Chapitre III : Matériel et Méthodes

I- Matériel biologique
I.1. Les souches
Les souches utilisées dans le présent travail proviennent de différents prélèvements
cliniques du CHU de Constantine et Oum El Bouaghi (Ain fekroune, Oum El Bouaghi, Ain
M’lila) et Il s'agit de :
- 24 souches bactériennes à Gram négatif : Escherichia coli. Klebsiella spp, Klebsiella
pneumonia, Enterobacter, Morganella morgane, Salmonella et Pseudomonas aeruginosa
- 6 souches à Gram positif : Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis.
11 souches de référence ATCC (Américan Type Culture Collection) à GRAM positif et
négatif sont aussi testées au cours de notre études.
Tableau 03 : Souches d’isolement clinique testées au cours de notre étude
Bactérie Nombre des souches L ie u
Bactéries à GRAM négatif

Ain fekroune : 3 souches

Escherichia coli 12 Oum el bouaghi : 4 souches
Ain M’lila : 3 souches
Constantine : 2 souches
Klebsiella spp 1 Ain fekroune

Klebsiella pneumonia 1 Oum el bouaghi

Enterobacter 4 Oum el bouaghi 3 souches
Ain M’lila : 1 souche
Salmonella 2 Oum el bouaghi 2 souche

Morganella morganii 1 Ain fekroun 1souche

Ain fekroun 1souche

Pseudomonas 3 Constantine : 1 souche
Oum el bouaghi 1 souche
Bactéries à GRAM positif

Ain mlila 1souche

Ain fekroun 1souche
Staphylococcus aureus 4
Constantine : 1 souche
Oum el bouaghi 1 souche
Enterococcus 2 Ain fekroun 1souche
Oum el bouaghi 1 souche

22
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Tableau 04: Souches de référence ATCC testées au cours de notre étude

Souche ATCC Nombre Code Hôpital

E. coli 2 25922

Citrobacter 1 AR
Klebsiella pneumonie 2 MF(700603)

Enterobacter 1 AR

Constantine
P. aeruginosa 1 MF

P. aeruginosa 1 27853

Staphylococcus aureus 2 252923

Bacillus subtilus 1

I.2. Propolis
La propolis étudiée est d’origine de JIJEL. L’extrait éthanoïque de la propolis (EEP) est
réalisé au niveau du laboratoire de phytopharmacologie du département de biologie Université
de Jijel.
II- Repiquage et identification des souches
II.1. Repiquage
Les souches sont repiquées sur leurs milieux sélectifs :
 Milieu Hektoen pour la revivification et l’isolement les Entérobactéries ;
 Milieu de Chapman pour la revivification et l’isolement des Staphylococcus ;
 Une gélose nutritive pour la revivification des souches de Pseudomonas et
Bacillus.

23
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Après 24 h incubation on note les caractères macroscopiques des colonies. Un échantillon
de chaque type de colonie est prélevé ensuite purifié par repiquage successif selon la méthode de stries.

II.2. Identification des souches

En plus de l’examen macroscopique des souches sur leurs milieux sélectifs les souches
sont soumises à des examens microscopiques et identifications biochimiques.

II.2.1. Examen microscopique

Cet examen permet la mise en évidence des caractères morphologiques (forme cellulaire et mode de
regroupement ainsi que la mobilité bactérienne) et de différencier le type de Gram (positif ou négatif).
a) Observation à l’état frais
Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et surtout la mobilité des bactéries. Il consiste en
l’observation d’une goutte de suspension bactérienne placée entre lame et lamelle.
b) Coloration de Gram
C’est la coloration de base en microbiologie elle permet de distinguer entre les deux
grand groupes bactériens GRAM positif et GRAM négatif ainsi que la forme cellulaire
(bacille ou cocci) et le mode de regroupement.
A l’issue de cette coloration on peut distinguer : Les bactéries dites « Gram Négatives »
apparaissent roses tandis que les bactéries dites « Gram Positives » sont colorés en bleu
foncé/violet.

II.2. 2. Identification biochimiques

Le profil biochimique d’une bactérie rend compte de l’étendue et, éventuellement, de la

spécificité du métabolisme de la souche considérée.

C’est un élément majeur dans son identification, il est réalisé en complément d’analyse
aux étapes précédentes pour caractériser son phénotype. En principe, il finalise l’identification
de l’espèce.

A. Tests métaboliques préliminaires

Divers tests métaboliques, dits préliminaires, peuvent se justifier par les indications
précieuses d’identification qu’ils peuvent donner.

24
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Ces tests sont basés sur la mise en évidence rapide d’un caractère métabolique
fortement discriminant. Parmi ces tests on a appliqué deux pour les souches de
Staphylooques.
A.1. Catalase

C’est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies et des bactéries aérobies
anaérobies facultatives. Elle a le rôle essentiel d’éliminer, dés sa formation chez les bactéries, le
peroxyde d’oxygène H2O2, composé très toxique immédiatement hydrolysé en eau et oxygène.

Le test consiste à mettre du matériel bactérien, prélevé par une anse métallique dans une
goutte de peroxyde d’hydrogène déposée sur une lame de verre. La présence de catalase
s’exprime aussitôt par un dégagement gazeux (O2) aisément discernable.
A.2. Coagulase

Ce test, spécifique des Staphylocoques, permet de déterminer les souches «coagulase _

positive ».

Les coagulases, dont certaines sont libérées dans le milieu, ont la propriété de coaguler
le plasma sanguin. Ce dernier, ajouté d’un anticoagulant pour éviter sa coagulation spontanée
et naturelle, est mélangé dans un tube à une culture de 18 à 24 h de la souche de
staphylocoques testée. Il est examiné après incubation pour constater la formation éventuelle
du caillot de coagulation provoqué par les souches positives.

A partir d’une culture de staphylocoques sur bouillon cœur cervelle on prélève 5

gouttes auxquelles on ajoute 5 gouttes de plasma oxalaté et on incube à 37°C pendant 30
min à 1 h.
Une prise en masse du mélange indique la présence de la Sptaphylocoagulase.
B. Galerie classique IMVIC

Ils forment une gamme de 4 caractères biochimiques (test de L’Indole, test au rouge de
Méthyle, test de Voges-proskauer et test au Citrate), particulièrement utilisés dans
l’identification des Entérobactéries.

25
Chapitre III : Matériel et Méthodes
B.1. Réaction de Voges-Proskauer VP
Elle permet de mettre en évidence la production d’acétoine (acétyl méthyl carbinol) à
partir du glucose. Cette voie fermentative définit le groupe des KES (Klebsiella,
Enterobacter, Serratia).

On réalise une suspension bactérienne en bouillon Clark et Lubs et on incube à 37°C.

Après 24h on ajoute VP1 et VP2 et on laisse agir pendant 10 à 15minutes.

En milieu alcalin, l’acétone se transforme en butandione qui réagit avec l’α-naphtol et

donne une coloration rouge (dont l’intensité est augmentée en présence de créatine)

 La réaction VP (+) : coloration en rouge ;

 Réaction VP (-) : aucun changement.

B.2. Test au rouge de méthyle (RM)

C’est un test qualitatif qui permet de distinguer les entérobactéries fortes productrices
d’acides mixtes (RM+) des bactéries faiblement productrices d’acides (RM-).

Le milieu utilisé est celui de Clarck et lubs. Après ensemencement et incubation à

37°C pendant 24h on ajoute 2 à 3 gouttes du réactif rouge de méthyl .

 (RM+) L’apparition d’une couleur rouge ;

 (RM-) L’apparition d’une couleur jaune.

B.3. Utilisation du Citrate de Simmons

Ce milieu ne contient qu’une seule source de carbone : le citrate. Seules les bactéries
possédant un citrate perméase seront capables de se développer sur ce milieu. L’utilisation du
citrate peut se traduira par une alcalinisation ou une acidification du milieu, plus ou moins
importante.

Citrate + 3 H2O → Acide citrique + 3OH-

Enzyme
Une bactérie sera citrate positif si elle alcalinise le milieu en utilisant le citrate. Cette
réaction est indiquée par le changement de couleur de l’indicateur de pH, le bleu de
bromothymol qui devient bleu.

26
Chapitre III : Matériel et Méthodes
C. Fermentation des sucres TSI

La gélose TSI (Triple Sugar Iron) permet l’identification des entérobactéries par la mise
en évidence rapide de la fermentation du lactose, glucose (avec ou sans production de gaz),
saccharose et de la production de sulfure d’hydrogène.
A partir d’une colonie suspecte prélevée sur un milieu d’isolement sélectif, on
ensemence le culot par piqûre centrale et la surface inclinée par des stries serrées.
Il est nécessaire d’utiliser des cultures pures prélevées au centre de colonies bien
isolées, sinon les réactions croisées rendent l’identification impossible à réaliser.
On incube à 37°C pendant 24 heures.
L’utilisation de l’un des sucres contenus dans le milieu se traduit par une acidification
(virage au jaune du rouge de phénol). Une alcalinisation se révèle par une coloration rouge
foncé. La production de sulfure d’hydrogène à partir du thiosulfate est mise en évidence par la
formation d'une coloration noire.
La gélose TSI fournit quatre renseignements principaux :
(1) Fermentation de glucose : Culot jaune : glucose fermenté ;
(2) Fermentation du lactose et/ou du saccharose : Pente inclinée jaune : lactose et/ou
saccharose fermenté(s) ;
(3) Production de gaz : Apparition de gaz dans le culot ;
(4) Formation d’H2S : Formation d’une coloration noire entre le culot et la pente ou le long
de la piqûre.
D. La Galerie API 20E

Le système API 20 E est une version miniaturisée et standardisée des techniques

biochimiques conventionnelles pour l’identification des bactéries. Elle permet l'identification
des Enterobacteriaceae et autres bacilles à Gram négatif non fastidieux (Francois Jehl,
2010).

D.1. Principe

La galerie API 20 E comporte 20 micro-tubes contenant des substrats déshydratés. Les

micro-tubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les tests. Les
réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés
spontanés ou révélés par l'addition de réactifs (Francois Jehl, 2010).

27
Chapitre III : Matériel et Méthodes
La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de lecture et l'identification est
obtenue à l'aide du Catalogue Analytique ou d'un logiciel d'identification.

D.2. Préparation de la galerie

Réunir fond et couvercle d'une boîte d'incubation et répartir environ 5 ml d'eau distillée
ou déminéralisée [ou toute eau sans additif ou dérivés susceptibles de libérer des gaz (Ex :
Cl2, CO2 ...)] dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide.

 Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte. (Ne pas inscrire
la référence sur le couvercle, celui-ci pouvant être déplacé lors de la manipulation) ;
 Sortir la galerie de son emballage ;
 Placer la galerie dans la boîte d'incubation (Francois Jehl, 2010).

D.3. Inoculation de la galerie

Introduire la suspension bactérienne d’une culture jeune (18-24 h) dans les tubes de la
galerie à l'aide d’une pipette (éviter la formation de bulles au fond des tubes, poser la pointe
de la pipette ou sur le côté de la cupule, en inclinant légèrement la boîte d'incubation vers
l'avant) :

 pour les tests CIT, VP et GEL, remplir tube et cupule.

 pour les autres tests, remplir uniquement les tubes (et non les cupules).
 pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE créer une anaérobiose en remplissant
leur cupule d'huile de paraffine (Francois Jehl, 2010).

Refermer la boîte d'incubation, Incuber à 36°C ± 2°C pendant 18-24 heures.

D.4. Résultats

• Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées.

• Réaliser les tests nécessitant l’addition de réactifs : Test VP, TDA, IND, Nitrate réductase…

D.5. Identification

• Avec le tableau d’identification : comparer les réactions notées sur la fiche de résultats avec
celle du tableau : chaque cellule de ce tableau contient les pourcentages de positivité.

28
Chapitre III : Matériel et Méthodes
• Avec le catalogue analytique : Les tests sont regroupés en groupe de 3, et une valeur (1, 2 ou
4) est indiquée pour chacun. Additionner à l’intérieur de chaque groupe les nombres
correspondants aux tests positifs.

On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code d’identification.

• Avec un logiciel d’identification ou avec un tableau.

Légende :

ONPG - Détermination de la présence de l’enzyme β-galactosidase.

ADH - Transformation de l’arginine (acide aminé) par l’arginine déshydrolase.

L DC - Transformation de la lysine (acide aminé) par la lysine décarboxylase.

ODC - Transformation de l’ornithine (acide aminé) par l’ornithine décarboxylase.

CIT - Utilisation du citrate comme seule source de carbone.

H2S - Production du sulfure d’hydrogène (H2S) à partir du thiosulfate (S2O3.

URE - Libération d’ammoniac à partir de l’urée grâce à l’uréase.

T DA - Formation de l’acide indolepyruvique à partir du tryptophane (acide aminé).

IND - Formation d’indole à partir du tryptophane (acide aminé).

VP - Pyruvate de sodium, Production d’acétoïne.

G EL - Liquéfaction de la gélatine (protéine).

GLU (glucose), MAN (mannitol), INO (inositol), SOR (sorbitol), RHA (rhamnose), SAC
(Sucrose), MEL (mélobiose), AMY (amygdaline), ARA (L+arabinose) - formation
d’acide à la suite de l’utilisation d’un hydrate de carbone.

Figure 04: LA GALERIE API 20E

29
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Tableau 05: tableau d’identification de la Galerie API 20 E (Francois Jehl, 2010).
TU BE REACTIONS
P O SI T I V E NÉ G A T I VE COMMENTAIRES
O NP G Jaune Incolore Lecture directe

ADH Rouge ou orange Jaune Lecture directe

L DC Rouge ou orange Jaune Lecture directe

ODC Rouge ou orange Jaune Lecture directe

C IT Turquoise ou Vert pâle ou Lecture directe

bleu foncé jaune

H 2S Dépôt noir Aucun dépôt noir Lecture directe

URE Rou g e ou or ang e Jaune Lecture directe

T DA B run -rou g e Jaune Lecture indirecte

Ajouter une goutte de
réactif chlorure de fer
III
IN D Anneau rouge Jaune Lecture indirecte
Ajouter une goutte de
réactif Kovacs

Lecture indirecte
Ajouter 1 goutte de
VP Rose foncé ou rouge Incolore ou rose pâle VP1 et VP2 Attendre
10 minutes
Aucune diffusion, Lecture directe
GEL Diffusion du pigment incolore
GLU SAC ARA
MAN MEL RHA Jaune Bleu ou bleu-vert Lecture directe
INO INO AMY
SOR
Lecture indirecte
GLU N2 gazeux (présence Ajouter 1 goutte de
de NIT1 et NIT2 et zinc
bulles) éventuellement

30
Chapitre III : Matériel et Méthodes

III- Etude l’antibiogramme des souches

L’antibiogramme est un examen bactériologie qui permet de trouver l’ensemble des

antibiotiques capables d’agir sur une bactérie déterminée. Il permet de déterminer
l’antibiotique le plus adapté pour lutter contre le microbe (R.Perrier.,T.Auffrel Van Der
Kemp., F.Zonszain, 1997).
III.1. Méthodes de diffusion sur milieu solide : antibiogramme standard

Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les
laboratoires de diagnostic (méthode de KIRBY BAUER recommandée par OMS) Comité de
l’antibiogramme de la société Française de Microbiologie (SFM), recommandation 2009.

Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la
surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à
étudier. Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien
que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après
incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une
absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des
zones d'inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe.

Trois catégories cliniques ont été retenues pour l’interprétation des tests de sensibilité in
vitro : Sensible (S), Résistant (R) et Intermédiaire (I).
A- Les souches catégorisées S : Sont celles pour lesquelles la probabilité de succès
thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie
recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP) (Philippe cruaud, 2003).

B- Les souches catégorisées R : Sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité
d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée.
(Burnichon Nelly, 2003).

C- Les souches catégorisées I : Sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est
imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus
in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique. (Philippe cruaud, 2003).

31
Chapitre III : Matériel et Méthodes
III.2. Réalisation de l’antibiogramme

III.2.1. Milieu

Milieu Muller Hinton coulé en boites de Pétri sur une épaisseur de 4 mm.

III.2.2. Inoculum
A partir d’une culture pure et jeune (18-24h) sur milieu gélosé non sélectif, prélever une
colonie des entérobactéries et Pseudomonas et deux colonies pour les Staphylocoques.

Transvaser dans un tube contenant 2,5 ml d’eau physiologique stérile à 0,9%.,

émulsionner les colonies et bien agir

Ajuster la densité de l’inoculum à celle de l’étalent 0,5 Mac Ferland ou a une D.O. de
0,08 a 0,10 lue a 625 nm. L’utilisation d’un densitomètre est fortement souhaitable (Tony
Hart et Paul Shears ; 1999)

III.2.3. Ensemencement

(Technique par écouvillonnage technique privilégiée par OMS et NCCLS National Comité for
Clinical Laboratory Standarts)

- Tremper un écouvillon stérile dans l’inoculum ;.

- L’essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du
tube, afin de décharger au maximum ;
- Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en
stries serrées ;
- Répéter l’opération 2 fois, en tournant la boite de 60° a chaque fois, sans oublier
de faire pivoter l’écouvillon sur lui-même. Finir l’ensemencement en passant
l’écouvillon sur la périphérie de la gélose.
- Dans le cas ou l’on ensemence plusieurs boites de Pétri, il faut recharger
l’écouvillon à chaque fois (Tony Hart et Paul Shears ; 1999).
III.2-4. Application des disques d’antibiotiques.
Il est préférable de ne pas mettre plus de 6 disques d’antibiotique sur une boite de 90
mm. Presser chaque disque d’antibiotique à l’aide de pinces bactériologiques stériles et ne pas
déplacer les disques après application. (Tony Hart et Paul Shears, 1999)

32
Chapitre III : Matériel et Méthodes

33
Chapitre III : Matériel et Méthodes
La liste des antibiotiques testés selon les bactéries isolées est représentée dans les
tableaux n° : (6, 7, 8, 9). (Standardisation de l’antibiogramme a l’échelle nationale
(médecine humaine et vétérinaire) 6eme édition 2011).

Tableau06 : les Antibiotiques testés pour les entérobactéries et les valeurs critiques des
diamètres des zones d’inhibition.

Les antibiotiques abréviation Charge des Diamètres critiques

testés disques
Résistant Intermédiaire Sensible

ß-lactamines :

Amoxicilline+ AMC 30µg < 13 14 -- 17 >18

Acide clavulanique

Ampicilline AMP 10µg <13 14 -- 17 >17

Cefotaxime CTX 30µg < 14 15 -- 22 >23

Imipeneme IPM 10µg < 13 14 -- 15 >16

Pénicilline G P 10µg < 13 ----- >20

Oxacilline OX 1µg < ----- >19

Cefazoline CZ 30µg < 14 15 -- 17 >18

Cefoxitine FOX 30µg < 14 15 -- 17 >18

Aminosides : GEN 10µg < 14 13 -- 14 >15

Gentamicine

Amikacine AK 30µg < 12 15 -- 16 >17

Quinolones :

Ciprofloxacine CIP 5µg < 15 16 -- 20 >21

Acide Nalidixique NA 30µg < 13 14--18 >19

Macrolides : E 15µg < 13 14 -- 22 >22

Erythromycine

Autres : C 30µg < 12 13 -- 17 >18

Chloramphenicol

Acide fucidique AF 10µg < 15 ----- >22

34
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Tableau07 : les valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition pour les Pseudomonas.

Les antibiotiques abréviation Charge des Diamètres critiques

testés disques
Résistant Intermédiaire Sensible

ß-lactamines :
Amoxicilline+ AMC 30µg < 13 14 -- 17 >18
Acide clavulanique

Ampicilline AMP 10µg <13 14 -- 17 >17

Cefotaxime CTX 30µg < 14 15 -- 22 >23

Imipeneme IPM 10µg < 13 14 -- 15 >16

Pipéracilline PIP 100µg < 17 ---- >18

Pénicilline G P 10µg

Aminosides :
Gentamicine GEN 10µg < 14 13 -- 14 >15

Amikacine AK 30µg < 12 15 -- 16 >17

Quinolones :
Ciprofloxacine CIP 5µg < 15 16 -- 20 >21

Acide Nalidixique NA 30µg < 13 14--18 >19

Lincosamides :
Lincomycine L 2µg < 14 15 -- 20 >21

Glycopeptides :
Vancomycine VA 30µg ---- ----- >17

35
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Tableau08 : les valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition Staphylococcus aureus.

Les antibiotiques abréviation Charge des Diamètres critiques

testés disques
Résistant Intermédiaire Sensible

ß-lactamines :
Penicilline G P 10µg < 28 ----- >29

Oxacilline OX 1µg <10 11 -- 12 >13

Cefoxitine FOX 30µg < 21 ----- >22

Aminosides :
Gentamicine GEN 10µg < 14 13 -- 14 >15

Amikacine AK 30µg < 12 15 -- 16 >17

Quinolones :
Ciprofloxacine CIP 5µg < 15 16 -- 20 >21

Acide Nalidixique NA 30µg < 13 14--18 >19

Macrolides :
Erythromycine E 15µg < 13 14 -- 22 >23

Lincosamides :
Lincomycine L 2µg < 14 15 -- 20 >21

Glycopeptides :
Vancomycine VA 30µg ---- ----- >17

Autres :
Chloramphenicol C 30µg < 12 13 -- 17 >18

36
Chapitre III : Matériel et Méthodes
Tableau09 : les valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition pour les Enterococcus.

Les antibiotiques abréviation Charge des Diamètres critiques

testés disques
Résistant Intermédiaire Sensible

ß-lactamines :
Amoxicilline+ AMC 30µg < 13 14 -- 17 >18
Acide clavulanique

Ampicilline AMP 10µg <13 14 -- 17 >17

Cefotaxime CTX 30µg < 14 15 -- 22 >23
Imipeneme IPM 10µg < 13 14 -- 15 >16
Penicilline G P 10µg < 13 ----- >20
Oxacilline OX 1µg ------ ----- >19
Cefoxitine FOX 30µg < 14 15 -- 17 >18
Pipéracilline PIP 100µg < 17 ---- >18

Aminosides :
Gentamicine GEN 10µg < 14 13 -- 14 >15

Amikacine AK 30µg < 12 15 -- 16 >17

Quinolones :
Ciprofloxacine CIP 5µg < 15 16 -- 20 >21

Acide Nalidixique NA 30µg < 13 14 -- 18 >19

Macrolides :
Erythromycine E 15µg < 13 14 -- 22 >22

Lincosamides :
Lincomycine L
2µg < 14 15 -- 20 >21

Glycopeptides : VA 30µg < 14 15 -- 16 >17

Vancomycine
Acide fucidique AF 10µg < 15 ----- >22
Autres :
Chloramphenicol C 30µg < 12 13 -- 17 >18

37
Chapitre III : Matériel et Méthodes
III.2-5. Incubation

L’incubation est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures en aérobiose dans une
atmosphère normale.

IV- Etude in vitro de l’activité antimicrobienne de la propolis

IV.1. Disques de la propolis

Les antibiotiques habituellement testés existent sous forme des disques de 6 mm de

diamètre, et pour fournir les mêmes conditions, les disques de la propolis sont préparés par
papier Wattman N°3 coupé en disques de 6 mm puis stérilisés en procédant un autoclavage
pendant 20 min à 120°C dans une boite de pétri en verre contenant 10 ml d’eau distillée.

Les disques du papier Wattman sont déposés à l’aide d’une paire de pince stérile en
appuyant doucement sur chaque disque pour assurer un contact uniforme avec le milieu.
Un volume de 10 à 15µl de la propolis ou sa dilution (1/10) est déposé sur chaque disque.
Pour les essais des activités antibactériennes nous avons utilisé la technique de diffusion en milieu
gélosés de Muller Hinton en boites de Pétri (même technique avec antibiotiques).
IV.2. Lecture des résultats :

La lecture est faite après 18-24h d’incubation. On mesure et on note le diamètre de

chaque zone d’inhibition en mm et qui peut être symbolisé par des croix : on considère
respectivement comme souche résistante (-), sensible (+), très sensible (+ +), extrêmement
sensible (+ + +).

38