Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Ecole Supérieure des Sciences des Aliments et des Industries Agroalimentaire

Compte rendu

TP N° 2
Recherche et dénombrement des
Coliformes totaux, Coliformes thermo tolèrent
et E. coli en milieu liquide par méthode NPP.

Module : Microbiologie alimentaire 2.

Année : 1ère année second cycle.

Elaboré par :
Ouadah Iness Aziza
Moali Yasmine
Mimi Meriem
Ouahlima Hassiba

19 / 03 / 2023
 Plan de travail :

I. Introduction :................................................................................................................................................................. 3
II. Matériel et méthode : .................................................................................................................................................... 4
1. Objectif et principe : ................................................................................................................................................. 4
2. Matériel et produits : ................................................................................................................................................ 4
3. Mode opératoire : ...................................................................................................................................................... 5
III. Résultat : ........................................................................................................................................................................ 6
IV. Discussion : .................................................................................................................................................................... 7
V. Conclusion : ................................................................................................................................................................... 8

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 I. Introduction :
La recherche et le dénombrement des coliformes totaux, des coliformes thermotolérants et d'Escherichia coli (E.
coli) dans l'eau potable sont essentiels pour évaluer sa qualité microbiologique et garantir la sécurité sanitaire
des consommateurs.
La méthode de Numération des Plaques en Profondeur (NPP) est une technique couramment utilisée pour ces
analyses, permettant une détection précise et quantitative des microorganismes dans les échantillons liquides.
Ce travail pratique vise à appliquer la méthode NPP pour évaluer la présence et le niveau de contamination
bactérienne dans des échantillons d'eau de robinet, fournissant ainsi des informations cruciales sur leur qualité
microbiologique.

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II. Matériel et méthode :

1. Objectif et principe :

• Objectif :

Ce TP vise à utiliser la méthode de Numération des Plaques en Profondeur (NPP) pour détecter et
compter les coliformes totaux, les coliformes thermotolérants et Escherichia coli (E. coli) dans des
échantillons d'eau de robinet.
L'objectif est d'évaluer la qualité microbiologique de l'eau en fournissant des données quantitatives sur la
contamination bactérienne.

• Principe :

La méthode NPP implique la dilution en série des échantillons dans des milieux de culture spécifiques,
suivie de leur incubation à des températures appropriées pour la croissance des bactéries cibles.
Les coliformes totaux sont détectés sur du vert brillant lactose bile (VBL), les coliformes
thermotolérants sur du bleu de bromothymol lactose (BBL) à 44,5°C, tandis que la présence d'E. coli est
confirmée par des tests biochimiques.
Les résultats sont exprimés en UFC/ml pour évaluer la qualité microbiologique de l'eau.

2. Matériel et produits :

a. Matériel utilisé :

▪ 11 tubes à essai stériles.

▪ Pipettes stériles, pro pipette.
▪ Bec benzène.
▪ Étuve/ incubateur à température contrôlée.

b. Produits utilisés :

▪ Milieu BCPL.
▪ Échantillon : eau du robinet.

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 3. Mode opératoire :

1. Stérilisation du matériel.
2. Étiquetage des tubes en fonction de la concentration.

3. 1 ère journée : Test de présomption :

▪ À partir de l’eau à analyser, prélever :

• 10 ml et la mettre dans un tube contenant le milieu BCPL D.C muni d’une cloche de Durham.
• 5 fois 1 ml et les mettre dans 5 tubes contenant le milieu BCPL D.C muni d’une cloche de Durham.
• 5 fois 0.1 ml et les mettre dans 5 tubes contenant le milieu BCPL S.C muni d’une cloche de Durham.

▪ Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélangé le milieu et
l’inoculum.
▪ Incubation : Elle se fait à 37°C pendant 24 heures.
▪ Lecture : Les tubes qui sont considérés comme positifs sont les tubes qui présentent à la fois :

➢ Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche).

➢ Un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune, témoin de la fermentation du
lactose présent dans le milieu.
➢ La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP de MC Grady.

4. 2ème journée : Test de confirmation (Test de Mac Kenzi) :

• Faire un repiquage avec l’anse de platine des tubes positifs dans un nouveau tube contenant le milieu
Schubert muni d’une cloche de Durham.
• Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélangé le milieu et
l’inoculum.
• Incubation : Elle se fait à 44°C pendant 24 heures.
• Lecture : Les tubes qui sont considérés comme positifs sont les tubes qui présentent à la fois :

➢ Un dégagement gazeux.
➢ Un anneau rouge en surface, témoin de la production d’indole par E. coli après l’ajout de 2 à 3
gouttes du réactif de Kovacs.
➢ La lecture finale se fait également selon les prescriptions de la table du NPP, en tenant compte du
fait que Escherichia coli est à la fois producteur de gaz et d’indole à 44°C.

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 III. Résultat :
Apres 24h d’incubation, on observe que :
• La couleur du milieu reste violette (pas d’acidification du milieu = absence de fermentation de lactose).
• Il n’y a pas un dégagement de gaz dans la cloche.
Ce qui signifie qu’il existe un nombre très réduite = négligeable des coliformes totaux dans notre échantillon
(eau de robinet).
Puisque les résultats du test de présomption (recherche des coliformes totaux) sont négatifs, Il n’est plus
nécessaire de faire le test de confirmation (recherche des coliformes fécaux).

Apres 24h d’incubation

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 IV. Discussion :
Il semble que les recherches menées sur l'eau de Robinet portaient sur l'existence et le dénombrement des
bactéries qui sont indicatrices de matière fécale.
Les résultats sont négatifs, ce qui suggère qu'aucune trace significative ou de ces bactéries n'ont été détecté
dans notre eau.
Cela pourrait indiquer que l'eau est relativement propre et sûre à consommer, du moins en ce qui concerne ces
éléments spécifiques.
Cependant, il est important de noter que d'autres contaminants ou facteurs de qualité de l'eau peuvent également
être pris en compte pour évaluer la sécurité de l'eau de Robinet.

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 V. Conclusion :
Malgré des préoccupations initiales concernant la qualité microbiologique de l'eau de robinet, nos résultats ont
révélé l'absence de coliformes totaux, de coliformes thermotolérants et d'E. coli dans nos échantillons.
Cette conclusion est encourageante quant à la sécurité sanitaire de l'eau potable fournie par le réseau de
distribution.
Cependant, il est impératif de continuer à surveiller régulièrement la qualité microbiologique de l'eau pour
détecter tout changement potentiel qui pourrait compromettre sa salubrité.
En outre, des mesures préventives telles que la désinfection et le contrôle rigoureux du réseau de distribution
doivent être maintenues pour garantir la qualité microbiologique à long terme de l'eau de robinet.