PROCÉDURE OPÉRATIONNEL STANDARD

Doc. No .
Control Copy No Service de Laboratoire:
Version No.: 01 COPROCULTURE
Revision No.: 00 BACTERIOLOGIE
Page 1 of
Written by: Reviewed by: Approved by:

1.0 But
Assurer la procédure correcte, validée est suivi pour traiter des spécimens de coproculture et fournir des
résultats exacts, fiables et reproductibles qui ont l'utilité clinique.

1.1 Domaine d’applications:

Techniciens, stagiaires et Biologistes

2.0 Procedure

2.1 Principe
Ce mode opératoire décrit toutes les étapes effectuées lors de l’examen bactériologique des selles
visant à mettre en évidence des micro-organismes pathogènes responsables de diarrhées et
d’infections digestives (salmonelles, shigelles, certains Escherichia coli EPEC si enfant <2ans et EHEC
en fonction du contexte clinique et épidémique) ; les germes rares tels que Yersinia, Campylobacter,
Clostridium ne sont pas recherchés.

2.2 REACTIFS

Au réfrigérateur
1. Bouillon Müller Kauffman
2. Géloses :
Hektoen,
EMB (pour la recherche d’EPEC si enfant < 2ans)
Sabouraud au chloramphénicol (si nombreuses levures)
3. Eau physiologique
4. Eau distillée
5. Urée indole (prêt à l’emploi),
6. Galerie RAPID ONE

2.3 MATERIEL

1. Lame et lamelle
2. Etuve 37°C en aérobie
3. Oese stérile
4. Microscope optique
 COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 2 of 10

5. Flacon (pot) à coproculture

6. Bec Bunsen
7. Vortex

2.4 PROTOCOLE

2.4- 1 Types de prélèvements

 Selles fraîchement émises au laboratoire dans un pot propre

 Patient sans traitement d’antibiothérapie, sinon signaler.
 Analyse sans délais.

2.4- 2 Réalisation de l’examen

 J1 Premier jour

 Adulte ou enfant de plus de deux ans et contexte par défaut :

 Réalisation d’une coproculture standard comprenant la recherche de

Salmonella spp, de Shigella spp.

 Enfant de moins de deux ans :

 Réalisation d’une coproculture standard avec recherche supplémentaire des

E. coli entéropathogène

a) Examen macroscopique

 Editer la fiche paillasse

 Noter sur la fiche paillasse :
Consistance : Liquide, glaireux,…
 Préparer des suspensions de selle : eau physiologique (1) et Müller Kaufmann (2)

Un empois de selle ou 1
ml de selle liquide dans Un empois de selle ou 1
10 ml eau physiologique ml de selle liquide dans
stérile (1) bouillon Müller
Kaufman

(2)
 COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 3 of 10

 Vortexer les suspensions.

 Prendre quelques µl et réaliser un frottis sur une lame à partir de suspension

b) Examen microscopique

 Faire un état frais entre lame et lamelle

- Recherche de leucocytes
- D’hématies
- De parasites (amibes, helminthes)
- De levures et filaments mycéliens

 Puis effectuer une coloration de Gram

 Après coloration, poser une goutte d’huile sur la lame sèche, et l’observer au
microscope _ objectif ×100 :

- recherche de leucocytes (en cas de diarrhée à germes invasifs)

- apprécier la coproflore : % bactéries Gram négatif / % bactéries Gram positif
NB : la flore est déséquilibrée lorsqu’un % est >70

c) Ensemencement de milieux de culture (J1)

 Allumer le bec bunsen
 Identifier et dater les milieux de culture suivants :

 1 milieu différent pour chaque prélèvement

 A l’aide d’une oese stérile, prélever quelques µl de la suspension.

Ensemencement

EMB
Hektoen 3 Sabouraud  2ans

Si levures+++
 COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 4 of 10

 Ensemencer les boîtes en utilisant la technique de cadran

 Refermer et incuber les boites à 37°C en milieu aérobie pendant 24 heures.

1. La boîte Hektoen N°1(Hkt 1)

2. Le bouillon Müller Kaufman

(J2) Deuxième jour

Lecture des boites et repiquage du bouillon Müller Kaufman sur une 2ème gélose Hektoen (Hkt 2)
A- Repiquage du bouillon Müller Kaufman :
B-
 Sortir de l’étuve le bouillon Müller Kaufmann
 Identifier une gélose Hektoen par le même N° d’identification que la première en
précisant REP (repiquage)
 A l’aide d’un öese de 10µL, repiquer systématiquement le milieu d’enrichissement
Müller Kaufman sur gélose Hektoen2 (technique cadran).

Repiquage- bouillon
Müller Kaufmann
Sur 2ième G. Hektoen

 Refermer la boîte Hektoen, incuber dans l’étuve à 37°C pendant 24 heures.

B)- Lecture des milieux de culture (J1),

b.1 Sur Hektoen Recherche de Salmonella et de Shigella

Identifier les colonies suspectes :

- Colonies Vertes - bleues (Lactose- / Saccharose -) : Suspicion Shigelles

- Colonies avec centre noir (H2S +) : Suspicion Salmonelles

 COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 5 of 10

b.2 Recherche urée- indole

o Prendre 3 à 5colonies bien isolées suspectes / boîte une colonie / urée.

Colonies suspectes  3 à 5 urées…/ boîte

Incuber 3h, à 37°C.

Urée (-) ; Urée (+) ; Eliminer et arrêter l’ID°

 ID° / galerie RAPID ONE (=identification)
COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 6 of 10

Recherche de E. Coli EntéroPathogène EPEC

(chez le nourrisson moins de 2 ans)

b.3 Sur gélose EMB

EMB

Présence de colonies à Absence de colonies à

éclat métallique éclat métallique

Identification biochimique
Si E.coli Recherche d’agglutination sur une Noter sur la fiche
lame propre. Cf POS groupage des paillasse ; Absence EPEC
E.coli

Une goutte anti- sérum nonavalent

Etaler une colonie, et mélanger avec

l’antisérum

Agglutination

+ -

Mélange IV, puis anti-sérum trivalent 1, 2 et 3

Antibiogramme : ATB Entérobactéries

( +) ( -)
 COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 7 of 10

Noter sur la feuille paillasse

Présence d’EPEC :
E. Coli Entéropathogène

(J3) : Troisième jour

COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 8 of 10

 Lecture du repiquage (milieu HEKTOEN), et recherche urée- indole

systématique.
 Lecture galerie RAPID ONE

Remarques

 Envoyer uniquement la souche Salmonelles* au CPC pour sérotypage

Salmonelles / galerie réduite

Faire Antibiogramme ATB :

Voir ATB enterobactéries

Confirmer, Identifier la souche

sur RAPID ONE

Incubations à 37°C, en aérobie pendant 24

heures

Non Oui
Salmonella sp

Absence de Salmonella et de Envoyer la souche au CPC

Shigella (Sur Gélose ordinaire)
Voir le Biologiste

 Transcription des résultats : dans le registre.

 Transcription dans l’ordinateur
 COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 9 of 10

3.0 - REGLES D’HYGIENE ET DE SECURITE

Elimination des déchets selon la procédure pour les déchets infectieux et/ou souillés par des
liquides biologiques

4.0- RESULTATS

Saisie des résultats complets par la secrétaire médicale,

5.0- INTERPRETATION DES RESULTATS

Interprétation et Validation biologique par la Biologiste.

6.0- ENREGISTREMENT

Le registre de paillasse constitue une forme d’archivage.

Les données sont aussi conservées sous forme informatisée

7.0 BIBLIOGRAPHIE

REMIC 2007.
Précis de bactériologie : François Denis 2007
Etude cytobactériologique des produits de Guy Leyral 3 ième édition
Précis de Bactériologie clinique : Jean Freney 2007
COPROCULTURE
Procedure Operation Standard POS-PST-02 Version: 01 Page 10 of 10

DOCUMENT ATTESTATION RECORD

J'ai lu et compris le (POS-PST-02) sur COPROCULTURE

SN NAME SIGNATURE DATE