QUANTIFICATION DES MICROORGANISMES

Étude comparative des méthodes de quantification classiques

COMPÉTENCES ÉLÉMENTAIRES TRAVAILLÉES LORS DE L’ACTIVITÉ TECHNOLOGIQUE

C1.4.1 - Mettre en œuvre un examen microscopique C1.4.2
- Cultiver les agents biologiques.
C1.4.5 - Dénombrer les agents biologiques.
C2.1- Organiser son activité de travail.
C2.2 – Préparer les équipements et les matériels
C2.4 - Gérer la santé et la sécurité au travail
C3-1- Analyser et exploiter des données ou des résultats.
C4-3 – Faire un rapport écrit ou oral sur le travail effectué

CONTEXTE PROFESSIONNEL

Au cours de certaines manipulations, il est nécessaire de pouvoir évaluer, à un moment donné, la concentration en micro-organismes
dans un inoculum. Il est possible de réaliser cette détermination, par exemple, par numération directe en cellule de comptage
(détermination du nombre de micro-organismes par unité de volume), ou par ensemencement de géloses après dilutions
(détermination du nombre d’U.F.C. par unité de volume), ou par filtration, dessiccation et pesée (détermination de la masse
bactérienne, biomasse, par unité de volume).
La méthode la plus simple, précise et rapide est la mesure d’atténuance due à la concentration microbienne, mais il est
indispensable d’avoir étalonné cette technique de façon à pouvoir estimer la population microbienne présente dans le mileu de
culture : c’est ce qu’on appelle « établir une concordance entre techniques ».

OBJECTIFS

- Mettre en œuvre et exploiter différentes techniques de détermination de la concentration cellulaire d’une souche de
Saccharomyces cerevisiae (champignon unicellulaire de type levure) :
o Opacimétrie
o Numération en cytométrie directe o Dénombrement après mise en
culture o Méthode pondérale
- Réaliser et exploiter un spectre d’absorption.
- Déterminer une limite de linéarité.
- Déterminer la concordance entre atténuance, masse de matière sèche, UFC/mL et cellules/mL.
Vous manipulerez par groupe de 2 ou 3. Le choix du matériel, l’organisation du travail et la préparation technique des manipulations,
vous incombent.

ÉTAPES DE LA MANIPULATION
Ressources matérielles Ressources documentaires

1
 Par groupe - Culture de Saccharomyces cerevisiae en bouillon sabouraud - Technique de filtration sur membrane
- 100 mL de bouillon sabouraud stérile - Techniques de dilutions en série
- Flacon de 300 mL d’eau distillée stérile - Techniques de dénombrement sur boîte
- Gélose en sabouraud en surfusion à +55°C - Photométrie des milieux troubles
- Pipettes graduées stériles de 1 mL – 5 mL – 10 mL et 20 mL + poires à - Hématimètre de Malassez
prélèvement - Modèle de rapport d’activités
- 3 filtres millipores stériles - Fiche de compétences
- -
Éprouvette stérile de 20 mL Annexes 1 à 3
-
Tubes à essais et tubes à hémolyse stériles
-
Boîtes de Pétri 90 mm stériles
-
- Pipettes à Piston + cônes bleus et jaunes stériles
- Pipettes Pasteur stériles et non stériles
- Cuves à spectrophotomètre
- Hématimètre de Malassez + lame planée
- Lames et lamelles
- Vortex
- Bleu de Funk
- Spectrophotomètre
- Systèmes de filtration
- Four à 105°C
- Glace + cuves à glace
Matériel courant du laboratoire

RAPPORT D’ACTIVITÉS
Q1. Présentation des manipulations (voir annexe 1) : réaliser une représentation schématique du protocole (une seule page format
paysage) c’est-à-dire un schéma de l’ensemble des manipulations que vous allez effectuer.
Q2. Proposer un projet argumenté de la répartition du travail entre les étudiant(e)s du groupe en précisant la chronologie des
différentes étapes du protocole.
Q3. Dans la cadre de la manipulation réalisée, rédiger un tableau d’analyse a priori des risques (annexe 4) : identifier les dangers,
repérer les situations exposant à ces dangers et en déduire les mesures de prévention à mettre en œuvre. Préciser comment gérer
les déchets.
Q4. Inspirez-vous du document fourni et des annexes pour regrouper l’ensemble de vos résultats.
Q5. Tracer la courbe atténuance Dnm = fonction de la dilution de la suspension.
Q6. L’atténuance est-elle toujours proportionnelle à la concentration microbienne ? Déterminer la valeur de l’atténuance à la limite
de linéarité de l’appareil (valeur de D au-delà de laquelle il n’y a plus de proportionnalité entre D et la concentration en biomasse).
Indiquer l’intérêt de connaître cette limite.
Que faut-il faire si l’atténuance mesurée d’une suspension microbienne est supérieure à l’atténuance limite précédemment
déterminée ?
Q7. Déterminer et justifiez les concordances suivantes :
Dnm = 0,1 correspond à …………………………………… mg de matière sèche /mL
Dnm = 0,1 correspond à …………………………………….UFC/mL
Dnm = 0,1 correspond à …………………………………….cellules viables/mL

PROTOCOLE

La culture est présentée en Erlenmeyer contenant 100 mL de culture de Saccharomyces cerevisiae en bouillon
sabouraud. Elle est en fin de phase exponentielle de croissance afin qu’elle contienne un faible pourcentage de cellules
mortes et une biomasse importante.

Recommandations :
- Afin d’éviter la prolifération microbienne, vous placerez le flacon dans la glace, chaque fois que vous ne l’utiliserez
pas.
- Bien penser à homogénéiser les suspensions (vortex) avant tout prélèvement et avant toute mesure d’atténuance.

2
1. CONTROLE DE PURETÉ
Réaliser une coloration de Gram et un isolement de la culture sur gélose sabouraud coulée en boîte de Pétri. Incuber à
+30°C pendant 48 heures.

2. MESURE DE L’ATTÉNUANCE POUR DIFFÉRENTES DILUTIONS DE LA CULTURE DE LEVURES

2.1. Réaliser le spectre d’absorption du bouillon sabouraud et de la culture de levures

L’évaluation de la biomasse au spectrophotomètre repose sur le principe de l’opacimétrie. Le choix de la longueur d’onde
est capital : pour que l’atténuance soit proportionnelle à la biomasse, il faut qu’à la longueur d’onde choisie, le milieu et
les constituants cellulaires (acides nucléiques, protéines…) n’absorbent pas la lumière. C’est pourquoi, vous
commencerez par tracer le spectre d’absorption du bouillon sabouraud et de la culture de levures entre 400 et 800 nm
(pas de 50 nm).

2.2. Mesure de l’atténuance de différentes dilutions de la culture

- Réaliser une série de dilutions de la culture en bouillon sabouraud stérile (volume final de 5 mL) selon le tableau
suivant :
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Culture (mL) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0,4 0,2 0,1
Bouillon stérile (mL) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 4,6 4,8 4,9
- Mesurer les atténuances, à la longueur d’onde choisie, pour chaque dilution.
- Faire le « zéro » avec du bouillon sabouraud stérile dans les mêmes conditions de mesure.

Remarques :
➢ Mettre en fonctionnement les spectrophotomètres dès le début de la séance.
➢ Effectuer toutes les mesures sur le même appareil.
➢ Ne transvaser les dilutions dans les cuves qu’au moment de faire la lecture : les levures sédimentent rapidement.
➢ Réaliser les transvasements de la culture avec une pipette.
➢ Les cuves pour spectrophotomètre contenant la souche seront toujours obturées de film paraffiné et placées dans
un portoir avant lecture. Laisser le parafilm sur les cuves pendant la lecture.
➢ Ne pas poser les cuves sur les appareils.
➢ Noter immédiatement les résultats dans un tableau préalablement préparé dans le cahier de laboratoire.
➢ Les cuves seront jetées dans un sac autoclave destiné à l'incinération. Il convient de ne pas contaminer
l’environnement.

3. DÉTERMINATION DE LA MASSE DE MATIÈRE SÈCHE PAR ML DE CULTURE (MÉTHODE PONDÉRALE)

Des membranes filtrantes « Millipore » ont été chauffées pendant environ 12 heures à +105°C puis refroidies en
dessiccateur juste avant le TP.
- Identifier et tarer un bécher contenant 3 filtres « Millipore » conservés dans du papier alu.
- Filtrer, à l’aide d’un dispositif de filtration adapté, 100 mL de la culture diluée au 1/4 ou au 1/8 en bouillon
sabouraud (selon la concentration de la culture au départ). Il sera nécessaire de changer de filtre car les pores se
colmatent (filtrer environ 30 mL par filtre).
- Avant chaque changement de filtre, rincer les parois du montage avec 20 mL d’eau distillée stérile.
- Replacer, à l’aide d’une pince stérilisée, les 3 membranes filtrantes dans le papier alu.
- Sécher à 105°C pendant environ 12 heures jusqu’à masse constante.
- Laisser refroidir dans un dessiccateur (durée inférieure à 2 heures) et peser en début de 2ème jour de TP.

4. ESTIMATION DE LA CONCENTRATION EN LEVURES PAR COMPTAGE DIRECT EN HÉMATIMÈTRE

La numération de la culture pure permet d’évaluer la concentration bactérienne du bouillon initial afin de choisir
correctement les dilutions à ensemencer lors de la numération indirecte.

3
- Réaliser une dilution au 1/20ème de la culture. Pour cela, diluer d’abord la culture au ½ au bleu de Funk puis au
1/10ème en eau physiologique stérile (en tube à hémolyse stérile).
Le bleu de Funk permet de différencier les cellules mortes des cellules viables.
- Homogénéiser la suspension au vortex.
- Monter la préparation en cellule de comptage et observer au microscope au grossissement x 400.
- Réalisez 2 essais. Attention aux groupements de levures.

Remarque :
Avant de manipuler, entre 2 manipulations et à la fin de la manipulation, les hématimètres en verre seront
soigneusement lavés à l’alcool puis à l’eau distillée et seront essuyés avec du papier Joseph en prenant soin de ne pas
frotter au niveau du quadrillage.

5. NUMÉRATION DES LEVURES PAR INOCULATION DANS LA MASSE D’UNE GÉLOSE SABOURAUD
(NUMÉRATION INDIRECTE)
- Réaliser une numération dans la masse à l’aide de 2 essais et pour 3 dilutions successives choisies d’après les
résultats du comptage en hématimètre et sachant que l’on doit compter un maximum de 300 UFC/boîte.
- Déposer 1 mL de chaque dilution choisie dans une boîte de pétri 90 mm stérile et couler 18 mL de gélose sabouraud
stérile en surfusion.
- Laisser solidifier et incuber à +30°C pendant 48 heures.

RISQUES, SECURITE, GESTION DES DECHETS

Les manipulations proposées mettent en œuvre une souche du groupe 1. Les procédures classiques en usage dans le
laboratoire (adapté aux bactéries du groupe 2) – et qu'il faut absolument connaître - sont donc plus qu'adaptées et
suffisantes (par exemple la gestion des pointes de pipettes, des pipettes plastiques, des cuves pour photométrie
chargées en micro-organismes, des milieux après incubation ...).
Lors de la manipulation du paragraphe 5, il convient de protéger la manipulation des contaminations (travail aseptique).
La manipulation n'exige pas une manipulation aseptique.

ANNEXE 1 : AIDE À LA RÉALISATION D’UN SCHÉMA FONCTIONNEL

Je représente… En identifiant les différentes manipulations qui interviennent dans le protocole

étudié
En choisissant, pour figurer chaque élément du schéma, des formes symboliques
simples et des couleurs judicieuses
En mettant en relation (par des flèches par exemple) les différents éléments du
schéma
Je mets en page … En disposant les éléments à mettre en relation de manière organisée (dans
l’espace ou dans le temps …) et lisible
J’annote ma Je titre en mettant en valeur le titre
représentation… en précisant les relations et le mécanisme étudié
Je légende en effectuant un choix de légendes à placer
en les plaçant judicieusement dans la page en
vérifiant l'orthographe
en traçant les traits de rappel à la règle si nécessaire
je complète En numérotant les étapes s’il y a une chronologie d’événements à respecter.

ANNEXE 2 : AIDE À LA RÉALISATION D’UN TABLEAU

4
 Je construis… en traçant des lignes et des colonnes, en identifiant les données que je place en
ligne et celles que je place en colonne, en complétant les cases ou cellules
judicieusement (données chiffrées, schéma ou texte court), avec soin.

Je présente... Je titre en mettant en valeur le titre

Je légende en précisant l’intitulé des lignes et colonnes avec leurs unités si nécessaire, en
vérifiant l'orthographe
J’exploite… soit en extrayant les informations essentielles,
soit en comparant les informations soit en
mettant en relation les informations.

ANNEXE 3 : DÉMARCHE DE PRÉVENTION PAR L’ANALYSE A PRIORI DES RISQUES

Démarche de prévention par l’analyse à priori des risques de la procédure opératoire en 3 temps :
1. Identification des dangers
2. Repérer les situations exposantes aux dangers et les évènements dangereux.
3. En déduire les mesures de prévention adaptées.

1. ANALYSE DE LA SITUATION DE TRAVAIL ET IDENTIFICATION DES DANGERS

5M
Milieu (ex. locaux) Paillasse située au laboratoire de microbiologie
Matériel

5
 Matières premières

Moyen (ex. protocole)

Présentation de la
procédure opératoire
envisagée

Main d’œuvre Étudiant.es BTS1 en apprentissage

2. IDENTIFICATION DES SITUATIONS ET ÉVÈNEMENTS DANGEREUX ET MOYENS DE PRÉVENTION ADAPTÉS

Situations exposantes aux dangers Événements dangereux Mesures de prévention adaptées

La situation exposante précise possibles Il faut envisager les adaptations de la
l’environnement et le matériel utilisé Envisager l’événement situation de travail et les moyens de
dangereux pour le protection individuelle
manipulateur et pour les
étudiants voisins