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Nouveaux tests globaux de l’hémostase:

génération de thrombine, thromboélastogramme, microparticules

ARL 16/03/06

Nouveaux tests globaux de l’hémostase

• Mesure de la génération de thrombine dans le plasma pauvre en plaquettes (PPP) et le plasma riche en plaquettes (PRP)

• Thromboélastogramme: étudie le sang total

• Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang

Pourquoi des nouveaux tests en hémostase ?

• Les tests d’exploration de l’hémostase que nous utilisons ont une performance limitée et un caractère statique.

• La thrombomoduline et les autres partenaires du pool vasculaire sont absents de ces tests.

• Nous avons besoin de tests plus proches de la réalité physiologique.

La réalité physiologique

La réalité physiologique K.G. Mann et al. BCMD 2006

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Formation du caillot

hémostase primaire (plaquettes)

Formation du caillot hémostase primaire (plaquettes) hémostase secondaire (coagulation) CAILLOT hémostase tertiaire

hémostase secondaire (coagulation)

du caillot hémostase primaire (plaquettes) hémostase secondaire (coagulation) CAILLOT hémostase tertiaire (fibrinolyse)

CAILLOT

hémostase tertiaire (fibrinolyse)

HémHémoossttaassee ppririmmaaireire

1. Adhésion plaquettaire

2. Activation plaquettaire

3. Agrégation plaquettaire

plaquettaire 2. Activation plaquettaire 3. Agrégation plaquettaire Lésion de l’endothélium Sous-endothélium
plaquettaire 2. Activation plaquettaire 3. Agrégation plaquettaire Lésion de l’endothélium Sous-endothélium
plaquettaire 2. Activation plaquettaire 3. Agrégation plaquettaire Lésion de l’endothélium Sous-endothélium
plaquettaire 2. Activation plaquettaire 3. Agrégation plaquettaire Lésion de l’endothélium Sous-endothélium

Lésion de l’endothélium

Sous-endothélium

HémHémoossttaassee sseeccoonnddaaireire

Coagulation

Thrombine

Fibrinogène

c o o n n d d a a ire ire Coagulation Thrombine Fibrinogène F i

Fibrine

o n n d d a a ire ire Coagulation Thrombine Fibrinogène F i b r
o n n d d a a ire ire Coagulation Thrombine Fibrinogène F i b r
o n n d d a a ire ire Coagulation Thrombine Fibrinogène F i b r
o n n d d a a ire ire Coagulation Thrombine Fibrinogène F i b r

Lésion de l’endothélium

Sous-endothélium

IInniittiiatatiioonn ddee llaa ccoagoaguullatatiionon

Facteur tissulaire F VIIa
Facteur tissulaire
F VIIa

F X

oag u u l l at at i i on on Facteur tissulaire F VIIa F
oag u u l l at at i i on on Facteur tissulaire F VIIa F

F Xa

Prothrombine

i i on on Facteur tissulaire F VIIa F X F Xa Prothrombine Tissue Factor Pathway

Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)

Clou

plaquettaire

primaire

Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) Clou plaquettaire primaire Fibrinogène Fibrine Fibrine liée à la thrombine
Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) Clou plaquettaire primaire Fibrinogène Fibrine Fibrine liée à la thrombine

Fibrinogène

Fibrine

Fibrine liée à la thrombine

TFPI/FXa

Thrombine

TFPI/FXa Thrombine
TFPI/FXa Thrombine

AAmmpplliiffiiccaatitioonn ddee llaa ccooaagulgulaattionion

Complexe tenase

F IXa F VIIIa
F IXa
F VIIIa
FIXa
FIXa

FVIIIa

a a t t ion ion Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa F X
a a t t ion ion Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa F X

F X

a t t ion ion Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa F X F

F Xa

ion ion Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa F X F Xa Membrane plaquettaire
ion ion Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa F X F Xa Membrane plaquettaire

Membrane plaquettaire

F V et F VIII Activation de plus de plaquettes Génération de plus de fibrine

Stabilisation du caillot

F XIIIa

de plus de fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa

F XIII

de plus de fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa
de plus de fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa
de plus de fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa

Thrombine

Complexe prothrombinase

F Xa F Va
F
Xa
F
Va
fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa F Va Prothrombine

Prothrombine

fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa F Va Prothrombine
fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa F XIII Thrombine Complexe prothrombinase F Xa F Va Prothrombine

Antithrombine

VIII X Xa prothrombine Va P A P C thrombine activation inhibition PC thrombomoduline Voie

VIII

X

Xa

prothrombine

Va

P

A

P

C

thrombine
thrombine
VIII X Xa prothrombine Va P A P C thrombine activation inhibition PC thrombomoduline Voie de
VIII X Xa prothrombine Va P A P C thrombine activation inhibition PC thrombomoduline Voie de
VIII X Xa prothrombine Va P A P C thrombine activation inhibition PC thrombomoduline Voie de
VIII X Xa prothrombine Va P A P C thrombine activation inhibition PC thrombomoduline Voie de
VIII X Xa prothrombine Va P A P C thrombine activation inhibition PC thrombomoduline Voie de

activation

inhibition

activation inhibition
activation inhibition
PC thrombomoduline
PC
PC

thrombomoduline

Voie de la protéine C

IXa

VIIIa

V

S

Les complexes procoagulants et anticoagulants vitamine K dépendants et leurs régulateurs

Les complexes procoagulants et anticoagulants vitamine K dépendants et leurs régulateurs K.G. Mann et al. BCMD

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Cascade de la coagulation

Cascade de la coagulation

Mesure de la génération de thrombine

• initialement développé en

1953

• renouveau important car:

automatisation de sa technique et informatisation des résultats

• mime les mécanismes de coagulation physiologiques

et informatisation des résultats • mime les mécanismes de coagulation physiologiques Thrombogram-Thrombinoscope

Thrombogram-Thrombinoscope

Comparaison avec les tests de coagulation classiques

• Les temps de coagulation:

-temps ou taux de prothrombine, TP -temps de thromboplastine partielle activée, aPTT sont utilisés en routine pour pour évaluer la coagulation de manière globale

• MAIS, ces tests ne mesurent pas la génération de thrombine, car au moment ou la caillot est formé, seulement 3% de la prothrombine est activée

La mesure de la génération de thrombine

• Méthode de base ancienne et établie dans le domaine de la recherche sur la coagulation,

• décrit toutes les phases du processus de génération de thrombine • Thrombogram-Thrombinoscope (Hemker):

méthode automatisée utilisant un substrat chromogène (usage d’un Fluoroscan de Thermo®)

• CEPENDANT: une standardisation des conditions pré-analytiques et de la méthode est nécessaire avant son introduction en routine

La mesure de la génération de thrombine

• On peut utiliser du PPP et du PRP

• Intérêt dans l’investigation d’une diathèse hémorragique • MAIS AUSSI dans les états hypercoagulables

• Utile aussi pour évaluer les troubles de la fonction plaquettaire

MAIS les conditions pré-analytiques doivent être standardisées

Le vide peut créer une activation des plaquettes et une diminution de la sensibilité à la protéine C activée

une diminution de la sensibilité à la protéine C activée Changements visibles immédiatement après la prise

Changements visibles immédiatement après la prise de sang, variabilité entre les donneurs

V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545

thrombine (nM)

Génération de thrombine après activation de la voie du facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes

200

150

100

50

0

Activation du TAFI* en TAFIa

Xa PPhhaassee ddee pprrooppaaggaattiioonn
Xa
PPhhaassee ddee pprrooppaaggaattiioonn

* Thrombine Activatable Fibrinolysis Inhibitor

PPhhaassee ddee nneeuuttrraalliissaattiioonn L’activation du TAFI en TAFIa rend le caillot plus résistant à sa
PPhhaassee ddee nneeuuttrraalliissaattiioonn
L’activation du TAFI en
TAFIa rend le caillot plus
résistant à sa dissolution
(fibrinolyse).
PROTHROMBINASE TENASE IXa+VIIIa+ PS
PROTHROMBINASE
TENASE
IXa+VIIIa+ PS
lliibbrere Formation Formation du du caillot caillot VIIa / FTFT PREMIÈRES TRACES DE THROMBINE
lliibbrere
Formation Formation du du caillot caillot
VIIa
/ FTFT
PREMIÈRES TRACES
DE THROMBINE
[[aacctitivavattiioonn ddeess ppllaaqquueetttteess,, dduu FFVVIIIIII eett dduu FVFV

PPhhaassee ddiinniittiiatatiionon

00 1010 2020
00
1010
2020

(D ’après C. Hemker et K. Mann)

tteemmpsps ((mmiin)n)

Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004

thrombine (nM ) 200 150 100 50 0 Génération de thrombine après activation de la

thrombine (nM)

200

150

100

50

0

thrombine (nM ) 200 150 100 50 0 Génération de thrombine après activation de la voie

Génération de thrombine après activation de la voie du facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes

Valeurs normales

3,5± 1 min 200 ± 30 nM 9 ± 2 min 1500 ± 100 nMxmin

Tmax

Cmax

Temps de latence Cmax Tmax ETP* ETP 1993) Temps de latence
Temps de latence
Cmax
Tmax
ETP*
ETP
1993)
Temps de
latence
de latence Cmax Tmax ETP* ETP 1993) Temps de latence Temps correspondant aux TP ou aPTT

Temps correspondant aux TP ou aPTT

Endogenous Thrombin Potential: « Man hours» of thrombin activity (Hemker

TP ou aPTT Endogenous Thrombin Potential: « Man hours» of thrombin activity (Hemker + + F

++ FFTT ((55 ppM)M)

0 0 10 10 t t e e m m ps ps ( ( m

00

1010

tteemmpsps ((mmiin)n)

2020

Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004

(D ’après C. Hemker et K. Mann)

Déficits en facteurs de la coagulation, déficits plaquettaires Pourquoi des hémorragies ?

PPhhaassee ddee ssttaabbiilliissaattiioonn 200 NN 150 100 50 caillot N. iinniittiiatatiionon hémophiles def.
PPhhaassee ddee ssttaabbiilliissaattiioonn
200
NN
150
100
50
caillot N.
iinniittiiatatiionon
hémophiles
def. plaquettaires
0
caillot lâche
(déficits)
FFTT ((1010--2255ppM)M)
thrombine (nM)
PPhhaassee ddee pprrooppaaggaattiioonn
00 1010 tteemmpsps ((mmiin)n) 2020
00
1010
tteemmpsps ((mmiin)n)
2020

Effet des contraceptifs oraux sur la génération de thrombine

Effet des contraceptifs oraux sur la génération de thrombine K.G. Mann et al. BCMD 2006

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Influence d’un inhibiteur du facteur Xa sur la génération de thrombine

Influence d’un inhibiteur du facteur Xa sur la génération de thrombine K.G. Mann et al. BCMD

K.G. Mann et al. BCMD 2006

Phénotype d’un déficit constitutionnel en antithrombine

CONTROL

Déficit en antithrombine

en antithrombine CONTROL Déficit en antithrombine V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545

V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545

Phénotype d’un déficit constitutionnel en protéine C

CONTROL

Déficit en protéine C

Phénotype d’un déficit constitutionnel en protéine C CONTROL Déficit en protéine C

Thromboéleastogramme

(Haemoscope®)

Thromboéleastogramme (Haemoscope®)

Thromboélastogramme (1)

• Développé en 1948

• Utilisé comme outil de recherche depuis

Plus récemment: guide pour décider de l’administration des transfusions durant la transplantation hépatique et la chirurgie cardiaque

Thromboélastogramme (2)

• donne une impression globale de la coagulation,

• nous fournit des données sur le caillot après le début de la formation de fibrine,

• reflète l’interaction entre les plaquettes, la cascade de la coagulation et la fibrinolyse,

• mesure aussi la fermeté du caillot,

• TEG standard et TEG modifié par une héparinase (inactive l’héparine).

Thromboéleastogramme

Thromboéleastogramme

Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang

Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang

Que sont les microparticules du sang ?

• Observées pour la première fois dans le sang en 1967 par P. Wolf : « poussière de plaquettes »

• 1988-1991: génération des microparticules durant l’activation plaquettaire (P.S. Sims et S.J. Shattil)

• Ces microparticules plaquettaires sont procoagulantes: lient le facteur Va et soutiennent l’activité prothrombinase ainsi que la liaison du facteur VIII

Depuis, des centaines d’études ont été publiées sur les microparticules du sang…

• La plupart du temps, les microparticules sont mesurées par cytométrie de flux

• Même si la plupart des microparticules sont issues des plaquettes sanguines, certaines dérivent des cellules endothéliales, des leucocytes, des cellules musculaires lisses ou des érythrocytes, par exemple

• Leur distribution et leur nombre peut varier dans le sang en fonction des conditions physiologiques et pathologiques

Les microparticules procoagulantes

• Dérivées des plaquettes, des cellules endothéliales et des leucocytes

• Les microparticules plaquettaires riches en phosphatidylsérine fournissent une surface procoagulante pour la génération de thrombine

• Les microparticules endothéliales pourraient être associées à certains états hypercoagulables

• Peuvent aussi être issues des cellules tumorales

Facteur tissulaire circulant (contenu dans les microparticules)

Facteur tissulaire circulant (contenu dans les microparticules) N. Mackman, BCMD 2006

N. Mackman, BCMD 2006

Définition d’une microparticule du sang et limite des méthodes de mesure habituelles

• diamètre < 1 mm (200-800 nm)

• vu sa taille, elle se confond avec le bruit de fond électronique lorsqu’elle est comptée par cytométrie de flux

• La cytométrie de flux par la méthode du « light scattering » ne peut pas déterminer la taille d’une particule quand la taille de cette particule est du même ordre de grandeur que la longueur d’onde du laser utilisé (488 nm)

Mesure des microparticules sanguines dans le cancer avancé: cytométrie de flux avec impédance

• Cytomètre de flux: NPE Systems Quanta

• Utilise l’impédance pour mesurer la taille de la microparticule

• Marquage des particules avec un anticorps anti- facteur tissulaire, de façon à quantifier les microparticules procoagulantes

• Échantillons de plasma de sujets normaux et de patients avec un cancer de stade avancé.

Etude préliminaire

• Microparticules positives pour le facteur tissulaire: présentes dans 1/3 patients avec un cancer avancé

• Nombre: 11’000 – 1’600’000 particules par microlitre

• Taille: 332 - 501 nm

• Rôle probable de ces microparticules dans les complications thromboemboliques du cancer

B. Furie et al., BCMD 2006