Dr. F.

BOUBRIT 2022-23
Diagnostic bactériologique

Introduction
- Le diagnostic bactériologique est un ensemble de techniques permettant de rechercher et de confirmer
l’étiologie bactérienne d’un syndrome donné.
- Deux méthodes de diagnostic sont utilisées.
- Le diagnostic direct : permet la MEE de tout ou une partie de la bactérie (antigènes spécifiques, génome).
- Le diagnostic indirect : permet la détection de marqueurs biologiques (réponse humorale ou cellulaire) témoins
de la multiplication bactérienne dans l’organisme.
- Analyses effectuées en suivant les phases suivantes :
 Phase pré-analytique :
 Prescription et renseignements cliniques : NB : BIEN ETIQUETER LES PRELEVEMENTS !
 Prélèvement (transport, conservation)
 Phase analytique
 Phase post-analytique : expression, interprétation et transmission des résultats
- Procédures écrites et contrôles de qualité

I) DIAGNOSTIC DIRECT et PRELEVEMENTS

- La qualité du prélèvement est très importante, d’où des contraintes de :

 Aseptie : respect des conditions de stérilité
 Méthode :
 Prélèvement superficiel (seringue, curette, biopsie). Remarque : écouvillon à déconseiller (sauf pour
téguments et muqueuses)
 Prélèvement profond (jamais à l’écouvillon !)
 Les prélèvements sont différents selon le type d’infection suspectée.
1) Prélèvements dits « monomicrobiens »
Il peut s’agir soit :
a) D’un produit biologique normalement stérile :
- Sang (en cas de septicémie, plusieurs flacons d’hémoculture sont nécessaires),
- LCR (en cas de méningites),
- Urines (en cas d’infections urinaires)
Dans ces cas, un seul type de germe est, en général, isolé.

b) D’un produit biologique issu d’une cavité néoformée ou préformée :

- Pus d’abcès fermé
- Empyème (amas de pus dans une cavité naturelle)
- Liquide de séreuse
Dans ces cas, un seul germe est responsable ou une association de germes peut être responsable de l’infection
(infection mixte).

2) Prélèvements dits « polymicrobiens »

Il peut s’agir soit :
a) D’un produit biologique possédant déjà une flore normale
- Selles ( Flore intestinale normale )
- Pharyngé
- Gynécologique
- Urétraux
- Expectoration
Dans ces cas, seuls certains types de germes sont recherchés parce que responsables de l’infection.

b) D’un produit biologique néoformé du à l’action associée de différents types de germes (infections
mixtes)
- Dans ce cas, tous les germes isolés doivent être identifiés, parce que probablement responsables de
l’infection.

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 - Fiche de renseignement : doit obligatoirement accompagner les prélèvements, elle doit être correctement
remplie :
 Nom, prénom, âge, provenance du prélèvement et son N° d'enregistrement du patient
 Un résumé clinique et le diagnostic évoqué
 Les traitements anti-infectieux en cours
 Toute information susceptible d'influencer l'analyse (état physiopathologiques, notion d'épidémie familiale,
notion de voyage...)
 En cas de recherches particulières (recherche d'anticorps, recherche virale …), le clinicien doit le mentionner.

- Transport : plus rapide possible :

 L'acheminement au laboratoire doit se faire SANS DELAIS.
 < 30 min pour LCR, liquides de ponction, prélèvement per-opératoires
 Sinon utilisation de milieux de transport (ex. : Portagerm™)

- Conservation : La température de conservation varie en fonction de :

 La nature du prélèvement
 La nature du germe suspecté
 Ex : le LCR doit être acheminé à température ambiante ou conservé à 35° jusqu’à analyse
 Les selles sont acheminées à température ambiante ou conservés à +4° maximum 24h jusqu’à analyse

A) Examen Direct :
- Aspect : clair, légèrement trouble, trouble, purulent, hématique, xanthochromique…
- Examen Microscopique :
 État frais (× 40) :
 Entre lame et lamelle : morphologie et mobilité des germes
 En cellule de Malassez : numération des éléments blancs et hématies (μl ou ml) pour liquides de ponction,
urines
 Examen après colorations :
 GRAM (aspect morpho-tinctoriale), BM (peu utilisée), MGG (formule leucocytaire), Ziehl- Neelsen
(BAAR), imprégnation argentique (tréponèmes)
- Autres techniques :
 Immunologiques : immunofluorescence directe et indirecte (chlamydia, coxiella, BK)
 Examen à fond noir (treponema pallidum)

Intérêt de l’examen direct :

- Permet d’avoir des informations morpho-tinctoriales sur le germe, la richesse bactérienne, la présence de
cellules polynucléaires ou lymphocytaires.
- Oriente les recherches ultérieures pour le choix des milieux à ensemencer, les tests à lancer rapidement.
- Permet parfois de donner un diagnostic de forte présomption au clinicien qui peut commencer le bon traitement
immédiatement.
B) Culture et Isolement :
- Il s’agit de favoriser la croissance de l’agent pathogène en le mettant dans des conditions de nutrition et de
croissance optimales permettant de le rendre visible/détectable
- Différents types de milieux sont utilisés:(selon le germe suspecté)
 Milieux de base (GN)
 Milieux sélectifs (Chapman, hektoen)
 Milieux enrichis (GSC, GSF)
 Milieux d’enrichissement (SFM)
 Milieux chromogènes pour l’identification présomptive
- Conditions d’incubation :
 Température (37, 30 ou 42°)
 Tension d’oxygène : aérobie, anaérobie ou microaérophilie
 Tension de CO2 : 5%
 Durée d’incubation (18h, 24h, 48h, jours ou semaines)

- Certains germes sont cependant non cultivables sur les milieux usuels (ex Chlamydia qui cultive sur cultures
cellulaires) ou tout simplement non encore cultivables, ex : Treponema pallidum (inoculation a l’animal)
- La culture est la seule méthode permettant d’avoir un agent pathogène vivant apportant ainsi la preuve formelle
d’une infection évolutive. Elle permet en outre son identification précise et de tester sa sensibilité aux
antibiotiques
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C) Identification Phénotypique :
- L’étude microscopique (état frais et colorations constituent des étapes de l’identification)
- Caractères culturaux (morphologie, durée, conditions physiologiques)
- Tests biochimiques explorant le métabolisme glucidique, protidique et lipidique
- Tests explorant les conséquences du métabolisme : Détection de produits de dégradation métabolique ou
d’enzymes impliquées dans la réaction ou de témoins de l’activité d’une enzyme
- Etude antigénique : Étude des antigènes de groupe ou de type portés par la bactérie à l’aide de sérums
spécifiques connus par des réactions immunologiques d’agglutination ou de précipitation de l’antigène
bactérien par l’antisérum spécifique connu.
- Recherche des antigènes bactériens :
 Il s’agit de la recherche de fragments du corps bactérien libérés lors de sa lyse dans différents milieux
biologiques
 Cette recherche fait appel surtout à l’intéraction antigène-anticorps. La révélation de cette réaction se fait par
un substrat chromogène, une fluorescence ou par réaction d’agglutination
 Cette technique est réalisable en cas d’infection décapitée.

D) Biologie Moléculaire :
- Il s’agit de la recherche du génome d’une bactérie ou d’un groupe bactérien par différentes techniques dont la
base est la PCR
- Détection directe à partir de prélèvements par amplification génique (PCR)
- Identification de bactéries à partir de colonies
- Détermination de la sensibilité aux ATB : ex : Méthicilline chez S. aureus (S. aureus résistant à la Méthicilline
- SARM)
E) PCR :
- Principe : Amplification in vitro d’une séquence d’ADN double brin, par extension itérative de deux amorces,
située de part et d’autre de la région considérée, grâce à une ADN polymérase.
- La PCR est une succession cyclique de trois étapes :
 Dénaturation thermique : les deux brins d’ADN sont séparés par élévation de la température (94°C)
 Hybridation des amorces : une amorce sens et une amorce anti sens vont s’hybrider sur les brins d’ADN et
délimitent ainsi la séquence à amplifier. La température réactionnelle doit être < TM des amorces pour
permettre leur hybridation (40-70 °C).
 Elongation : La Taq polymérase (ADN polymérase ADN dépendante) incorpore les désoxynucléotides
complémentaires à la matrice. Cette réaction a lieu dans le sens 5’ 3’ à une température de (72°C)

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F) Interprétation :
- Lecture et interprétation des résultats : tenir compte :
 Du type de prélèvement (mono ou poly microbien)
 Du malade et de l’histoire clinique
 Du contexte épidémiologique
- Le diagnostic de certitude : bactériologie :
 Une diarrhée aigüe = Typhoïde si isolement de S. typhi
 Pneumopathie = Tuberculose si isolement de M. tuberculosis
 Méningite cérébro-spinale (isolement de N. meningitidis)

II) Diagnostic Indirect :

Objectif : Établir le diagnostic étiologique d’une infection par la recherche d’anticorps circulants synthétisés en
réponse à la multiplication bactérienne :
 Lorsque la mise en évidence de l’agent causal est techniquement difficile par les méthodes traditionnelles
(ex. T. pallidum)
 Lorsque la mise en évidence de l’agent causal est impossible (diagnostic rétrospectif d’une infection guérie)
 Lorsque la mise en évidence de l’agent causal nécessite des prélèvements trop invasifs (ex. l’encéphalite
listérienne)
Les techniques appliquées impliquent à leurs tour la réaction antigène-anticorps et la révélation peut se faire
de plusieurs manières :

- Différentes méthodes utilisées :

 Réactions d’agglutination ou d’hémagglutination (HA)
 Réactions d’immunofluorescence (IF)
 Réactions immuno-enzymatiques (EIA) type ELISA
 Techniques d’Immuno-Blots (IB) ou Western-Blots (WB)

- Deux prélèvements sont requis :

 Un prélèvement précoce : fait dès la réception du malade (suspicion d’une maladie) son rôle est d’écarter
une immunité préalable
 Un prélèvement tardif : fait 15 j a 1mois plus tard, il est censé apporter la preuve de la maladie par apparition
des anticorps

- Les techniques de sérodiagnostic peuvent être purement qualitatives : ex : VDRL (syphilis), Rose Bengale
(Brucellose)
- Les techniques semi-quantitaves = Titrage d’anticorps : ex : Widal et Felix (Typhoide), Wright (Brucellose),
Sérologie de la maladie de Lyme… dans ce cas, le titre est exprimé en dilutions (1/10, 1/20 … etc) ou en UI.
- Il existe pour certaines maladies des seuils pour retenir un diagnostic positif.

Conclusion :
- Le diagnostic bactériologique est un examen clé de la pratique biologique et un impératif dans le diagnostic des
maladies infectieuses.
- Qualité du prélèvement+++
- Qualité de l’analyse bactériologique
- Rigueur dans l’interprétation et la validation des résultats
- Rapidité de l’envoi des résultats : Coopération entre clinicien et bactériologiste