LABORATOIRE Procédure de l’examen cytobactériologique des liquides de

MOHAMMED ponction
ZEFZAF DATE D’APPLICATION
REDACTRICE APPROBATRICE

Dr : KHAFALLAL SOUKAINA Dr : BERRA MOUNA 12/10/2020

FONCTION : BIOLOGISTE FONCTION : DIRECTRICE
ASSISTANTE

1. But

 Le but de ce mode opératoire est de décrire les différentes étapes pour la

réalisation d’un examen cytobactériologique d’un liquides de ponction.
2. Etendue

 Ce mode opératoire s’applique à toute demande du liquide de ponction

enregistrée au laboratoire.
3. Responsabilité
 Le technicien responsable de l’unité de microbiologie est tenu de veiller à
la mise en application des dispositions prises dans ce mode opératoire.

4. Documents de références
 Cours de bactériologie du professeur Fafa Cissé : professeur de
microbiologie à l’université Cheikh Anta Diop de Dakar,Sénégal.
 Cours de bactériologie de la quatrième année du diplôme d’étude
spécialisé en biologie clinique, l’université Cheikh Anta Diop de
Dakar,Sénégal.
5. contenu
5.1-précautions
 Les échantillons utilisés dans ce mode opératoire doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et donc traités avec toutes les
précautions liées à cet effet.
5.2- Différents types des liquides de ponction
 liquide de ponction=liquide d’épanchement :il s’agit de la présence
anormale d’un liquide (sérosité,pus,sang).
 selon la localisation on distingue :
• Liquide pleural :plèvre
• Liquide d’ascite :péritoine

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 • Liquide péricardique :péricarde
• Liquide articulaire ou synoviale :articulation
• Liquide de kyste

5.3- Pthogénèse

 peuvent avoir différentes étiologies :se sont

• Soit des transsudats purement mécaniques :cirrhose ,IC,Syndrome
néphrotique,etc.
- Le liquide plasmatique passe entre les deux feuillets de la séreuse
• Soit des exsudats :consécutifs à une infection ou à un cancer
- Le liquide est produit par la membrane elle-même
- C’est eux qui intéressent la bactériologie

6. Recueil du liquide de ponction

6.1-Conditions du recueil

 Avant tout traitement antibiotique

 Asepsie rigoureuse
 Avant la fistulisation spontanée du foyer infectieux
 A tout moment de la journée
 Eviter le contact avec l’air :pour la survie des anaérobies.
 Seringue sans bulle d’air bouchée stérilement et hermétiquement.

6-2-Techniques du recueil

 recueil du liquide de ponction est réservé au clinicien

 associer un prélèvement sur tube avec anticoagulant (comme le citrate de
sodium)pour la cytologie
 le bactériologiste doit demander systématiquement une hémoculture :2
flacons d’hémoculture doivent être ensemencés au lit du malade.

 N.B :
- Les liquides articulaires,pleuraux et péricardiques sont des liquides à traiter
sans délai mais pas de notion d’urgence vitale pour la prise en charge du patient.
- Les liquides d’épanchement sont précieux et parfois difficiles à prélever et
le volume recueilli peut être faible (ponction du liquide articulaire).

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 6-3-Transport-conservation des liquides de ponction

 Transport des échantillons

o Immédiat : délai inférieur à 2 heures, à 20°C
o L’idéal est de prélever le liquide au bloc opératoire
o En sac hermétique
o Eviter l’air si on doit rechercher des bactéries anaérobies
 Conservation du liquide de ponction :
o ne pas conserver (traitement immédiat)

7. Technologie au Laboratoire : Premier jour de l’analyse

7.1-Examen macroscopique du liquide de ponction

 Consistance du liquide de ponction

o Citrin, transparent, fluide
o Trouble, purulent, hémorragique
o Coagulation spontanée ou non
 Aspect :
o Clair
o Trouble
o Purulent
o sérofibrineux
 Couleur du liquide de ponction
o Jaune
o Orange
o rose ,etc
 Viscosité
 Odeur liquide de ponction : fétide (bactéries anaérobies)
 N.B :
- Normalement les liquides d’épanchement sont jaune,citrin et limpide
- La couleur,la limpidité et la viscosité donnent une orientation
diagnostic.
- Le liquide synovial normal :il est pâle ,translucide et très visqueux
• L’opacité du liquide est fonction de sa densité cellulaire
• Un liquide lactescent est en général purulent
• Un liquide floconeux et huileux dénote la présence de cristaux de
cholestérol
- Un liquide sérofibrineux :limpide ou jaune claire et facilement
coagulant :exsudats(tuberculose)ou transsudats.
- Un liquide purulent,trouble :exsudats
- Un liquide hémorragique :la tuberculose est presque toujours impliquée
(ou virale)

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 7-2-Examen microscopique du liquide de ponction
7-2-1-Examen cytologique

 Remplir une cellule de Malassez :

o Compter les hématies et les leucocytes
o Numération impossible si le liquide est coagulé
 Centrifuger le liquide (3000 tours /min pendant 10 min) et sur le culot de
centrifugation réaliser :
o Une coloration de MGG :qui permet d’établir la formule leucocytaire
− % des PNN :altérées ou non altérées
− % des lymphocytes
 N.B :
- Si prédominance des PNN :
• Epanchements inflammatoires,qu’ils soient d’origine infectieuse ou pas
• La présence de PNN altérées :oriente vers une infection bactérienne.
- Prédominance des lymphocytes :
• Plus fréquente dans un liquide clair que dans un liquide purulent
• Une telle formule doit faire penser à une infection tuberculeuse
- PNE supérieures à 10% :
• Liquide articulaire :arthrite parasitaire (filariose)
• Liquide pleural :hémothorax ou pneumothorax.

7.2-2- Examen bactériologique

 Centrifuger le liquide
 Réaliser un frottis à partir du culot de centrifugation
 Pratiquer une coloration de Gram
o Flore normalement monomicrobienne
o Flore polymicrobienne : bactéries anaérobies + aérobies
o Permet d’orienter le choix des milieux de cultures
 Pratiquer une coloration de Ziehl Neelsen :
o La recherche du BK selon la demande du clinicien.

7.2-3-cas particulier des liquides articulaires.

 La recherche de microcristaux dans le liquide articulaire dans l’examen

microscopique ,il s’agit :
o Des cristaux d’acide urique :goutte
o Des cristaux de pyrophosphate de calcium :chondrocalcinose
o Les cristaux de cholestérol
 La recheche de microcristaux permet un diagnostic rapide d’arthropathie
microcristalline(liquide inflammatoire)

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 Si le liquide articulaire est trouble avec plus de 2000 GB :peut être
consécutif à une arthrite septique ou microcristalline d’où l’importance de
la recherche des cristaux.

7.3- Examen chimique du liquide de ponction.

 Réaction de Rivalta :permet de différencier les exsudats des transsudats

 Principe :
o Mettre en évidence la présence de protéines dans un liquide par
précipitation en milieu liquide
o Différencier un liquide riche en protéines(supérieurs à 20 g/l) d’un
liquide pauvre (<20 g/l)
 Technique :
o Dans un bécher :100 ml d’eau distillée ,3 gouttes d’acide acétique,1
goutte de liquide de ponction
o Réaction négative :la goutte se dissout complètement dans la
solution :transsudat
o Réaction positive :la goutte forme un précipité qui ressemble à la
fumée de cigarette :exsudat
 Interprétation :
o Transsudat : taux de protéine < 20g / litre ; cellules < 500 / mm3
o Exsudat : taux de protéine > 20g / litre ; cellules > 500 / mm3

7-4-ensemencement du liquide de ponction

 Milieux à ensemencer systématiquement
o MHSC ou mieux MHSC + FC :pour les bactéries de culture difficiles
o GSN
o EMB
o Bouillon thioglycolate
o MH
o Gélose au sang
♦ Nota bene : incuber les géloses au sang en atmosphère enrichie en 5-10%
de CO2
 Milieux d’appoint :
o gélose de Sabouraud
 Milieux selon les renseignements cliniques :
o LJ :si suspicion de BK(pus amicrobien)
o Bouillon Rosenow ,Schaelder :si recherche d’anaérobies
o BCC :en cas d’hémoculture
o MHSC+FC+VCN :si recherche de gonocoques

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 N.B :
- il est impératif de prélever chez le patient 2 séries d’hémoculture qui
peuvent permettre d’établir l’étiologie bactérienne plus rapidement que la culture
du liquide d’épanchement.
 Conditions de culture
o Milieux solides sont examinés à 24 h et à 48 h
o Les bouillons sont rendus négatifs qu’au-delà du 10 éme jour

8. Technologie au Laboratoire : Deuxième jour de l’analyse

8.1-Lecture de la primoculture – Examens complémentaires

 Observer l’aspect des colonies

 Réaliser une coloration de Gram sur le germe isolé
 Rechercher : oxydase, catalase, filamentation en sérum humain
 Réaliser un antibiogramme

8.2- Interprétation de la primoculture

 Bactérie pathogène spécifique

o Types : Pneumocoque, Haemophilus influenzae, Moraxella, S. aureus,
entérobactéries
o Conduite à tenir : continuer l’analyse
 Autres bactéries – Flore mixte
o Tenir compte des données cliniques
o Tenir compte des données de la bactériologie, de la cytologie et de la
chimie
o Pour le liquide articulaire :un résultat négatif n’exclut pas une
infection :bactéries en faible quantité ,quiexentes ou non cultivables.
o Pour les autres liquides de ponction :la flore est généralement
monomicrobienne
 Dans le cas contraire ,il faut discuter l’identification de toutes les espèces
isolées à une confrontation clinique.

9. Technologie au Laboratoire : Troisième jour de l’analyse

 Lecture – Interprétation des galeries
 Validation des résultats
 Saisie - Délivrance des résultats
10. Bactéries souvent isolées
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sp.
 Neisseria meningitidis

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  Haemophilus influenzae
 Pseudomonas aeruginosa
 Actinomycètes
 Bactéries anaérobies

Tableau 1 : caractéristiques des liquides pleuraux

Composition Aspect macroscopique du liquide

Clair Clair Louche Purulent Hématique

Cellules/mm3 <500 >500 >500 >2000 -

Lymphocytes + +++ ± rares +

Neutrophiles + Rares +++ +++++ +

Germes 0 0 0 +++ + ou 0

Culture - BK + + ± ; BK

Protéine g/l <20 >20 >20 >50 >20

Interprétation Transsudat Exsudat Exsudat Exsudat Exsudat

(Tuberculose) (Pleurésie) (Abcès)

Tableau 2 : caractéristiques des liquides articulaires

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Tableau 3 : caractéristiques des liquides de ponction

Liquide Normal Septique Tuberculose Cirrhose -

Cardiopathie
Aspect Clair Trouble, purulent Séro-fibrineux Jaune, fluide

Coagulation spontanée Non Non Oui Non

Nature liquide Exsudat Exsudat Transsudat

Eléments/mm3 <200 Variable à 500-1000 50-100

incomptable

Neutrophiles % <25% >250% Lymphocytes ++ Rares lympho - çlles

Culture Négative Positive BK Négative

Tableau 4 : principaux germes dans les différents liquides d’épanchements