RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

UNIVERSITÉ HADJ LAKHDAR- BATNA 1

INSTITUT DES SCIENCES VÉTÉRINAIRES ET DES SCIENCES AGRONOMIQUES
DÉPARTEMENT DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE

Module : controle microbiologique des aliments

TP n°01:
Détection et dénombrement de
Pseudomonas aeruginosa dans l’eau de
robinet après filtration sur membrane

Nom et prénom : Nom et prénom du prof chargé du TP:

Djennane Douaa Roquia Mme. Messaoudi A
Dernouni Meyssem Dorsaf

Année universitaire:
2023/2024
Plan de travail

Introduction

objectif

materiels et réactifs

mode opératoire

interprétation

conclusion
 Introduction
La détection et le dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans l'eau de robinet revêtent
une importance cruciale pour garantir la sécurité sanitaire de cette ressource essentielle. P. aeruginosa,
une bactérie Gram-négative, est reconnue pour sa résistance aux traitements conventionnels et sa capacité
à proliférer dans des environnements aqueux. Ces caractéristiques font de cette bactérie un indicateur
pertinent de la qualité microbiologique de l'eau potable.
La méthode de détection après filtration sur membrane est largement employée dans le domaine scientifique
pour évaluer la présence de P. aeruginosa. Cette approche repose sur la concentration des microorganismes
présents dans un échantillon d'eau sur une membrane filtrante, suivie d'une culture sélective permettant
d'identifier et de quantifier ces bactéries pathogènes.
Cette brève introduction souligne l'importance de la détection précoce et précise de P. aeruginosa dans l'eau de
robinet, mettant en évidence l'efficacité de la méthode de filtration sur membrane dans cette démarche. Une telle
approche s'avère essentielle pour prévenir les risques potentiels pour la santé humaine liés à la contamination de
l'eau par cette bactérie opportuniste.

Détecter et dénombrer Objectif

l’espèce Pseudomonas Réaliser des analyses
aeruginosa dans l’eau de fiables pour évaluer la
robinet après filtration sur qualité de l'eau potable.
membrane Acquérir des
compétences pratiques en
surveillance
microbiologique

Matériels
membrane filtrante Rampe de filtration Tubes à essai Lampe UV

Étuve bactériologique Pipettes Pasteur Pipettes Pasteur Papier filtre

Lampe à souder Boites de Pétri Pince Brucelle Portoir tube à essai

Reactifs:
Thiosulfate de sodium

Réactif de l’oxydase (N-diméthylparaphénylène diamine)

Gélose cétrimide

Gélose King B

Bouillon d’acétamide
Préparation des Mode opératoire
bouteilles de
prélevement
on doit préparé les bouteilles de prélevement

pour la préparation des bouteilles on doit identifier la quantité nécéssaire

de thioculfate de sodium

on doit tout d’abord identifier le volume de la bouteilles , dans ce cas le volume de la

bouteille est 180ml

on sait que avec 17,5 mg de thioculfate de sodium on ajoute 1000ml d’eau , en utilisant la règle de 3 on trouve
que :

Alors:

donc on pèse 3,15mg de thioculfate de sodium puis on la verse dans le flacon de prélevement

on ajoute 3/4 de l’eau et on agite afin de bien homogéniser la solution

on verse le reste de l’eau jusqu’au bout ,nos bouteilles de prélevement sont prete

Schema
Méthode de
Mode opératoire
prélèvement
Prélèvement à partir d'un robinet du laboratoire pédagogique.

Préparation rigoureuse de l'opérateur: lavage des mains, décontamination

à l'alcool.

Flambage du robinet avec une lampe à souder portative pour éliminer toute contamination
potentielle.

Pré-écoulement de l'eau pendant 3 à 5 minutes avant le prélèvement pour eliminer l’eau stagnate dans les
tuyaux et assurer que l’echantillon et de notre source

Utilisation d'un flacon préalablement stérilisé par autoclavage contenant 17,5 mg/l de thiosulfate de sodium
pour neutraliser le chlore résiduel

Remplir le flacon de prélèvement aseptiquement tout en maintenant la lampe à souder allumée.

Fermeture hermétique du flacon après le prélèvement

Garantie de conditions aseptiques pour un prélèvement fiable d'échantillon d'eau de robinet

Filtration sur Mode opératoire
membrane
Filtration sous-vide de 100 ml d'échantillon à travers une
membrane stérile en cellulose-nitrate, porosité 0,45 μm, diamètre
47 mm.

Retrait immédiat des membranes filtrantes avec des pinces stériles.

Placement instantané des membranes sur la gélose cétrimide pour détection sélective
et dénombrement de P. aeruginosa

Incubation des boîtes de Pétri à 37°C pendant 48 heures.

Avantages de cette techniques

Concentration Microbienne : Filtration permet la concentration des microorganismes, améliorant la

sensibilité de la détection.
Sélectivité : La membrane filtrante (porosité 0,45 μm) sépare les bactéries des autres particules,
assurant une analyse spécifique.
Asepsie Renforcée : Utilisation d'une rampe autoclavable et respect des règles d'asepsie
minimisent les risques de contamination.
Facilité d'Application : Technique simple pour traiter des volumes importants
d'échantillon.
Compatibilité avec la Gélose : Les membranes peuvent être directement placées sur la
gélose pour la croissance sélective.
Gain de Temps : Procédure rapide avec retrait immédiat des membranes, préservant la
viabilité des microorganismes.
Dénombrement Mode opératoire
des colonies
Le nombre présumé de Pseudomonas aeruginosa est déterminé par le dénombrement des colonies
caractéristiques observées à la surface des membranes de filtration après la période d'incubation. Les critères de
confirmation diffèrent en fonction de la pigmentation des colonies obtenues :
Colonies avec pigmentation bleu-vert (pyocyanine) :
Considérées comme Pseudomonas aeruginosa confirmées.
Colonies avec couleur brun rougeâtre ou fluorescence sous rayonnement ultraviolet :
Nécessitent une confirmation supplémentaire.
La confirmation des colonies présentant une fluorescence s'effectue en utilisant le bouillon d'acétamide.
Pour les colonies avec pigmentation brun-rougeâtre, la confirmation requiert l'utilisation du bouillon
d'acétamide, le test oxydase, et le milieu de King B. Ces méthodes complémentaires garantissent une
identification précise de Pseudomonas aeruginosa en distinguant les caractéristiques spécifiques de chaque
colonie.

Dessin
Confirmation Mode opératoire
Ensemencement sur Gélose Nutritive : Toutes les colonies nécessitant une confirmation sont transférées
et ensemencées sur des plaques de gélose nutritive.
Post-Incubation : Après incubation, les cultures dépourvues de fluorescence initiale subissent le test
d'oxydase. Les cultures oxydase positives sont ensuite soumises au test de production de fluorescéine. De
plus, elles sont examinées pour évaluer leur capacité à générer de l'ammoniac en utilisant le bouillon
d'acétamide.
Fluorescence Initiale : Les cultures initialement fluorescentes sont testées pour leur capacité à produire de
l'ammoniac à partir d'acétamide.
Colonies Brunes-Rougeâtres : Les colonies présentant initialement une pigmentation brun-rougeâtre
subissent le test d'oxydase.
Ces étapes permettent une confirmation approfondie des caractéristiques de chaque colonie. Les tests
successifs, incluant l'oxydase, la production de fluorescéine, et la capacité à générer de l'ammoniac à partir
d'acétamide, assurent une identification précise de Pseudomonas aeruginosa, distinguant les différentes
réponses biochimiques et physiologiques de ces microorganismes.

Test oxydase
Le test de l'oxydase est employé pour détecter la présence de l'enzyme cytochrome oxydase chez les bactéries à
Gram négatif, telles que Pseudomonas. La procédure est la suivante :

Réactif d'Oxydase : Verser 2 à 3 gouttes du réactif pour la recherche de l'oxydase sur un morceau de papier-
filtre préalablement placé sur une lame propre.
Prélèvement de la Culture : À l'aide d'une pipette Pasteur ou d'une anse en plastique (éviter le Nichrome),
prélever une partie de la culture bactérienne.
Application sur le Papier-Filtre : Frotter délicatement la culture prélevée sur le papier-filtre, qui a été
préalablement imprégné par le réactif d'oxydase (N-diméthylparaphénylène diamine).

Ce test révèle la présence de l'enzyme cytochrome oxydase, indiquée par un changement de couleur du papier-
filtre, et permet ainsi d'identifier les bactéries à Gram négatif, telles que Pseudomonas, qui présentent cette
caractéristique enzymatique. La méthode est simple et rapide, fournissant une indication préliminaire de la
nature des microorganismes présents dans la culture.
 Interpretation
Réaction Positive (Présence de Cytochrome Oxydase) :

Observation :
Une réaction positive se manifeste par un
changement de couleur du papier-filtre,
passant d'une teinte incolore à un bleu-
Interprétation : pourpre foncé dans les 15 secondes suivant
La présence du cytochrome oxydase est l'application du réactif.
indiquée par ce changement de couleur
caractéristique. Le cytochrome oxydase est
une enzyme impliquée dans la chaîne Réaction Négative (Absence de Cytochrome Oxydase) :
respiratoire des bactéries à Gram négatif.
Dans le contexte du test d'oxydase, cela
suggère la probable présence de bactéries à Observation :
Gram négatif, dont Pseudomonas. Aucun changement significatif de couleur
n'est observé après l'application du réactif
sur le papier-filtre.
Interprétation :
L'absence de changement de couleur indique
une réaction négative. Cela suggère que
l'enzyme cytochrome oxydase n'est pas
présente dans la bactérie testée. Cette
réaction est typique des bactéries à Gram
positif.

L'interprétation des résultats du test d'oxydase permet une première distinction entre les deux grands groupes
de bactéries en fonction de leur réaction biochimique. Dans le cas spécifique de Pseudomonas, une réaction
positive est cohérente avec les caractéristiques des bactéries à Gram négatif, fournissant ainsi une indication
préliminaire de la nature de la bactérie testée.

Schema
Milieu de King B
La démarche détaillée pour la confirmation des colonies brunes-rougeâtres
avec une oxydase positive sur le milieu de King B est la suivante :
Ensemencement sur Milieu de King B (Gélose Inclinée en Tube) :
Utiliser une technique aseptique pour transférer les colonies brunes-rougeâtres oxydase positives sur des
tubes contenant le milieu de King B (gélose inclinée en tube).
S'assurer d'une distribution uniforme des colonies sur la surface inclinée du milieu.
Incubation à 36 ± 2°C pendant Cinq Jours :
Placer les tubes ensemencés dans un incubateur réglé à une température de 36 ± 2°C.
Incuber les tubes pendant une période maximale de cinq jours, permettant la croissance et le développement
des colonies sur le milieu de King B.
Examen Quotidien sous Lampe UV (Longueur d'Onde de 360 ± 20 nm) :
Examiner quotidiennement les tubes ensemencés sous une lampe UV avec une longueur d'onde de 360 ± 20
nm.
Rechercher toute fluorescence éventuelle émise par les colonies sur le milieu de King B.

Schéma
 Interpretation
Absence de Fluorescence (Résultat Négatif) :

Observation :
Interprétation : Aucune fluorescence n'est détectée sous la
L'absence de fluorescence indique un lampe UV après les cinq jours d'incubation
résultat négatif. Cela suggère que les
colonies brunes-rougeâtres initialement
oxydase positives sur le milieu de King B ne
présentent pas la capacité de produire de la
pyocyanine, émettant une fluorescence. Par
conséquent, elles ne sont probablement pas
Présence de Fluorescence (Résultat Positif)
Pseudomonas aeruginosa.

Observation :
Une fluorescence est observée sous la lampe
UV au cours des cinq jours d'incubation.

Interprétation :
La présence de fluorescence indique un résultat positif. Cela
suggère que les colonies brunes-rougeâtres initialement oxydase
positives sur le milieu de King B ont la capacité de produire de
la pyocyanine, caractéristique de Pseudomonas aeruginosa. La
fluorescence résulte de l'émission de pyocyanine lorsqu'elle est
exposée à une lumière ultraviolette.

La confirmation de la fluorescence est une indication spécifique de la présence de Pseudomonas

aeruginosa, car cette bactérie est connue pour produire de la pyocyanine, une molécule fluorescente.
Les résultats obtenus sous lampe UV corroborent les données des tests précédents, tels que le test
d'oxydase et la pigmentation brune-rougeâtre, renforçant ainsi la certitude de l'identification de
Pseudomonas aeruginosa.
ensemencement
L'ensemencement des bactéries Pseudomonas peut être réalisé à
l'aide de différentes techniques, notamment l'utilisation de milieux
de culture sélectifs et spécifiques. Voici une procédure générale
d'ensemencement et son interprétation :

Préparation de la Culture :
Prélever une culture bactérienne contenant les souches de
Pseudomonas à analyser.
Choix du Milieu de Culture :
Utiliser un milieu de culture sélectif tel que la gélose cétrimide qui favorise la croissance
des Pseudomonas.
Technique d'Ensemencement :
À l'aide d'une boucle ou d'une pipette stérile, déposer des échantillons de la culture bactérienne sur la
surface du milieu de culture.

Incubation :
Placer les plaques ou les tubes dans un incubateur réglé à la température optimale de croissance pour
les Pseudomonas, généralement autour de 37°C.

Colonies Caractéristiques :
Interpretation
Des colonies vertes à bleu-vert sur la gélose cétrimide sont souvent indicatives de Pseudomonas aeruginosa. La
pigmentation résulte de la production de pyocyanine par ces bactéries.
Confirmation Biochimique :
Pour une confirmation plus poussée, des tests biochimiques supplémentaires peuvent être effectués. Cela peut
inclure des tests d'oxydase, des tests de production de fluorescéine, et l'utilisation de milieux de culture
spécifiques tels que le milieu de King B.
Analyse des Caractéristiques Morphologiques :
La morphologie des colonies, la texture, la forme, et d'autres caractéristiques macroscopiques peuvent également
contribuer à l'identification.
Comparaison avec des Normes :
Comparer les résultats obtenus avec des normes microbiologiques ou des caractéristiques spécifiques de
Pseudomonas pour confirmer l'identité de la bactérie.

En résumé, l'ensemencement et l'interprétation des bactéries Pseudomonas impliquent l'utilisation de milieux

sélectifs, l'observation des caractéristiques de croissance, et éventuellement des tests biochimiques pour une
identification précise.
 Conclusion

Suite à l'ensemencement des bactéries Pseudomonas sur un milieu sélectif tel

que la gélose cétrimide, les observations des colonies ont révélé des
caractéristiques distinctives, notamment une pigmentation verte à bleu-vert.
Ces résultats sont cohérents avec les propriétés typiques de Pseudomonas
aeruginosa, démontrant ainsi la présence présumée de cette bactérie.
La confirmation de l'identité de Pseudomonas aeruginosa a été renforcée par
des tests biochimiques complémentaires, tels que le test d'oxydase et l'utilisation
du milieu de King B. Ces tests ont permis de corroborer les caractéristiques
morphologiques des colonies et ont contribué à établir de manière plus précise
l'identification de Pseudomonas aeruginosa.
L'ensemble de ces résultats suggère de manière concluante la présence de
Pseudomonas aeruginosa dans l'échantillon analysé, offrant des informations
essentielles pour évaluer la qualité microbiologique de l'environnement étudié.
Cependant, une interprétation complète et définitive nécessiterait une analyse
plus approfondie et la comparaison avec des normes microbiologiques
spécifiques.
En conclusion, cette démarche méthodologique fournit une base solide pour
l'identification et la caractérisation des bactéries Pseudomonas dans un contexte
microbiologique.