Examen cytobactériologique du crachats

Réalise par : Hodo Osman Abdi

Hamda Omar Ali
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Plan
• Introduction
• Indications
• Composition du crachat
• Phase pré-analytique
• Phase analytique
• Phase post- analytique

•
Conclusion

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 Introduction
Définition : L’examen cytobactériologique des crachats consiste a examiner les crachats ( expectoration)
d’une personne en cas d’infection broncho-pulmonaire.

Intérêt : L'examen cytobactériologique du crachats permet d’effectuer:

 Une Analyse cytologique (recherche de la cellule)

 Une Analyse bactériologique (recherche de germes)
 une mise en culture
 également de mettre en route un traitement antibiotique adaptés.

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 Indications
Recherche de germes dans le cadre de :
 D’une infection respiratoire
 Suspicion de tuberculose
 Echec de traitement antibiogramme
 Chez les personnes atteintes de mucoviscidose
 Pour mieux cibler le traitement antibiotique chez les
immunodéprimée.

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 Composition du crachat

Le crachat normal est généralement composé de mucus, de salive et

de cellules provenant des voies respiratoires supérieures.
1. Mucus : une sécrétion visqueuse produite par les cellules
épithéliales des voies respiratoires, y compris les glandes muqueuses.
2. Salive.
• 3. Cellules épithéliales : Le crachat peut contenir des cellules
épithéliales des voies respiratoires.
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• 4.Leucocytes : Des globules blancs, tels que les neutrophiles et les
macrophages, peuvent être présents dans le crachat en réponse à
une infection ou à une inflammation des voies respiratoires.
• 5.Micro-organismes ( bactéries commensales ex: streptococcus
pneumoniae).

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 Phase prés analytique

•L’identification du patient (nom ,prénom,

sexe ,âge)
•L’identification de renseignement clinique (
si c’es un suivie pour les sujets tuberculeux)

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Les différents type de prélèvement du crachat.
• Chez les sujet intubé:

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• Expectoration spontanée et induite

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 Les bactéries retrouvé dans le crachat :
• Pseudomonas æruginosa
• Hæmophilus influenzæ
• Moraxella catarrhalis
• Legionella
• Mycobactérium tuberculosis
• Streptococcus pneumoniæ On a choisis ces deux
bactéries

• Etc…
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 Diagnostic direct Phase analytique

Examen macroscopique

Aspect :

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 Examen microscopique
• Diluer à ½ ( 1volume de crachat et 1volume de
carbocysteine( rompt le pont disulfure)
• Vortexer 3 fois ( 10sec chacune).
• Laisser agir 10min à t° ambiante.
Etalement de l’échantillon : prélève quelques
microlitre du crachat diluer , étalée et laisser sécher.

Colorer avec Giemsa : diluée à 1/2

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Rinçage: avec eau tamponner ,sécher encore et
observer

Observation des cellules présent dans le crachats

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 Validation du crachat: observé à objectif ×10
Classe Cellule épithéliales/ champ Leucocytes/ champ Interprétation
1 >25 <10 Contamination
salivaire :rejet de crachat
2 >25 10-25 Contamination
salivaire:rejet de crachat
3 >25 >25 Contamination
salivaire:rejet de crachat
4 10-25 >25 Contamination salivaire:
rejet de crachat
5 <10 >25 Crachat valider

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 Examen bactériologie
• Etat frais : Entre lame et lamelle
• A L’aide d’une pipette en verre prélevez une petite quantité du
crachat
• Dépose une goute de crachat entre lame et lamelle
• On observe au microscope les différents éléments présents
dans le crachat et leurs mouvements.

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Coloration de Gram

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Coloration de Ziehl-Neelsen
• Préparation de échantillon: l’échantillon es étalé en fine couche
une lame propre
• Fixation : L’échantillon sur la lame est fixé en chauffant la lame au
dessus d’une flamme bec bunsen
• Coloration primaire: La coloration primaire , avec la fuchsine acido-
résistante
• Chauffage : La lame de verre est chauffée a l’aide d’une flamme
pour pénétration de la fuchsine
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Rinçage: La lame est soigneusement rincée a l’acide chlorhydrique dilué

Décoloration: La lame de verre est décolorée avec un mélange l’acide-alcool ,

qui éliminé la fuchsine des cellules qui sont pas acido-résistantes

Contre-coloration: La lame de verre est contre-colorée avec une solution de

bleu de méthylène

Séchage et observation : Une fois la contre-coloration terminé , la lame de

verre est soigneusement séchée a l’aire libre d’un échauffement doux; la
lame est observé au microscope a immersion d’huile pour visualiser les
mycobactéries colorées en rouge (acido-résistantes) sur un fond bleu ( non
acido-résistant)
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 Milieu de culture
• Milieu gélose au sang
Ensemencement :
• ouvrez la boîte de Pétri stérile et étalez l'échantillon de crachat
sur la surface du milieu de culture approprié.
• Méthode utilisée : méthode de culture en quadrants, où vous
divisez la surface de la boîte de Pétri en quatre sections et
étalez l'échantillon dans chaque section.

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• Streptococcus pneumoniae
Un aspect de colonie: En cratère car les cellules les
plus vieilles de la colonie, situées à son sommet, sont
détruites, ce qui donne à la colonie
un aspect en cratère
• Gélose au sang
• La gélose au sang + ANC: C’est une gélose au sang
frais rendue sélective des bactéries à Gram positif
en ajoutant deux antibiotiques : l’Acide Nalidixique
et la Colistine.

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• Il est important de noter que la sélection du milieu de culture
dépend de l'information clinique disponible, des symptômes du
patient et de la suspicion d'agent pathogène spécifique.

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• Mycobactérium tuberculosis
Aspect de colonie:
• Sur le milieu de LOEWENSTEIN-JENSEN il donne de colonies de
teinte crème-beige, sèches, à surface rugueuse, en chou-fleur.
• Milieu de Loewenstein Jensen ions minérauxglycérol : source
de carboneasparagine : source d’azote (et aussi de carbone)œufs
entiers : source de nombreux nutriments et de facteurs de
croissancevert de malachite : inhibiteur

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 Automate

• GeneXpert est un outil diagnostique de la

tuberculose rapide, au Mycobactérium tuberculosis
(MT) .
• Principe : Le GeneXpert utilise la technique de PCR (réaction de
polymérisation en chaîne) en temps réel pour amplifier
spécifiquement des régions spécifiques de l'ADN du micro-
organisme cible. La PCR en temps réel permet de détecter la
présence de ces régions de manière très sensible.

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 Galerie API
• Pour le Streptococcus pneumoniae : on utilise API 20 Strep.

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 Phase post-analytique
• Interprétation : Le crachat est poly microbien ,il es dit positive si les colonies sont
supérieurs à 10p7UFC/ml soit 50 colonies

• Rendu des résultats :

Si c’es avec GeneXpert, le résultat est es le lendemain.
Si c’es en culture, le résultat prend 2 à 6 semaines pour le Mycobacterium tuberculosis27
 Nombre de colonies
• Pour déterminer le nombre de colonies formant unités (CFU)
dans un échantillon de crachat, vous devez effectuer une
technique appelée "dilution en série" suivie de
l'ensemencement sur un milieu de culture approprié.

• Voici les étapes générales pour obtenir le nombre de CFU par

millilitre dans un échantillon de crachat :

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• Dilution en série : 1 ml d'échantillon de crachat et le mélanger
avec 9 ml de bouillon physiologique stérile pour obtenir une
dilution de 10^-1 (dilution de 1/10). Répétez ce processus pour
obtenir d'autres dilutions, par exemple 10^-2, 10^-3, 10^-4, etc.
• Ensemencement : À partir de chaque dilution, prélevez un
volume connu (par exemple 0,1 ml) et étalez-le sur la surface
d’un milieu de culture approprié, comme la gélose au sang, en
utilisant la technique d’ensemencement en quadrants .

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• Incubation : Incubez les boîtes de Pétri contenant les échantillons
dilués à la température .
• Comptage des colonies : Après l'incubation, comptez le nombre
de colonies présentes sur chaque boîte de Pétri.
• Calcul : Pour calculer le nombre de CFU/ml dans l’échantillon de
crachat, vous devez multiplier le nombre de colonies comptées
par la dilution inverse correspondante. C’est-à-dire, si vous avez
compté 50 colonies sur une boîte avec une dilution de 10^-3 (0,1
ml ensemencé dans 9,9 ml de bouillon physiologique).
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• le calcul serait :
• Nombre de CFU/ml = (Nombre de colonies comptées) x
(Dilution inverse) Nombre de CFU/ml = 50 colonies x (1/10^-
3) Nombre de CFU/ml = 50 colonies x 1000 Nombre de
CFU/ml = 50 000 CFU/ml

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 Que faire en j1 j2 et j3
Jour 1 : Examen macroscopique : Aspect ( purulent ,muqueux…)
Examen microscopique.
• Examen cytologique : apprécié les cellules présent dans le
crachat.
• Examen bactériologique.
État frais : apprécié la mobilité abondance et les regroupement des
bactéries.
Après coloration : apprécié les bactéries, leurs formes et leurs
couleurs
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• Ensemencé : Sur un milieu sélective GSN, gélose au sang.

• Jour 2: on prelve un peut de colonies pour faire la coloration ,

la galerie API
Jour 3 : Lecture d’antibiogramme, et rendu de résultat .

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 Conclusion
• L’examen cytobactériologique du crachat est un outil précieux
pour diagnostiquer les infections respiratoires.
• Les conclusions de cet examen peuvent varier, allant de la
détection de bactéries pathogènes à l’observation de cellules
anormales.
• Ces résultats guident les médecins dans l’élaboration d’un plan
de traitement approprié pour les patients

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 Cas Clinique. Questions
• Cas clinique :Une femme de 30 ans se • 1: Quelle est la signification
présente à la clinique avec une toux
persistante depuis deux semaines, clinique de l'augmentation du
accompagnée d'expectorations purulentes et nombre de polynucléaires
d'une fièvre légère. Elle ne présente pas neutrophiles dans le crachat ?
d'autres symptômes respiratoires significatifs.
Le médecin décide de réaliser un examen • 2: Quel est le diagnostic
cytobactériologique des crachats pour probable basé sur les
évaluer une possible infection respiratoire.
• Les résultats de l’examen relèvent une
symptômes et les résultats de
augmentation significative de polynucléaires l’examen cytobactériologique
neutrophiles .De plus des colonies de
streptococcus pneumoniae sont identifiées
dans la culture bactérienne.

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 Solution
• 1: La signification clinique de l'augmentation du nombre de
polynucléaires neutrophiles dans le crachat Suggère qu’il ya
une réponse inflammatoire.
• 2: Le diagnostic probable basé sur les symptômes et les
résultats de l’examen cytobactériologique est une pneumonie
Causée par Streptococcus pneumoniae.

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Merci