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AT de biotechnologies
Contexte :
Le tableau ci-dessous résume les principaux critères admissibles pour un lait cru :
Lait cru
Lait cru
(à la DLC : Date Limite de
(au stade conditionnement)
Consommation)
Flore totale à 30°C 90.000 / mL 300.000 / mL
E.coli Pas de critère Pas de critère
S.aureus 100 / mL 500 / mL
Le lait cru testé étant au stade conditionnement, et en supposant qu’il soit juste à la limite
d’acceptabilité, prévoir la dilution décimale à réaliser pour avoir entre 15 et 300 UFC
comptables. Prévoir un encadrement à ± 1 dilution.
• Réaliser les dilutions décimales en eau peptonée ordinaire de 9 mL, puis ensemencer en
masse, en double essai, les milieux PCA. Incuber 48 H à 30°C.
Exploitation :
Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL.
Conclure à l’aide du document 1.
Cette technique est utilisée pour un dénombrement approximatif de la flore du lait cru et des
yaourts.
1-Principe
Un volume déterminé d’échantillon de 0,01 mL est étalé sur 1 cm2 à la surface d’une lame.
Le frottis est coloré puis est ensuite observé au microscope : les micro-organismes sont
comptés sur plusieurs champs de surface connue. Il est possible alors de calculer le nombre
de micro-organismes par mL.
2-Technique
-Sachant que le diamètre d’un champ microscopique à l’objectif x1000 est de 180 µm,
déterminer la surface d’un champ microscopique (surface cercle = 3,14 x r2)
-A l’aide de la moyenne des micro-organismes comptés par champ, calculer le nombre total
de micro-organismes déposés sur 1 cm2, puis exprimer la concentration en micro-organismes
/ mL de lait cru.
-Comparer ce résultat avec les résultats du dénombrement de flore totale sur milieu PCA en
J2.
Parmi ces différentes bactéries, E.coli est très intéressante car elle est le seul coliforme
totalement spécifique de l’intestin : c’est donc un témoin de contamination fécale. De plus,
E.coli est un germe relativement fragile, qui ne peut survivre longtemps dans
l’environnement.
La recherche d’E.coli est donc très intéressante : si la bactérie est présente dans un aliment,
cela signifie que celui-ci a été récemment contaminé par des matières fécales et que d’autres
pathogènes peuvent être présents : on parle de contamination fécale récente. Il faudra
donc ensuite rechercher la source de la contamination et corriger la situation.
la recherche d’E.coli dans un lait cru est donc un critère important permettant
de vérifier que celui-ci a été prélevé et stocké dans de bonnes conditions
d’hygiène.
Il existe de nombreuses méthodes d’étude des coliformes et d’E.coli utilisant des milieux
variés. Les normes récentes permettent d’utiliser de nouveaux milieux de culture dits
chromogéniques, qui permettent de différencier directement E.coli des coliformes (exemple
du milieu de culture ColiID de Bio-Mérieux ou du milieu TBX).
On réalisera le dénombrement en surface, en simple essai, à partir des dilutions 10-1, 10-2 et
10-3. Incuber selon les recommandations proposées dans la fiche fournisseur.
-A l’aide de la fiche fournisseur, identifier les colonies caractéristiques de E.coli sur TBX ou
ColiID.
-Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL
par calcul classique, puis à l’aide de la formule AFNOR ci-dessous. Comparer les résultats
obtenus.
-Le tableau en introduction ne mentionne aucun critère pour E.coli. Quel est donc l’intérêt de
ce dénombrement ?
d = première dilution
S.aureus est une bactérie commensale de l’homme : on la retrouve dans les cavités ORL à
partir desquelles elle est disséminée en aérosols sur la peau, y compris les mains. Elle peut
être pathogène dans certaines circonstances et au niveau de certains tissus (pathogène
opportuniste).
Dans l’industrie alimentaire, pour se préserver de S.aureus, l’hygiène des opérateurs doit
donc être irréprochable : lavage des mains, lavage des bottes, désinfection des matériels,
port d’équipement spéciaux (masques, charlottes, etc.).
Dans le cadre d’un dénombrement sur du lait cru, cette recherche permet donc de vérifier
les bonnes conditions d’hygiène du personnel dans le local de traite.
Exploitation :
Lorsque le lait cru subit une contamination importante, les micro-organismes à l’aide de leur
β galactosidase peuvent dégrader le lactose en libérant ses oses constitutifs. Ces oses sont
ensuite consommés par les germes pour former de l’acide lactique, ce qui acidifie le lait et
peut à terme le faire cailler.
Deux contrôles biochimiques seront réalisés pour vérifier que le lait cru n’a pas subit
d’altérations (par binôme) :
-une caractérisation du lactose par chromatographie sur couche mince (élève 1),
-un dosage du lactose par méthode spectrophotométrique (élève 2).
I-Défécation préliminaire
La couleur blanche opaque du lait empêche d’y mesurer une absorbance. Cette opacité
provient des grosses protéines lactiques (caséines) et d’émulsions de matières grasses : on
élimine donc au préalable ces composés parasites par précipitation + centrifugation (=
défécation)
Protocole
Introduire dans un tube centrifugeable,
-5 mL de lait cru (préalablement stérilisé pour éliminer les micro-organismes),
-5 mL de solution défécante (solution de sulfate de cuivre et de zinc)
Laisser agir au moins 5 minutes pour précipiter les protéines et les matières grasses, puis
centrifuger à 4500 rpm pendant 5 min.
Récupérer le filtrat.
La préparation de ce tube a été réalisée à partir du lait cru du J1 : le filtrat est fourni prêt à
l’emploi.
Molish
Solvant de migration
- Une phase fixe (= phase stationnaire), constituée par un adsorbant, le gel de silice,
qui est solide et polaire. Le gel de silice est étalé sur un support inerte constitué d’une
couche mince de plastique.
- Une phase mobile constituée d’un mélange de 3 solvants : butan 2-one / acide acétique
/ méthanol, plus apolaire que la phase fixe.
la phase fixe étant de nature solide, il s’agit d’une chromatographie d’adsorption.
2-Révélation
Après migration, les spots obtenus sont révélés par une réaction colorée spécifique des
glucides. On utilise comme révélateur le réactif de Molish qui donne une coloration
bleue-violette en présence de glucides.
3-Mode opératoire
3.1-Préparation de la cuve
Attention : manipuler soigneusement les plaques pour ne pas rayer la silice. Ne pas toucher
avec les doigts : utiliser des pinces et déposer les plaques sur du papier filtre.
-Matérialiser la ligne de dépôts en traçant, très légèrement au crayon de papier, une ligne
horizontale à environ 3 cm du bord inférieur de la plaque.
Remarque : les plaques sont fournies réactivées par passage à l’étuve à 100°C / 30 min.
-Marquer les emplacements des dépôts, régulièrement espacés, en laissant une marge de
chaque côté pour limiter les effets de bord.
-A l’aide d’un capillaire calibré de 3 µL, déposer la solution de sucres pour chaque dépôt. On
surcharge chaque dépôt 3 fois (sécher immédiatement entre chaque dépôt au séchoir
électrique, pour éviter l'étalement de la tache qui ne doit pas excéder 3 mm de diamètre).
3.3-Migration
-Introduire la plaque dans la cuve en évitant les mouvements du solvant et en vérifiant que
la ligne de dépôt se trouve au dessus du niveau du solvant.
-Laisser migrer jusqu'à ce que la phase mobile ait parcouru au moins les 4/5 de la hauteur
de la plaque.
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3.4-Révélation
4-Exploitation
III-Dosage du lactose dans le lait par méthode enzymatique en point final avec
un étalon unique
L’échantillon utilisé pour réaliser le dosage est le filtrat du lait cru après défécation.
2-Mode opératoire
ATTENTION : bien identifier la nature de l’échantillon qui sera à placer dans chaque cuve.
Questions :
-Quel est le rôle de la β galactosidase utilisée dans le protocole ?
-Sachant que la solution réactionnelle utilisée est la même que celle de la séance précédente
(kit de dosage Glucose RTU), écrire les équations de réactions successives qui se déroulent
lors de ce protocole.
-Ce dosage est une méthode enzymatique dit en « point final ». Expliquer cette notion.
-Faire un logigramme schématique résumant la manipulation, en partant de l’étape de
défécation préliminaire, jusqu’au dosage spectrophotométrique final.
-Pour chacun des essais, calculer la concentration massique en lactose dans le filtrat, puis
dans le lait cru.
-Comparer la concentration massique en lactose du lait obtenue expérimentalement et le
résultat théorique attendu.
Saccharose
H2C OH
Galactose
O
H2C OH
OH OH O
H
OH OH
OH
OH
O
CH2OH O
OH
OH
CH2OH
Tyrosine
OH
O
H2N CH C OH
Glucose
CH2
H2C OH
OH
OH OH
OH OH
Lactose
Arginine
O
H2N CH C OH
CH2
CH2
CH2
NH
C NH
NH2