo-résistance des mycobactéries.

4. Mycolate d'arabinogalactane: remplace le LPS des Gram (-)


5. Le « cord-factor »: responsable de la formation de cordes chez M. tuberculosis en milieu liquide.
6. Cires: 4 types : A, B, C et D.
7. Protéines: support de l'activité tuberculinique extraites du corps bactérien ou du filtrat de culture

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MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
I- INTRODUCTION :
Découvert par Koch en 1882 d’où le nom de bacille de Koch.

II-CARACTERES BACTERIOLOGIQUES :
1)- Morphologie :
 Bacille de 2 à 5 µm de long et de 0,3 µm de large, rectiligne ou +/- incurvé, aux
extrémités arrondies et immobile, non capsulé et non sporulé.
 Dans les produits pathologiques il se présente sous forme isolée ou en petits amas.
 En culture on peut observer des formes coccoïdes ou filamenteuses.
 Bacilles difficilement colorables par les colorants usuels.
 Coloré par la fuschine phéniquée à chaud et n’est pas décoloré par l’acide sulfurique à 25 % et par l’alcool à 95 °.
 Il apparaît au microscope optique après coloration de Ziehl-Neelsen comme un bâtonnet rouge sur fond bleu.
 Au microscope à fluorescence et après coloration à l’Auramine il apparaît jaune fluorescent sur fond noir.
M.TUBERCULOSIS COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN ET A L’AURAMINE

2)- Caractères culturaux :


 Aérobie strict parfois micro aérophiles (M. bovis ou M. africanum)
 Température de croissance entre 35 et 37 °C, PH 6,9.
 Exige des milieux spécifiques:
A/- Milieux solides:
1- Loewenstein Jensen à l'œuf coagulé. (sels minéraux, glycérol, œuf et vert malachite).
2- 1/2 de Coletsos additionné de pyruvate permet une meilleure pousse de M. bovis et M. africanum.
Milieux de culture

Milieu de Lowenstein jensen Milieux liquides (Middelbrook)

 Ces milieux sont caractérisés par: leur sensibilité, leur faible coût et définissent les caractères culturaux
classiques de M. tuberculosis.
3- 1/2 de Middlebrook (7H10, 7H11): transparent, colonies mieux visibles, culture précoce mais moins sensible et plus
cher, contamination facile.
M.tuberculosis est caractérisé par sa lenteur de croissance ; il se divise une fois toutes les 20 heures d’ou colonies
visibles en: - 3 à 4 semaines pour M.tuberculosis.
- 45 à 60 jours pour M. africanum et M. bovis.
Ce sont des colonies:
 Habituellement R (eugéniques), en chou-fleur, de couleur crème beige pour M. tuberculosis.
 S (dysgoniques) pour M. bovis et M. africanum.
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COLONIES DE M.TUBERCULOSIS EN CHOU-FLEUR MYCOBACTERIES ATYPIQUES

B/- Les milieux liquides:


 Fabriqués pour la plupart par la même base (7H9)
 Supplémentés en facteurs de croissance et ATB.
 Détection automatique: Bact/Alert (hémoculture isolator), système Bac tec (radiométrique), MGIT®(milieu
contenent 1 indicateur de fluorescence) ou visuelle.
 Réduisent le délai de positivité à:
 Quelques jours pour les prélèvements très riches.
 Un peu + de 2 semaines pour ceux paucibacillaires.
 En milieu liquide, M. tuberculosis apparait sous la forme de longues "cordes" mises en évidence par la
coloration de Ziehl-Nelseen du à la production d'une substance particulière appelée "cord factor".

Détection automatique ou visuelle Longues "cordes" mises en évidence par la


Coloration de Ziehl-Nelseen

3) – Identification :
L’identification de l’espèce repose sur:
A - Caractères biochimiques:
 Catalase à 20°C et à 68°C.
 Nitrate réductase: effectuée sur culture âgée de 3 à 4 semaines.
 Niacine test (production d’acide Nicotinique) effectué entre le 28e et le 42e jour de culture.
B - Sensibilité à des substances agissant sur le métabolisme:
 Resistance au TCH.(hydrazide de l’acide thiophène-2-carboxylique )
 Sensibilité au PNB.(acide para-nitro benzoïque )
La catalase thermolabile Nitrate réductase : Positive NIACINE TEST POSITIF

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4)-DIAGNOSTIC DIFFERENTIEL :

III- SENSIBILITÉ AUX AGENTS PHYSIQUES ET CHIMIQUES:


A - Agents physiques:
 Sensibles à la chaleur et résistent à + 4°C.
 Sensibles aux rayons UV.
 Résistent à la dessiccation (restent virulents dans les gouttelettes de Pflugge desséchées)
B - Agents chimiques:
 Les acides et bases détruisent les mycobactéries, mais moins vite que les germes banaux.
(Utilisés pour décontaminer des prélèvements)
 Détruits par l’alcool en quelques minutes.
 Sensibles à l’action de l’alcool, les mélanges savon-phénol, Nacl, le formaldéhyde, le glutaraldéhyde alcalin.
 Résistent aux ammoniums quaternaires.

IV-HABITAT ET TRANSMISSION :
 La bactérie infecte essentiellement l’homme avec une prédilection pour l’appareil pulmonaire.
 L’excrétion du bacille par le malade explique qu’on puisse l’isoler de façon transitoire dans l’environnement
(résiste au froid, dessiccation).
La transmission se fait par:
 Voie aérienne: par les gouttelettes de Flügge à l’occasion d’accès de toux ou d’éternuement, voir en parlant, à
partir des sécrétions bronchiques drainant les lésions pulmonaires cavitaires (les autres localisations closes ne
participent à la transmission du bacille qu’au stade de fistulisation)
 Voie digestive: possible ne concerne que la tuberculose à M. bovis. pratiquement éradiquée dans les pays où
le cheptel est contrôlé et le lait pasteurisé

V- EPIDEMIOLOGIE :
 Tuberculose = une des maladies
infectieuses les plus mortelles
 Evolution chronique.
 Localisation pulmonaire:
- la + fréquente
- la + contagieuse
 1/3 de la population mondiale est infectée
(2 milliard) (pays en voie
de développement + + +)
 10 millions de nouveaux cas chaque année.
 2 millions de décès/an.
Le risque annuel élevé d’infection tuberculeuse a été majoré par l’épidémie du Sida.
Depuis les années 1990, plusieurs flambés de TBC à bacilles multi-résistants dans le monde ont été signalées.
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La resistance bacterienne :
• La résistance dite primaire (ou « résistance initiale »):
Est définie par la résistance observée chez les patients tuberculeux n’ayant pas reçu de traitement antituberculeux («
nouveau cas ») et donc liée à la transmission interhumaine de souches résistantes.
 La résistance dite secondaire:
Est définie par la résistance observée chez les patients ayant déjà reçu un traitement antituberculeux et donc
essentiellement liée à la sélection de mutants résistants lors du (des) traitement(s) antérieur(s) mal conçu(s) ou mal
suivi(s).
Définitions de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) de la multirésistance
(MDR) et de l’ultra-résistance (XDR) :
 Un cas de tuberculose est dit multirésistant (MDR) lorsqu’il est causé par une souche du complexe
Mycobacterium tuberculosis résistante à la rifampicine et à l'isoniazide.
 La résistance supplémentaire aux fluoroquinolones et à au moins un des trois antituberculeux injectables de
deuxième ligne (amikacine, capréomycine, kanamycine) définit l’ultra-résistance (XDR pour « Extensive Drug
Resistance »)
 Le terme de « pré-XDR » est parfois utilisé pour qualifier les tuberculoses MDR résistantes aux fluoroquinolones
ou à un des trois antituberculeux injectables de deuxième ligne.
 Le terme de totale/pan-résistance, qui n’est pas bien standardisé mais est d’usage fréquent, correspond à une
résistance à tous les traitements antituberculeux (anti-TB).

VI-PHYSIOPATHOLOGIE :
1-Inhalation des bacilles
2-phagocytose par les macrophages alvéolaires.
3-transformation en cellules épithéloides en cellules multinucléées géantes
4-qui s’ entourent d’une couronne lymphocytaire
5-Formation d’un granulome au sein du quel apparaît la nécrose caséeuse
Granulome inflammatoire à l’anatomopathologie

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 Tout peut s’arrêter à ce stade par un enkystement et une calcification des lésions suivis d’une auto-stérilisation
spontanée du chancre d’inoculation. C’est la situation la plus fréquente.
 Lésion primaire guérie spontanément (les bacilles peuvent rester dormants pendant des années)
 La survenue de la maladie est favorisée par:
 la dénutrition.
 l’affaiblissement des défenses immunitaires (âges extrêmes, corticoïdes, infection à VIH)
 baisse de l’immunité cellulaire
 réactivation des bacilles et liquéfaction du caséum
 fistulisation dans une branche
 formation de la caverne tuberculeuse (excellent milieu de culture)
 dissémination extrapulmonaire par voie hématogène ou lymphatique.
 Tuberculose maladie

VII-POUVOIR PATHOGENE :
 Primo-infection: presque toujours asymptomatique.
 Tuberculose maladie: survient quelques mois à quelques années après la primo-infection, de
localisation surtout pulmonaire, (très contagieuse) Apanage de l’adulte.
 Signes généraux:
 Une fièvre vespérale.
 Une Asthénie.
 Un amaigrissement.
 Une anorexie.
 Des sueurs nocturnes.
 Les localisations extra pulmonaires, associées ou non à une TBC pulmonaire sont plus rares et peu
contagieuses.
 Les plus fréquentes sont :
 Miliaire
 Méningites
 Adénite cervicale (Ganglionnaires)
 Ostéo-articulaires. (mal de Pott, coxalgie)
 Génito-urinaires.

VIII-Diagnostic au laboratoire :
1)- les prélèvements :
 La mise en évidence du bacille tuberculeux en microscopie et/ou en culture reste le critère essentiel du
diagnostic de certitude de la tuberculose pulmonaire ou extra-pulmonaire.
Selon la localisation de l’infection et signes cliniques.
 Les prélèvements doivent être réalisés avant toute antibiothérapie active sur le bacille tuberculeux.
 3 à 6 prélèvements sont exigés.
2 types de prélèvements :
a)- Origine pulmonaire:
 Expectorations ou crachats: 1 échantillon matinal, après un effort de toux (3 j de suite).
 Tubage gastrique: pour les non cracheurs : Femmes et enfants en milieu hospitalisé, permet de recueillir les
mucosités bronchiques dégluties pendant le sommeil avant que les contractions de l’estomac n’aient chassées
le contenu.
 Aspiration ou lavage bronchique: aspiration lors d’une bronchoscopie des secrétions bronchiques.
 Ecouvillonnage laryngé.(Petite quantité, utilisé pour la culture) lorsque les méthodes précédentes ne sont pas
possibles, il permet de recueillir les mucosités pulmonaires présentes dans le larynx.

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b)- Origine extra pulmonaire:
 Contaminés :
 Urines (1iere urines du matin).
 Pus d’abcès ou ganglion fistulisé.
 Sécrétions génitales.
 Prélèvement prélevé sans asepsie.
 Non contaminés :
 LCR.
 Liquide pleural, péritonéal, péricardique ou articulaire.
 Biopsie chirurgicale.
 Liquide ganglionnaire (non fistulisé)
NB: Etiquette collée sur la paroi du crachoir et non sur le couvercle.
CONSERVATION :
 Examen le + tôt possible préférable
 Si acheminement immédiat impossible: conservation à + 4°C pour une durée de 5j maximum.
TRANSPORT :
 Se fait dans les centres de collecte.
 Dans des glacières avec portoirs et « Ice box » conçue spécialement pour ça.
 Le transport dans des crachoirs opaques hermétiquement fermés et soigneusement étiquetés.
 Le transport ne doit pas excéder 3 heures.
 Fiche de renseignements:
Complète + nature et durée du TRT anti-tuberculeux reçu.
2)- l’examen direct :
Après confection du frottis, on colore la lame par les colorations usuelles.
Coloration de Ziehl neelsen :
 1er Temps: Coloration :
- Mettre la lame sur un support en métal ou en verre.
- Recouvrir en totalité de fushine de Ziehl filtré sur papier, chauffer doucement jusqu’à émission de vapeur au moyen
de la flamme d’un coton trempé dans l’alcool et flamber.
- Laisser agir 10 mn, tout en chauffant la lame toute les 03 mn.
- Eviter l’ébulition et dessèchement du colorant, si nécessaire ajouter de la fushine pour que la lame soit toujours
recouverte.
 2ème Temps: Décoloration :
- Il faut rejeter le colorant, laver immédiatement à l’eau ordinaire.
- Recouvrir d’acide sulfurique (diluer au ¼) pendant 03mn, laver, recouvrir d’alcool à 90° pendant 05mn et laver.
 3ème Temps: Contre coloration :
Recolorer pendant 30 sec par du bleu de méthylène, laver, laisser sécher avant examen microscopique.
 La lecture se fait au microscope ordinaire avec un objectif à émersion (x100), en créneau

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Etapes coloration de Ziehl neelsen :

Confection du fixation Coloration chauffage Decoloration par l’acide sulfurique


frottis par la et ‘alcool
fushine

Rincer contre colorer par le bleu Rincer


de méthylène

 COLORATION A L’AURAMINE :
1- Temps de coloration: Auramine phéniquée pendant 20 mn, rincer.
2- Temps de décoloration: Mélange acide-alcool pendant 4 mn, rincer.
3- Temps de contre coloration: - Permanganate de K à 1% pendant 1 mn ,sécher.
-Observer au microscope a fluorescence à l’objectif 25 ou 40.
 La coloration de Ziehl neelsen est la méthode de référence, elle est spécifique et nécessite 5 à 20 mn par lame.
Le MBT apparait en rose (rouge) sur fond bleu.
 La coloration à l’auramine nécessite 2 à 5 mn par lame donc applicable dans les grands laboratoires recevant un
nombre important de prélèvements.
Le bacille apparait en teinte vert-jaune en microscope à fluorescence.
ses avantages: lecture rapide.
ses inconvénients: faux positifs.
 Les lames positives à l'auramine doivent être recolorées par le Ziehl-Neelsen.
 Les résultats sont exprimés de façon quantitative.

Coloration de ziehl Coloration de


Neelsen l’auramine

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LECTURE ET INTERPRETATION :

3)- La culture :
 Permet de porter un diagnostic de certitude de la tuberculose.
 Le milieu de culture utilisé dans notre laboratoire est le Lowenstein jensen (LJ).
 Ensemencer 2 tubes LJ par prélèvement.
 Prélèvements non contamines: ensemencer directement à raison de 2-4 gouttes par tube LJ.
 Prélèvements contamines: Décontamination avant mise en culture
 (plusieurs méthodes de décontamination, basées sur une décontamination chimique NAOH suivie d’une
neutralisation H2SO4)
 Incubation à 37°C (bouchon légèrement fermé apport en O2 + sécher les tubes)
La lecture : à 48 H
 Vérifier l’absence de contamination,
 Détecter les mycobactéries a croissance rapide
 Puis toutes les semaines.
 En pratique, les résultats sont rendus aux:
28è J, 42 et au 72è jour d’incubation.
La culture est positive lorsqu’on note la présence de colonies caractéristiques de MBT sur LJ:
Aspect des colonies en choufleur, rugueuses, de teinte crème beige dites eugoniques.
 Les résultats sont exprimés de façon quantitative.
LECTUE DES PLATEAUX :
Dénombrer les colonies si incomptables rendre: infini ∞
1- Réponse quantitative : présence de BAAR.
2- Réponse qualitative : nombre de colonies.
 Une deuxième réponse:
Rendue au 42 ème jour (si (-) au 28 ème jour)
 Une dernière réponse:
Rendue le 72ème jour (si (-) au 28 ème,42 ème jours)
Identification :
a) Production de l’acide nicotinique:
MBT libère de l’acide nicotinique dans le milieu de culture sans l’utiliser, cette propriété permet d’utiliser un test
principal d’identification: Niacine test ou test de Kono.
Seul MBT est niacine test (+).
b) Réduction des nitrates en nitrites: MBT est NR (+).
c) Catalase:
Toutes les mycobactéries possèdent une catalase.
La catalase est positive à 20°C et négative à 68°C pour MBT:catalase thermolabile.
Elle est thermostable pour les mycobactéries atypiques.

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d) Autre caractères:
MBT est résistant à l’hydrazide de l’acide thiophène-2-carboxylique ou TCH.
Possède une uréase, nicotinamidase, pyrazinamidase
Les nouvelles techniques diagnostics pour la tuberculose :
A partir du prélèvement, permettent un diagnostic plus rapide
 La PCR (détection de l’ADN dans le produit pathologique).
 Amplification transcriptionnelle.(Gene-Probe)
 Amplification par déplacement de brin (SDA)
 Hybridation avec des sondes du fragment amplifié: (INNOLIPARifTB) permet de détecter la résistance à la
Rifampicine à partir du produit pathologique ou de la culture.

Sensibilité aux anti-TB :


 On teste 5 antituberculeux, isoniazide (INH), streptomycine, éthambutol
, rifampicine et pyrazinamide.
 Plusieurs techniques existent reposant sur la méthode des proportions
en milieu solide ou en milieu liquide

IX-TRAITEMENT :
Objectifs: -Doit être bactéricide
- Empêcher la sélection de mutants résistants par association d’antibiotiques.
Molécules utilisées :
-Rifampicine ( R )
-Isoniazide (INH)
-Pyrazinamide (PAZ)
-Ethambutol ( E )
-Streptomycine ( S )

X- PREVENTION :
 En cas d’infection pulmonaire l’isolement du malade est recommandé.
 la vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) est obligatoire et systématique dès la naissance
 Elle est de l’ordre de 80 % vis à vis des formes graves de tuberculose chez l’enfant (méningite et miliaire) et de
l’ordre de 50 % vis à vis des formes communes.
 Contre indiqué en cas de déficit profond de l’immunité cellulaire.

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