ANALYSES DE QUELQUES MICROORGANISMES

DÉNOMBREMENT DES MICROORGANISMES REVIVIFIABLES : LA

FLORE TOTALE AÉROBIE

Norme en ISO 6222.

Dénombrement de toutes les flores aérobies : bactéries, levures et moisissures.

Plusieurs intérêts :

Suivi de la qualité microbiologique :

Eaux de nappes souterraines
Eaux rendues potables/traitement livrées sous forme conditionnée.
Produit alimentaire ou pharmaceutique

1
Aptitude à l’emploi de sources d’alimentation en eau pour la préparation
d’aliments et de boissons ne devant contenir que peu de microorganismes.
 DÉNOMBREMENT DES MICROORGANISMES REVIVIFIABLES : LA
FLORE TOTALE (SUITE)

 Résultats, exprimés en UFC/ml

Si absence de colonies avec l’échantillon non diluée : non détecté
Si présence de plus de 300 colonies :> 300

RAPPORT D’ESSAI

Informations concernant l’expérience :

Echantillon

Technique (s) et milieu (x) utilisés

Durée et température d’incubation

Résultats de comptage 2

Toute détail ou indice observé au cours de l’expérience

 DÉNOMBREMENT DES MICROORGANISMES REVIVIFIABLES : LA
FLORE TOTALE (SUITE)

EXPRESSION DES RÉSULTATS

Limites de quantification : entre 30 et 300 colonies

N= x 1/d

N : nombre de bactéries/ml ou Charge bactérienne (UFC/ml)

ΣC : somme des colonies comptées sur toutes les boites retenues de 2 dilutions successives
et dont au moins une contient au minimum 30 colonies.
V : volume de l’inoculum déposé dans chaque boite (ml)
n1 et n2 : nombre de boites retenues respectivement à la 1ère et à la 2ème dilution
d : taux de dilution correspondant à la 1ère dilution retenue

Les résultats peuvent être calculés à l’aide de l’équation générale

suivante :
3
1/d
 Dénombrement à l’intérieur de limites de quantification

Exemple :
Si des volumes de 0,1 ml et de 0,01 ml d’un échantillon produisent des
dénombrements de 250 et 14 colonies, conserver la valeur de 250
colonies pour exprimer le résultat :

Dénombrement à l’extérieur des limites de quantification

Dénombrement lorsque le nombre de colonies isolées est inférieur à

la limite de quantification

4
Exemple :
Si des volumes de 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml d’un échantillon produisent
respectivement 28, 4 et 0 colonies, le résultat est le suivant :

Dénombrement lorsque aucune colonie n’a été isolée sur les boîtes de
Pétri correspondant à plusieurs volumes analysés d’un échantillon

Exemple :
Si des volumes de 0,1 ml, 0,01 ml et 0,001 ml d’un échantillon
produisent tous des comptes de 0 colonie, calculer le nombre de
colonies par ml qui aurait été rapporté s’il y avait 1 colonie sur la
gélose du plus grand volume d’échantillon utilisé :

Transmettre ce résultat comme étant : < 10 UFC/ml

Dénombrement lorsque tous les résultats de plusieurs volumes d’un
échantillon sont au-delà de la limite supérieure de quantification

Exemple :
Si des volumes de 1,0 ml, 0,1 ml et 0,01 ml d’un échantillon produisent
respectivement 540, 390 et 320, tous les comptes sont au-delà de la
limite de quantification. Estimer le résultat à l’aide du plus petit
volume utilisé et de la limite supérieure de quantification (300 pour
les BHAA).

Transmettre ce résultat comme étant : > 30 000 UFC/ml

6
 RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DES BACTÉRIES COLIFORMES
ET E. COLI

Reference
Germe Matrice Intitulé de la méthode
normative
Recherche et dénombrement des E. coli
Escherichia Méthode de filtration sur membrane pour
eau ISO 9308-1 les eaux avec un faible niveau de flore
coli
bactérienne (milieu mFC-BCIG)

Recherche des E. coli

Escherichia Eau (sauf eau de Méthode Présence/Absence : Colilert-
ISO 9308-2
coli mer)
18/Qunati-Tray
Recherche et dénombrement des E. coli
Escherichia Eau de surface et
ISO 9308-3 Méthode miniaturisée (NNP)
coli résiduaire

 milieu mFC-BCIG permet la différenciation E. coli, car environ 95% des souches de cette espèce
possèdent l’enzyme β-D-glucoronidase.
7
 Cette enzyme métabolise le BCIG (acide 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique) contenu
dans le milieu pour produire un composé bleu.
 RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DES BACTÉRIES COLIFORMES
ET E. COLI
Techniques
Techniques générales des dilutions en milieu
liquide
Techniques NPP à 3 tubes/série
Techniques NPP à 5 tubes/série
Techniques NPP 96/µplaque
Techniques de filtration sur membranes
Techniques de dénombrement/ensemencement en
profondeur
Techniques de dénombrement en anaérobiose
Techniques rapides de détection ou de
dénombrement de µorganismes dans les eaux
Germes recherchés Milieux de culture
µorganismes revivifiables ou totaux
Coliformes (totaux) et thermotolérants
Streptocoques et entérocoques fécaux
E. coli
E. coli
Entérocoques fécaux seulement
Coliformes (totaux) et thermotolérants
ISO 9308-1
Entérocoque intestinaux seulement,
(Norme NF en ISO 7899-2)
Streptocoques du groupe D
(entérocoques esculine+)
entérocoques (sans nécessité de
confirmation des colonies
µorganismes revivifiables
Clostridium sulfitoréducteurs 8
E. coli, entérocoques
 TECHNIQUE GÉNÉRALE DES DILUTIONS EN MILIEU LIQUIDE

Dilutions décimales dans 1 série de 1-3 tubes contenant 9 ml de bouillon tryptone

MÉTHODE PAR ENSEMENCEMENT EN MILIEU LIQUIDE (NPP)

Technique de dénombrement simple, rapide mais pas de très grande précision.

Basée sur l’observation d’1 trouble après ensemencement d’1 série de dilutions d’1
culture bactérienne.

Interprétation, table de Mac Crady  le nombre le plus probable (NPP).

MÉTHODE PAR FILTRATION SUR MEMBRANE

Norme française en ISO 9308-1

Méthode préconisée pour les eaux :

consommation humaine
9
Désinfectées
Ne contenant qu’un petit nombre de bactéries.
Méthode peu sélective et le dénombrement des coliformes pouvant être perturbée par
la flore bactérienne générale.

MÉTHODE PAR INCORPORATION EN GÉLOSE EN TUBE PROFONDS

Applicables aux différents types d’eau.

Destruction des formes végétatives /chauffage à 80°C ±2°C/10 min

Spores de Clostridium sulfito-réductrice ensemencés sur milieu gélosé Tryptose-

sulfite à la D-cyclosérine (TSC).
Autres bactéries sulfito-réductrice sur la gélose Viande Foie au sulfite-Fer.

Colonie noire entourée d’un halo = spore.

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Résultats nbre d’organismes anaérobies sulfito-réducteurs/volume d’échantillon.

 RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DES BACTÉRIES COLIFORME
ET E. COLI

Présence de coliforme, difficile à interpréter, n’est pas la preuve d’une

contamination d’origine intestinale mais peut indiquer une défaillance d’un
traitement ou de la distribution d’eau.

La présence d’E. coli fournit une indication sur l’origine de la pollution et donc du
risque infectieux pour la santé.

RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES

 Type d’eau, il est préconisé l’usage soit :

Milieu de Rothe (présomption) et Litsky (confirmation) pour les eaux de surface

Milieu de Slanetz et Bartley (présomption) pour les eaux.

Dénombrement des entérocoques (streptocoque fécaux) indicateur :

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pollution fécale
risque sanitaire.
 RECHERCHE DES BACTÉRIES SULFITO-RÉDUCTRICE ET LEURS
SPORES

Longue vie dans l’environnement.

Leur présence indique une contamination ancienne ou intermittente.

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 MÉTHODE PRÉSENCE/ABSENCE (P-A)

La méthode présence-absence (P-A) est un test qualitatif qui dépend d’un

changement de couleur pour déterminer la présence d’une contamination. Les
avantages de cette méthode sont qu’elle est relativement bon marché, rapide et
simple d’utilisation.

Si le test est positif, signifiant que l’indicateur bactérien est présent, l’échantillon
d’eau prendra une couleur particulière. Les tests P-A ne vous donneront pas la
quantité de ces bactéries dans l'échantillon d'eau.

Sa principale limite est qu’elle ne donne un résultat que de type positif ou négatif ;
 Illustration

1. Un réactif en poudre est ajouté a l’échantillon

2. L’échantillon est incubé pendant 24-48h
3. Les résultats sont lus incolore=négatif couleur=présence
coliforme totaux fluorescent= Escherichia coli
 LES EAUX RÉCRÉATIVES

Baignades aménagées en mer et en eau douce

Eaux de bassins de piscines.

LES PARAMÈTRES MICROBIOLOGIQUES ET QUALITÉ DES EAUX

Les indicateurs fécaux recherchés sont les entérocoques et E. coli.

Pour les eaux intérieures
A B C D E
Paramètre Excellente qualité Bonne qualité Qualité insuffisante Méthode de référence pour
l’analyse
Entérocoques intestinaux 200 (*) 400 (*) 330 (**) ISO 7899-1 ou ISO 7899-2
(UFC/100ml)
E. coli 500 (*) 1000 (*) 900 (**) ISO 9308-3 ou ISO 9308-1

Pour les eaux côtières et de transition

A B C D E
Paramètre Excellente qualité Bonne qualité Qualité insuffisante Méthode de référence pour
l’analyse
Entérocoques intestinaux 100 (*) 200 (*) 185 (**) ISO 7899-1 ou ISO 7899-2
(UFC/100ml)
15
E. coli 250 (*) 500 (*) 500 (**) ISO 9308-3 ou ISO 9308-1
 Classement des zones de baignade

Classement des eaux de baignade Bonne qualité Qualité suffisante Qualité insuffisante

Réexamen à effectuer au moins tous les 4 ans 3 ans 2 ans

PARAMÈTRES SALMONELLA ET ENTÉROVIRUS

A rechercher pour 1 éventuelle présence ou détérioration de la qualité des eaux

Salmonella : 0/ 1L
Entérovirus : 0/ 10L

Bactéries recherchées Normes bactériologiques

Bactéries aérobies revivifiables à 37°C < 100 germes / ml
Coliformes totaux < 10 germes / 100ml
Coliforme thermotolérants Absence dans 100 ml
Streptocoques fécaux Nombre guide : 100/ 100 ml
Germes pathogènes (staphylocoques 0/ 100 ml pour 90% des échantillons
Pseudomonas aerugionosa Non précisé

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 ANALYSE DES MICROORGANISMES PATHOGÈNES

RECHERCHE DE SALMONELLA
Elle peut être recherchée dans les eaux de baignade aménagée.
Norme ISO 6340 : 19995 suggère son absence dans 1L d’échantillon.
Filtration de 1000ml
d’eau

Dépôt sur milieu d’enrichi

Incubation 48H/37°C

Ensemencement sur milieu d’isolement

incubation 18 à 48H /37°C 17

Identification biochimique ou sérologique

 RECHERCHE DES STAPHYLOCOQUES PATHOGÈNES

Recherche des staphylocoques pathogènes (S. aureus et autres…)

Filtration de 100 ml d’eau

Dépôt sur milieu d’isolement (Chapman)

Incubation 48H/37°C

18

Identification biochimique ou sérologique

 RECHERCHE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Méthode par filtration sur membrane

Filtration de 100 ml d’eau sur membrane de 0,22 µm

Dépôt sur milieu d’isolement (à l’acide nalixidique et cetrimide)

Incubation 48H/37°C

lecture des colonies caractéristiques sous UV  colinies fluorescentes

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Identification biochimique ou sérologique

 LES EAUX CONCHYLICOLES

Paramètre Valeur guide Valeur Méthode d’analyse de référence Fréquence minimale

impérative d’échantillonnage et mesure

Coliformes ≤300 CLI - Méthode de dilution avec fermentation en substrat liquides dans au trimestrielle
fécaux/100ml moins 3 tubes de dilution. Repiquage des tubes positifs sur milieu
de confirmation. Dénombrement selon NPP. Température
d’incubation 44°C

CLI : chair, liquide intervalvaire

Pour la consommation, recherche en routine d’E. coli et Salmonella.

INTERPRÉTATION ET EXPLOITATION DES RÉSULTATS

En fonction des variations de la qualité de la zone, le nombre de point et la fréquence

des prélèvements pour la surveillance sanitaire d’une zone de production sont
adaptés.
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 ESTIMATION DE LA QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE D’UNE ZONE DE
PRODUCTION

Estimée sur 3 ans pour éviter les fluctuations interannuelles. Elle est fixée par
l’arrêté du 21.05.99.

Nombre d’E. coli/100g CLI

Catégorie 230 1000 46000 46000
A ≥90% ≤100% 0%
B ≥90% ≤10% 0%
C ≥90%
D >10%

DÉTERMINATION DE L’ÉVOLUTION EN MOYEN TERME

Comparaison de la qualité estimée de la zone sur 2 périodes consécutives de 3 ans.

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 RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT D’E. COLI (NF V08-600)

Méthode NPP : à partir de 25g de CLI

Par impédancemétrie : méthode indirecte de dénombrement.

Ensemencement de 2 cellules de mesure contenant un milieu de culture sélectif (BLBVB)

Incubation à 44°C

Mesure de la variation de la conductance du milieu durée maxi 12h

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Il faut toujours confirmer E. coli par repiquage : production de gaz et d’indole à

44°C. Mais cette méthode nécessite un étalonnage.
 EAUX THERMALES

Les analyses de surveillance de l’eau minérale autre que conditionnée comprennent

le dénombrement de :

Paramètres microbiologiques Volume d’eau analysé Norme de qualité

Bactéries revivifiables après 24h à 37°C et 72h à 22°C 1ml 0
Anaérobie sporulés sulfito-réducteurs 50 ml 0
Coliforme totaux à 37°C 250 ml 0
Coliformes thermotolérants 250 ml 0
Streptocoques du Group D 250 ml 0
Pseudomonas aeruginosa 250 ml 0
Legionella 1L 0

RECHERCHE DE LEGIONELLA

Bacille Gram-,
Asporulée,
Aérobie,
Mobile ou non,
Exigent en L-cystéine,
 Riche en acide gras ramifiés propriété inhabituelle chez les bactéries Gram-.
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