Techniques d’étude

en hémostase

Dr Thibaut OCKO
 Plan

 Introduction
 Techniques d’Hémostase primaire

- Principes
- Techniques
 Techniques de coagulation

- Principes
-Techniques
 Conclusion
 Introduction
 Hémostase
- mécanismes physiologiques qui limitent la
déperdition sanguine en cas de brèche vasculaire,
tout en préservant la fluidité sanguine
circulatoire.

- Equilibre subtil:
 Déficit: maladies hémorragiques
 Excès: thromboses
 Introduction
 Hémostase
Tests fonction de différentes phases:
- Hémostase primaire

-Hémostase secondaire (coagulation)

- Fibrinolyse
Hémostase primaire

 Temps de saignement
 Différentes méthodes
• Ivy-trois points, Ivy-incision,…
• Avant bras
• Contre pression veineuse 40 mm Hg
• Manque de sensibilité et de spécificité
 PFA-100

 Test en conditions de flux

Prend en compte les forces de cisaillement
(phénomène majeur pour activation
plaquettaire)

 Temps d’occlusion de la cartouche-filtre par plaquettes du

sang total anticoagulé envoyé à travers la cartouche

Dépend du nombre de plaquettes et de

Ne pas faire si l’hématocrite
– Hématocrite <30 % ou > 50 %
– Plaquettes <100 G/L
 PFA-100

Cartouches-filtre:
Collagène + un agoniste
(ADP ou adrénaline)

Détecte:
Les maladies plaquettaires
majeures,
Le déficit en facteur
Dispositif PFA100® Willebrand
 PFA-100
Brèche vasculaire
Microcirculation PFA 100

Dépiste la quasi-totalité des maladies de Willebrand

Moins sensible aux anomalies fonctionnelles
plaquettaires
 Hémostase primaire
 Fonctions procoagulantes plaquettaires

 Consommation de la prothrombine (F II)

• Coagulation du sang total
• Dosage du facteur II sérique résiduel
• Normal: < 15%
• Si pas de coagulopathie et si > 15%: déficit
 Etude de l’exposition plaquettaire membranaire
des PL électronégatifs
• Cytométrie de flux
• Stimulation par agoniste; génération de microparticules
• Marquage par l’annexine V fluorescente
 Etude de l’agrégation
plaquettaire
 Principe:
 Mesure de la transmission de
la lumière
 PRP (Plasma Riche en
Plaquettes)
 Sang total +
+ agoniste

 On ajoute inducteur qui nous

intéresse + aimant (agitation
pour permettre interactions
entre les plq)
Agrégation plaquettaire

Obtention du PRP

Plasma
citraté Riche
en
Plaquettes
PRP
Culot
contenant
GB et GR

Centrifugation
lente
 Hémostase primaire
 Agrégation plaquettaire
 Plasma riche en plaquettes prélevé sur citrate
• Injection d’un agoniste
• ADP, collagène, AA, ristocétine, adrénaline,…
• Enregistrement des variations de transmission
lumineuse à travers l’échantillon
• Phase initiale paradoxale de diminution de transmission
• Changement de forme plaquettaire
• Puis augmentation de transmission
• Création des agrégats plaquettaires
• Réversibilité ?
Hémostase primaire
Hémostase primaire

Agrégation
irréversible
(boucle de renforcement
TXA2-dépendante)

Agrégation
réversible

Changement
de forme
initial
 Hémostase primaire
 Protéines adhésives circulantes
 Fibrinogène
 Facteur Willebrand VWF
• Présence physique: utilisation Ac; donc antigène
• VWF:Ag (ELISA,…)
• Fonctionnel:
• Cofacteur de la ristocétine
• VWF:Rco
• Liaison au collagène
• VWF:CB
• Transport du FVIII, facteur anti-hémophilique A
• VWF:FVIIIB
 Coagulation

Étape pré-analytique

Recommandations du GEHT:
http://site.geht.org/site/Pratiques-Professionnelles/Documents-GEHT/Variables-
Preanalytiques/Recommandations-Variables-preanalytiques_69_722.html
 Coagulation
Le prélèvement
 Patient au repos depuis 5 min (recommandé)

 Ponction veineuse franche

 Garrot peu serré (éviter stase, fragments pro-coagulants et

activation plaquettaire)

 Tube de purge (2ml) ou tube sec sans activateur

 Site de prélèvement éloigné de toute perfusion

 Prélèvements sur KT autorisés (pas de rinçage à l’héparine,

pas de transfusion de produits sanguins par cette voie)
 Coagulation
Le tube de prélèvement
 Tube stérile sous vide en verre siliconé ou PET (Polyethylene
Terephthalate ) étanche

 Anticoagulant = citrate trisodique 0.109M (3.2%)

 1 volume d’anticoagulant pour 9 volumes de sang (sauf si Hte

<30% ou >55%, cf ajustement du volume de d’AC)

 Remplissage > 90% (minimum 80%)

 Tube CTAD: pour activité anti-Xa

 Tube parfaitement identifié (Nom- Prénom-Date de naissance-Nom et
qualité du préleveur)
 Coagulation
L’acheminement et la conservation

 En 1 à 2h à température ambiante, max 4h (6h pour un TP), si

délai supérieur centrifuger, décanter et congeler.

 Centrifugation du tube : 10 min à 3500 tours/min → PPP

(plasma pauvre en plaquettes)

 Aspect du plasma: hémolyse → raccourcit le TCA; lactescent

→ pb pour lecture optique

 Congélation possible du PPP après double centrifugation (-

80°C – 6 mois) / décongélation rapide au bain-marie à 37°

 Décongélation rapide au bain marie à 37°C

Coagulation

Étape analytique
 Coagulation
 Principes des Tests chronométriques
 vitesse de formation du caillot, in vitro, après ajout d’inducteurs

 Sont utilisés pour les tests globaux et les taux de facteurs

 2 types de détection du caillot:

• Détection photo-optique de la formation de fibrine : variation de la

densité optique d’une source lumineuse au cours de la formation du
caillot Attention: interférence avec Hb, bilirubine, et plasma lactescent

• Détection électromagnétique: arrêt de rotation d’une bille d’acier

placée dans le mélange PPP/ réactif
 Coagulation
 Principes des Tests chromogéniques
 Utilisent des oligopeptides dont la nature est spécifique d’un enzyme donné et porteurs
d’un groupement paranitoaniline, qui lorsqu’il est scindé par l’enzyme donne au milieu une
coloration jaune

 L’activité de l’enzyme est donc proportionnelle à la vitesse d’apparition de la coloration

 mesure de l’absorbance de la lumière par la solution colorée

 Tests fonctionnels utilisés pour l’AT, l’activité anti-Xa

oligopeptide PNA
+ Enzyme oligopeptide PNA
 Coagulation
 Principes des Tests immunologiques
 Tests ELISA - billes de latex recouvertes d’Ac – détection
turbidimétrique de la formation de complexe Ag-Ac

 Dosages quantitatifs

 D-Dimères Vidas; DDi Latex

 Coagulation
 Contrôle de qualité interne:
 Éviter les dérives de l’analyse (reproductibilité)

 Permet d’encadrer nos séries d’analyses

 Pour chaque technique il doit concerner 2 à 3 niveaux de valeur: 1 dans la

zone de normalité; 2 dans les zones pathologiques

 Un mauvais résultat
• Arrêt de rendu des résultats tant que pb non résolu
• Repassage du contrôle si toujours mauvais: procédure correctrice
• Changement de réactifs et/ou de solution de contrôle
• Recalibration et repassage du contrôle
• Repassage des bilans entre le dernier résultat de contrôle correct et le mauvais résultat
pour vérifier les résultats rendus ou signalement pour nouveau contrôle
 Coagulation
 Contrôles de qualité externes
 Analyse d’un même échantillon par plusieurs laboratoires

 Comparaison inter laboratoires au niveau national ou

international, au sein d’un même groupe de couple
automate/réactif

 Obligatoire au niveau national pour les analyses de

routine

 Evaluent l’exactitude du rendu du laboratoire par rapport

à celle des autres
Coagulation

Les tests Chronométrique

 1. Le taux de prothrombine (TP) –Temps de Quick (TQ)

Facteur Tissulaire
VIIa
Facteurs explorés:
PL
Ca2+

X Xa
PL
Ca2+
Va
II IIa

Fibrinogène Fibrine
 Définition: Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un
plasma déplaquetté, décalcifié, en présence de FT, PL et
Ca2+

Thromboplastine tissulaire calcique

préchauffée à 37°C 100µl
Stop Chrono

Déclenchement
Chronomètre
Plasma Ca2+ TQ
50µl Préchauffage Caillot
2 min 37°c Fibrine

Réactif :
RecombiPlasTin : facteur tissulaire humain recombinant relipidé avec des
PL synthétiques + CaCl2 + polybrène (inh. d’héparine)
 Expression des résultats Temps de Quick : N = 11-13 sec
Expression TQ en % Taux de Prothrombine (TP):
besoin étalonnage Droite de Thivolle

TQ
sec

%TP
100 50 25

TP Pathologique si < 70% = TQ allongé

Expression TQ en INR (International Normalized Ratio) : réservé aux
surveillances de patients traités aux AntiVitamines K

INR= (
TQ Patient ISI
TQ Témoin )
 2. Temps de céphaline + activateur (TCA)

F XII - KHPM
kallicréine

F XII a
prékallicréaine
F XI F XI a
PL
Ca2+ F IX a
FIX
FVIII
X Xa
F Va PL
Ca2+

IIa II

Fibrinogène Fibrine
 Définition: Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un
plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’activateur des
facteurs « contacts », de PL et de Ca2+

CaCl2 préchauffé à 37°C 50µl

Stop Chrono
Activateur Déclenchement
50µl Chronomètre
Plasma TCA
Préchauffage
50µl Caillot
3 min 37°c
Fibrine

Réactif:
APTT IL : réactif contenant un substitut plaquettaire (céphaline) extrait de
tissu cérébral de lapin et un activateur particulaire (silice) en milieu
tamponné
 Expression des résultats

N = TCA patient / TCA témoin ≤ 1.2

Valeurs normales établies par chaque laboratoire à partir d’au moins 30

plasmas frais de sujets sains.

Zone thérapeutique du traitement curatif par héparine non fractionnée

(HNF)
► ratios compris entre 1.5 et 3
 3. Le Fibrinogène

 Méthode de Clauss:

 Réactif = Fibriquick (Trinitry, France) contenant sous forme lyophilisée de la

thrombine bovine (environ 100 unités NIH/ml) des stabilisants et un tampon
(Owren Koller)

 Test: longueur d’onde = 405nm, échantillons pré-dilués dans l’Owren

Koller

 3 configurations:
• clauss bas (dilution au 1/5) linéarité de 0.5 à 30g/l de
• clauss dit normal (1/10) fibrinogène
• clauss haut (1/30 voire 1/60)
 Fibriquik préchauffé à
37°C 50µl
Stop Chrono

Déclenchement
Chronomètre
Plasma Fg
100µl Préchauffage Caillot
Dilué au 1/10 2 min 37°c Fibrine
dans O-K

Taux de fibriniogène exprimé en g/L : valeur logarithmique du temps de

coagulation est inversement proportionnelle à la valeur logarithmique de la
concentration en fibrinogène actif
 3. Le Fibrinogène

 Fibrinogène dérivé:
Cinétique de formation du caillot activé par une thromboplastine
tissulaire dépendante du taux de fibrinogène dans le plasma
50µl d’échantillon et 100µl de PT Recombiplastin
Quel test faire ?

Tous les patients sont dosés avec le fibrinogène dérivé.

Si le taux de fibrinogène dérivé est ≤ 4,0 g/l, le fibrinogène est dosé par
la méthode du Clauss pour ne pas méconnaitre d’éventuelles
dysfibrinogénémies
 4. Le temps de thrombine

Temps de coagulation d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence

d’une quantité standardisée de thrombine diluée et de Ca2+
Thrombine calcique
préchauffée à 37°C
Stop Chrono
50µl

Déclenchement
Chronomètre
Plasma TT
100µl Préchauffage Caillot
2 min 37°c Fibrine

 Réactif
STA Thrombin : Thrombine lyophilisée d’origine humaine
 4. Le temps de thrombine
 Interprétation:
 Explore la fibrinoformation / N’explore pas le facteur XIII

 Sensible:
 aux taux de Fg (bas ou élevé)
 aux anomalies fonctionnelles du Fg (dysfibrinogénémies acquises ou
constitutionnelles)
 à la présence d’un inhibiteur de la thrombine: héparine, hirudine, produits
de dégradation de la fibrine ou du fibrinogène, Ig monoclonales et Ac
dirigés contre la thrombine

 Normales: 13-19 s
 5. Dosage des facteurs de la
voie exogène
 Principe
 Mesure, en présence de RecombiPlasTin, le temps de
coagulation d’un système où tous les facteurs sont présents,
constants et en excès à l’exception du facteur à doser
apporté par l’échantillon testé

 Réactif
 STA déficient II, V (VII ou X) = Plasma humain
artificiellement dépourvu du facteur à doser

 Plasma du patient dilué

 Thromboplastine tissulaire calcique
préchauffée à 37°C 100µl
Stop Chrono
Plasma
déficitaire Déclenchement
en V 50µl Chronomètre
Temps de
Préchauffage coagulation
Dilution Caillot
2 min 37°c Fibrine
Plasma
Patient 50µl Temps de
coagulation
en sec. Etalonnage

N: 70-130%
15 45 95 FV en %
 6. Le TCK

 Principe
 Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma
déplaquetté, décalcifié, en présence de céphaline
(substitut plaquettaire) et de kaolin (activation
standardisée du facteur XII)
 Explore donc les facteurs: (XII), XI, IX, VIII, X, V, II et I
 Barreaux aimantés +++ : homogénéisation du réactif

 Valeurs normales: TCK patient / TCK témoin < 1.2

 Automate
Détection du caillot par 2 systèmes:
 Système électromagnétique
-bille métallique placée dans une cupule réactionnelle
est positionnée dans un champ électromagnétique

-modification de ce positionnement induite par la

solidification du milieu lors de la coagulation
déclenche l’arrêt du chronomètre
 Automate
Détection du caillot par 2 systèmes:
 Système optique
- Utilisation d’une source lumineuse
monochromatique et d’un photodétecteur

- Formation du caillot se traduit par la diminution de

la lumière transmise au niveau du détecteur
= signal permettant la prise en compte du
temps de coagulation
 Coagulation

Les tests Chromogéniques

= colorimétrique

Dosage spécifique des:

- facteurs de la coagulation
- inhibiteur de la coagulation -héparine
 1. Héparinémie – Activité
anti Xa
 Principe : Méthode amidolytique dans un système compétitif

 Consiste à mettre en présence à 37° l’échantillon hépariné à tester, de

l’antithrombine, du facteur Xa en excès et un substrat.

 Dés l’addition de facteur Xa au mélange plasma + substrat

 2 réactions se développent simultanément :

 hydrolyse du substrat par le facteur Xa
 inhibition du facteur Xa par le complexe héparine – AT
 Après équilibre de la réaction de compétition la libération de
paranitroaniline devient inversement proportionnelle à la conc
d’héparine dans le milieu.
 Principe
 Le complexe Hep-AT est formé à partir de l’Hep et de
l’AT propre au plasma

1) Heparine + AT (Hep-AT)
2) (Hep-AT) + Facteur Xa (exces) (Hep-AT-Xa) + Xa
résiduel
3) Xa résiduel + substrat—pNA pNA à 405 nm

 Méthode en cinétique, sans interruption de la réaction

avec mesure de l’accroissement de DO par unité de
temps
 Réactifs
 Nombreux réactifs sur le marché:
 Prêt à l’emploi ou à reconstituer
 Avec ou sans sulfate de dextran (minimise l’effet d’antagoniste de
l’héparine mais attention déplace l’héparine de son complexe avec
la protamine cf Chir cardiaque)
 Avec ou sans AT exogène
 Différentes calibrations:
 HNF, HBMP, Arixtra, Orgaran, Rivaroxaban, Apixaban
 Limites:
 centrifugation dans l’heure suivant le prélèvement
 déficit en AT ►sous-estimation de l’héparinémie
 2. Cas particuliers des
NACO
 Anti-Xa: Apixaban et Rivaroxaban
 Même réactif que celui pour HBPM (à HL)
 Mais courbe de calibration différente
 Exprimer en ng/mL

 Anti-IIa: Dabigatran
 Temps de thrombine sur plasma dilué
 Courbe de calibration
 Exprimer en ng/ml
 Anti-Xa:
1) (ABAN) + Facteur Xa (exces) (ABAN-Xa) + Xa résiduel
2) Xa résiduel + substrat—pNA pNA à 405 nm
Inversement proportionnel à la quantité d’anticoagulant

 Anti-IIa:
Concentration
en ng/mL

Temps de thrombine en secondes

 3. L’Antithrombine
 Principe
 Héparine (réactif) + AT (patient)  Hép-AT
 Hép-AT + Xa (réactif)  Xa-Hép-AT + Xa résiduel
 Xa résiduel + Substrat  DO

 Résultat
 La quantité de thrombine résiduelle est inversement
proportionnelle à la quantité d’AT présente dans le
milieu.
 Normales: 80-120 % / Détecte tous les types de déficit
 Fibrinolyse
Tests globaux
 Temps de lyse des euglobulines : test de von
kaulla
  temps de lyse du caillot formé à partir du
plasma déplété en inhibiteur de la fibrinolyse
 Temps normal > 3heures

 Lyse d’un caillot de sang total : <72heures

Fibrinolyse

Autres
du fibrinogène

Dosage des PDF

Les D-dimères spécifiques de la

dégradation de la fibrine
D-Dimères
Fibrinolyse

Les tests
immunologiques
 1. DDI Latex et PDF

 DDi : Fibrinosticon ®
 Agglutination de particules de latex sensibilisées qui permet une
détermination semi-quantitative des produits de dégradation de la
fibrine non stabilisée dans le plasma humain
 Rapide mais sensibilité et VPN de 85%
 Pour diagnostic de CIVD mais pas exclusion de la MTEV

 PDF : recherche des produits de dégradation de la fibrine et du

fibrinogène par agglutination des particules de latex
sensibilisées à l’aide d’un Ac monoclonal
 2. DDI Vidas
 Détermination immuno-enzymatique des produits de dégradation
de la fibrine (détection finale en fluorescence : ELFA), automate
Vidas

 Diagnostic d’exclusion de la maladie thrombo-embolique

 VPN proche de 100%

 Exclusion d’une thrombose si < 500 ng/ml

 Pas d ’intérêt si patient âgé, immobilisation prolongée, cancer,

chirurgie récente, syndrome inflammatoire, réa
Fibrinolyse

Tests spécifiques
 Dosage du plasminogène

 Dosage de l’α2 antiplasmine