LABORATOIRE Procédure de l’examen cytobactériologique du liquide

MOHAMMED céphalorachidien (LCR)

ZEFZAF DATE D’APPLICATION
REDACTRICE APPROBATRICE

Dr : KHAFALLAL SOUKAINA Dr : BERRA MOUNA 12/10/2020

FONCTION : BIOLOGISTE FONCTION : DIRECTRICE
ASSISTANTE

1. But

 Le but de ce mode opératoire est de décrire la méthode de recueil et la

réalisation d’un examen cytobactériologique d’un liquide céphalo-
rachidien (LCR).

2. Etendue

 Ce mode opératoire s’applique à toute demande de compte de LCR reçu

au laboratoire.

3. Responsabilité

 Le technicien responsable de l’unité de microbiologie est tenu de veiller à

la mise en application des dispositions prises dans ce mode opératoire.

4. Documents de références

 Cours de bactériologie du professeur Fafa Cissé : professeur de

microbiologie à l’université Cheikh Anta Diop de Dakar,Sénégal.
 Cours de bactériologie de la quatrième année du diplôme d’étude
spécialisé en biologie clinique, université Cheikh Anta Diop de
Dakar,Sénégal .

5. Contenu
5. 1- Définition

 Le LCR :
o est un liquide biologique transparent dans lequel baignent le
cerveau et la moelle épinière .Il est contenu dans les méninges entre la
pie-mère et l’arachnoïde.

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 Méningite :
o est une inflammation aigue ou chronique des méninges ,le plus
souvent secondaire à une agression de type infectieux.
o Elle se manifeste sur le plan biologique :
- Par des modifications de la composition du LCR
- Souvent par la présence de micro-organismes.

5. 2- différents types de méningite

 Méningites communautaires(liquide clair)

 Origine virale : généralement bénignes et d’évolution spontanée
favorable (Echovirus, Coxsackie, virus ourlien)
 Méningites fongiques : rares liées à une immunodépression
(Cryptococcus neoformans, Candida albicans)
 Origine bactérienne : (Bacille de tuberculose +++, ou Treponema
palidum, brucella, leptospires…)
 Méningites communautaires (liquide purulent)
 Méningites néonatales (0-1 mois)
• E coli K1.
• Listeria monocytogenes.
• Streptococcus agalactiae.
 Méningites du nourrisson (1 mois – 2 ans) (ORL)
• Neisseria meningitidis,
• Streptococcus pneumoniae.
• Haemophilus influenzae (type b).
 Méningite de l’enfant et de l’adulte
• Neisseria meningitidis (enfant et jeune adulte).
• Streptococcus pneumoniae (tous les âges),
• Listeria monocytogenes (>50 ans)
 Méningites neuro-chirurgicales
• Staphylococcus aureus ou epidermidis

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 • Streptococcus pneumoniae
• Enterobacteriaceae.
• Pseudomonas et apparentés

6. Recueil du LCR :ponction lombaire :(PL)

6.1-Conditions de la PL

 Matériels pour la PL
• Aiguille à PL stérile avec mandrin
• Plateau : tampons stériles de coton hydrophile
• Antiseptique : alcool iodé
• Trois tubes stériles
 Moment de la PL
• Avant toute antibiothérapie.
• Tout moment du jour et de la nuit.

6.2-Technique du recueil

- Le recueil est fait exclusivement par le clinicien.

 Sites de la PL
• Classiquement : entre les vertèbres L3 et L4 ou L4 et L5.
• Nouveau-né et nourrisson : au niveau de la fontanelle.
• Adulte et grand enfant : voie sous-occipitale.
 Technique de la PL
• Malade couché en décubitus latéral ou assis « dos rond ».
• Asepsie rigoureuse à l’alcool iodé :
- De la zone de la ponction lombaire ; ne plus palper la zone après
cette étape
- Lavage ou désinfection de la main du préleveur ; puis port de
gants
• Ponctionner et recueillir 5 à 6 ml de LCR à repartir entre :
- Tube destiné à la Bactériologie.
- Tube destiné à la Chimie.
- Tube destiné à la Cytologie.

6.3-Transport – Conservation

 Transport du LCR
• Acheminement immédiat : délai de 30 mn (lyse de 50% leucocytes
en 2H)
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 • Utiliser des milieux de transport – survie au besoin
o Conditions de transport pour un délai plus de 24 h :
• Selon les recommandations de l’OMS, Inoculer 0,5 à 1 ml de LCR
dans le milieu de Trans-Isolate :TI préalablement réchauffé à la
température ambiante Identifier et remplir la fiche de prélèvement
puis envoyer au labo de référence dans les 48h
o Si le transport excède 48 h :
• Ventiler le flacon avec de TI au moyen d’une grosse aiguille
cotonné stérile.
• L’aiguille ne doit pas toucher le milieu de culture.
• Au moment de l’envoi enlever l’aiguille et expédier le TI dans le
triple emballage.
 Conservation du LCR
• Tube destiné à la Bactériologie
- Paillasse d’une salle non climatisée (méningocoque sensible au froid)
- Etuve : +37°C, pendant 30’ min
• Tubes destinés à la Chimie et à la Cytologie
- Réfrigérateur : +4°C
- Délai de conservation : moins de 2 heures sinon lyse des leucocytes

7. Technologie au Laboratoire : Premier jour

7.1- Examen macroscopique du LCR

 il est réalisé par le préleveur et de toute façon refait au laboratoire

 Aspect
o LCR normal :limpide,clair,eau de roche.
o LCR pathologique :trouble,purulent,xanthochromique,hématique ou
hémorragique,ictérique ,etc.

7.2-Examen cytologique du LCR

7.2-1 Cytologie quantitative : le LCR total (non centrifugé)

 Remplir une cellule de comptage (Kova ou Malassez ou Nageotte) à

usage unique et Compter :
o Les leucocytes
- Seuil chez l’adulte :0-5/ml (3-5/mm3)
- Seuil chez le NN :10-30/ml (2-11/mm3)
- Si plus de 10 éléments /mm3 :la formule leucocytaire est établie
après centrifugation et coloration au MGG.

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 o Les hématies :
- Sont comptés dans la cellule de malassez.
 N .B :
- Si le liquide est hémorragigue :lyser les hématies en diluant au ½ le
liquide hémorragique par 0.5 % d’acide acétique.
- Si le nombre de leucocytes ou d’hématies est élevé :diluer au
1/2,1/5,1/10 ou plus ,dans du sérum physiologique et de ne pas oublier de
multiplier le résultat du comptage par la dilution.

7.2-2 cytologie qualitative

 après centrifugation du LCR(1-2 ml de liquide)

 Réaliser un frottis à partir du culot de centrifugation
 colorer le frottis par MGG
 Etablir la formule leucocytaire en pourcentage :
o % des PNN
o % des lymphocytes

7.3-Examen microscopique
7.3-1-coloration de Gram
 Centrifuger 1-2ml de LCR
o Réaliser un frottis à partir du culot de centrifugation
o Colorer le frottis et le lire
o Conserver le surnageant
 Si le volume de LCR est faible, il faut faire le frottis sans le centrifuger

7.3-2- Réaliser un antibiogramme en fonction des données du Gram

7.3-3-Recherches spéciales : sur demande
 Etat frais à l’encre de chine : recherche de la capsule du pneumocoque
 Etat frais à l’encre de chine : recherche de Cryptococcus chez le sidéen

7.4- Recherche d’antigènes solubles dans le LCR

 Travailler sur le surnageant du LCR

 Réaliser une agglutination sur lame : test au latex
 Les germes identifiés par ce test sont :
• Streptococcus agalactiae (groupe B)
• Neisseria meningitidis (A, B, C, Y, W135)
• Escherichia coli sérotype K1
• Haemophilus influenzae sérotype b

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 • Streptococcus pneumoniae
 Difficulté de lecture (variable en fonction du type de Kits):
• Les tests par agglutination de particules de latex
sensibilisées:Communauté antigénique , distinction impossible du
MNO gpeB / E.coli K1 et du MNO Y/ W135 ( voir la technique du
kit pastorex meningitis)

Pastorex méningitis

7.5-Ensemencement du LCR

 Ensemble le LCR total (non centrifigé)

 les milieux permettent la croissance des bactéries exigeantes responsables
de méningites purulentes :
o gélose MH sang cuit (MHSC)
o Gélose MH sang cuit + facteurs de croissance.
 Deux techniques d’ensemencement
o Inonder toute la surface de la gélose avec le LCR

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 o Masser la surface de la gélose avec le LCR grâce à un
écouvillon
− Ces milieux sont observés quotidiennement et incubés à 37°C
sous une atmosphère de 5 à 10 % de CO2 pendant 2 à 5 jours

 Les milieux à ensemencer selon les contextes particuliers on adjoint :

o En cas d’antibiothérapie préalable : un bouillon ou un flacon

d’hémoculture
o En cas de méningite chez un immunodéprimé (SIDA) : une gélose
de Sabouraud sans actidione ;
o En cas de suspicion de tuberculose : un milieu de Löwenstein-
Jensen ou autre milieu spécifique
o Un milieu pour anaérobies incubé à 37°C en anaérobiose peut être
utilisé dans un contexte neurochirurgical.
o Si présence de germe à l’examen direct :faire l’antibiogramme
directement à partrir du LCR en ensemençant une gélose MH .

 N.B : la Culture peut être négative, si :

- Prise d’ATB,
- Délai d'acheminement du Prélèvement trop long incompatible avec la
survie du germe.
- Inoculum bactérien trop faible....

7.6- Examen chimique du LCR

 Doser la protéinorachie < 0,40 g/l. Ne pas la pratiquer si LCR hématique.

 Doser la glycorachie ≥ 60% de la glycémie

7.7- Communiquer au Médecin les résultats préliminaires

 Recherche de germe : coloration de Gram et test au latex

 Cytologie : polynucléaires neutrophiles, lymphocytes …
 Chimie : glycorachie abaissée, protéinorachie augmentée

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 7.8-Caractéristiques du LCR (voir tableau)

 LCR NORMALE
o leucocytes : 3-5/mm3 (2-11/mm3 chez le jeune enfant < 6 semaines
de vie)
o glycorachie : 0,45g/l (2/3 de la glycémie)
o Protéinorachie : 0,10- 0,45g/l
o Clair, limpide, stérile
o Prématuré: jaune ou rosé
o Nné à terme à 1 semaine de vie: incolore ou xanthochromique
 LCR PURULENT
o Inflammation des méninges= perméabilité de la barrière hémato-
encephalique
o Leucocytes :
− plus de 10/mm3
− polynucléaires neutrophiles > 50%
o Chimie :
− glycorachie modifiée <0,40g/l
− protéinorachie est augmentée >0,40g/l (1-5g/l)
 LCR LYMPHOCYTAIRE
o Leucocytes :
− plus de 10/mm3
− lymphocytes >50%
o Chimie :
− glycorachie normale
− protéinorachie >0,40g/l
 LCR PANACHE
o Leucocytes
− Plus de 10 éléments/mm3 ; égalité polynucléaires/
lymphocytes.
o Chimie :
− Protéinorachie et glycorachie normales.
− Ça peut être :
− une listériose, une méningite purulente
− une méningite lymphocytaire au début,
− un abcès cérébral.
 LCR HEMATIQUE
o À cause de la présence du sang :
− cytologie et chimie sont faussées
− il ne faut donc pas les doser

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 o Causes de la présence de sang :
− traumatisme lors ponction lombaire
− hémorragie méningée

TABLEAU 1 : caractéristiques des différents types de méningite

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8. Technologie au Laboratoire : Deuxième jour
8.1- Lecture – Interprétation de la culture

 Culture positive
o Observer l’aspect des colonies.
o Réaliser une coloration de Gram sur le germe isolé.
o Pratiquer les tests de l’oxydase, de la catalase.
o Ensemencer une galerie en fonction des données ci-dessus.
o Antibiogramme :
− Le réaliser s’il n’a pas été fait le premier jour.
− Le lire s’il avait été réalisé le premier jour.
 Culture négative
o Absence de méningite bactérienne.
o Méningite bactérienne décapitée par une antibiothérapie.

9. Validation – Délivrance des résultats

 Critères de Validation
o Données de l’examen macroscopique du LCR.
o Données de la coloration de Gram.
o Données du test au latex.
o Données de la culture.
o Données de la cytologie et la chimie.
 Saisie – Délivrance des résultats

10. Surveillance biologique de l’évolution de la méningite

 Moment de la PL de contrôle : 24 heures après le début du traitement.

 Surveillance bactériologique :
o Culture négative après 24H de traitement : traitement efficace.
o Coloration de Gram peut révéler encore quelques bactéries après
24H de traitement.
 Cytologie et la Chimie :
o Redeviennent normales après 7 à 10 jours de traitement Sont les
éléments clés de la surveillance biologique d’une méningite.

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