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Nouveaux tests globaux de

l’hémostase:
génération de thrombine,
thromboélastogramme, microparticules

ARL 16/03/06
Nouveaux tests globaux de
l’hémostase
• Mesure de la génération de thrombine dans le
plasma pauvre en plaquettes (PPP) et le plasma
riche en plaquettes (PRP)
• Thromboélastogramme: étudie le sang total
• Mesure des microparticules procoagulantes
dans le sang
Pourquoi des nouveaux tests
en hémostase ?
• Les tests d’exploration de l’hémostase que
nous utilisons ont une performance limitée
et un caractère statique.
• La thrombomoduline et les autres
partenaires du pool vasculaire sont absents
de ces tests.
• Nous avons besoin de tests plus proches de
la réalité physiologique.
La réalité physiologique

K.G. Mann et al. BCMD 2006


Formation du caillot
hémostase primaire
(plaquettes)

hémostase secondaire
(coagulation)

CAILLOT

hémostase tertiaire
(fibrinolyse)
Hémostase primaire
1. Adhésion plaquettaire

2. Activation plaquettaire

3. Agrégation plaquettaire

Sous-endothélium

Lésion de l’endothélium
Hémostase secondaire
Thrombine
Coagulation Fibrinogène Fibrine

Sous-endothélium

Lésion de l’endothélium
Initiation de la coagulation

FX Clou
Facteur tissulaire
plaquettaire
F VIIa
primaire
Prothrombine
F Xa
Fibrinogène
TFPI/FXa Thrombine
Fibrine
Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)

Fibrine liée à la thrombine


Amplification de la coagulation
Complexe tenase
FVIIIa
F IXa FIXa
F VIIIa
Membrane plaquettaire
FX

F Xa F V et F VIII
Activation de plus de plaquettes
Complexe prothrombinase Génération de plus de fibrine
F Xa
F Va Stabilisation du caillot
F XIIIa
Prothrombine Thrombine
Antithrombine F XIII
Voie de la protéine C
activation

VIII inhibition

P A
IXa VIIIa V S P PC
C

X Xa Va

prothrombine thrombine thrombomoduline


Les complexes procoagulants et
anticoagulants vitamine K dépendants et
leurs régulateurs

K.G. Mann et al. BCMD 2006


Cascade de la coagulation
Mesure de la génération de
thrombine
• initialement développé en
1953
• renouveau important car:
automatisation de sa
technique et
informatisation des
résultats
• mime les mécanismes de
coagulation
physiologiques
Thrombogram-Thrombinoscope
Comparaison avec les tests de
coagulation classiques

• Les temps de coagulation:


-temps ou taux de prothrombine, TP
-temps de thromboplastine partielle activée, aPTT
sont utilisés en routine pour pour évaluer la coagulation
de manière globale
• MAIS, ces tests ne mesurent pas la génération de
thrombine, car au moment ou la caillot est formé,
seulement 3% de la prothrombine est activée
La mesure de la génération de
thrombine
• Méthode de base ancienne et établie dans le
domaine de la recherche sur la coagulation,
• décrit toutes les phases du processus de
génération de thrombine
• Thrombogram-Thrombinoscope (Hemker):
méthode automatisée utilisant un substrat
chromogène (usage d’un Fluoroscan de Thermo®)
• CEPENDANT: une standardisation des conditions
pré-analytiques et de la méthode est nécessaire
avant son introduction en routine
La mesure de la génération de
thrombine
• On peut utiliser du PPP et du PRP
• Intérêt dans l’investigation d’une diathèse
hémorragique
• MAIS AUSSI dans les états
hypercoagulables
• Utile aussi pour évaluer les troubles de la
fonction plaquettaire
MAIS les conditions pré-analytiques
doivent être standardisées
Le vide peut créer une activation des plaquettes et une
diminution de la sensibilité à la protéine C activée

Changements visibles
immédiatement après
la prise de sang,
variabilité entre les
donneurs

V. Régnault et al.
Thrombosis Research
2004, 114:539-545
Génération de thrombine après activation de la voie du
facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes

200 Activation du TAFI* en TAFIa


thrombine (nM)

* Thrombine Activatable Fibrinolysis Inhibitor

Ph
L’activation du TAFI en

a se
150 TAFIa rend le caillot plus

on
résistant à sa dissolution

pa ga ti

de
(fibrinolyse).

ne
u tr
100
de pr o

ali
sa
ti o
Phase

PROTHROMBINASE

n
50
TENASE
IXa+VIIIa+ PS
Xa
libre Formation
Formation du
du caillot
caillot
0 VIIa / FT
PREMIÈRES TRACES [activation des plaquettes, du FVIII et du FV
DE THROMBINE
Phase d’initiation

0 10 20
(D ’après C. Hemker et K. Mann) temps (min)
Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004
Génération de thrombine après activation de la voie du
facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes

200 Valeurs normales


Tmax Cmax
Temps de latence 3,5± 1 min
Cmax 200 ± 30 nM
150 Tmax 9 ± 2 min
ETP* 1500 ± 100 nMxmin
thrombine (nM)

100 Endogenous Thrombin Potential: « Man


hours» of thrombin activity (Hemker
ETP 1993)
50
Temps de
latence

+ FT (5 pM)
Temps correspondant aux TP ou aPTT

0 10 20
(D ’après C. Hemker et K. Mann) temps (min) Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004
Déficits en facteurs de la coagulation, déficits plaquettaires
Pourquoi des hémorragies ?

200
N

Ph
150

on

a se
p agati
thrombine (nM)

de
s ta
de pr o

100

bi l
isa
ti o
P ha se

n
50
hémophiles
caillot N.
def. plaquettaires
initiation
0
caillot lâche
(déficits)
FT (10-
(10-25pM)

0 10 temps (min) 20
Effet des contraceptifs oraux
sur la génération de thrombine

K.G. Mann et al. BCMD 2006


Influence d’un inhibiteur du facteur
Xa sur la génération de thrombine

K.G. Mann et al. BCMD 2006


Phénotype d’un déficit constitutionnel en
antithrombine
CONTROL Déficit en antithrombine

V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545


Phénotype d’un déficit constitutionnel
en protéine C
CONTROL Déficit en protéine C
Thromboéleastogramme
(Haemoscope®)
Thromboélastogramme (1)
• Développé en 1948
• Utilisé comme outil de recherche depuis
• Plus récemment: guide pour décider de
l’administration des transfusions durant la
transplantation hépatique et la chirurgie
cardiaque
Thromboélastogramme (2)
• donne une impression globale de la coagulation,
• nous fournit des données sur le caillot après le
début de la formation de fibrine,
• reflète l’interaction entre les plaquettes, la
cascade de la coagulation et la fibrinolyse,
• mesure aussi la fermeté du caillot,
• TEG standard et TEG modifié par une héparinase
(inactive l’héparine).
Thromboéleastogramme
Mesure des microparticules
procoagulantes dans le sang
Que sont les microparticules du sang ?

• Observées pour la première fois dans le sang en


1967 par P. Wolf : « poussière de plaquettes »
• 1988-1991: génération des microparticules
durant l’activation plaquettaire (P.S. Sims et S.J.
Shattil)
• Ces microparticules plaquettaires sont
procoagulantes: lient le facteur Va et
soutiennent l’activité prothrombinase ainsi que la
liaison du facteur VIII
Depuis, des centaines d’études ont été
publiées sur les microparticules du sang…

• La plupart du temps, les microparticules sont


mesurées par cytométrie de flux
• Même si la plupart des microparticules sont issues
des plaquettes sanguines, certaines dérivent des
cellules endothéliales, des leucocytes, des cellules
musculaires lisses ou des érythrocytes, par exemple
• Leur distribution et leur nombre peut varier dans le
sang en fonction des conditions physiologiques et
pathologiques
Les microparticules procoagulantes
• Dérivées des plaquettes, des cellules
endothéliales et des leucocytes
• Les microparticules plaquettaires riches en
phosphatidylsérine fournissent une surface
procoagulante pour la génération de thrombine
• Les microparticules endothéliales pourraient être
associées à certains états hypercoagulables
• Peuvent aussi être issues des cellules tumorales
Facteur tissulaire circulant (contenu
dans les microparticules)

N. Mackman, BCMD 2006


Définition d’une microparticule du
sang et limite des méthodes de
mesure habituelles
• diamètre < 1 µm (200-800 nm)
• vu sa taille, elle se confond avec le bruit de fond
électronique lorsqu’elle est comptée par
cytométrie de flux
• La cytométrie de flux par la méthode du « light
scattering » ne peut pas déterminer la taille
d’une particule quand la taille de cette particule
est du même ordre de grandeur que la longueur
d’onde du laser utilisé (488 nm)
Mesure des microparticules sanguines
dans le cancer avancé: cytométrie de
flux avec impédance
• Cytomètre de flux: NPE Systems Quanta
• Utilise l’impédance pour mesurer la taille de la
microparticule
• Marquage des particules avec un anticorps anti-
facteur tissulaire, de façon à quantifier les
microparticules procoagulantes
• Échantillons de plasma de sujets normaux et de
patients avec un cancer de stade avancé.
Etude préliminaire
• Microparticules positives pour le facteur
tissulaire: présentes dans 1/3 patients avec un
cancer avancé
• Nombre: 11’000 – 1’600’000 particules par
microlitre
• Taille: 332 - 501 nm
• Rôle probable de ces microparticules dans les
complications thromboemboliques du cancer

B. Furie et al., BCMD 2006