Les stratégies diagnostiques en virologie

Dr.Taoufik Ben Houmich

Laboratoire de Microbiologie - Hôpital Arrazi

Date
CHU Mohamed VI - Marrakech
 Introduction

Agents infectieux micrométriques ayant un seul type d'acide nucléique (ARN ou

ADN) et qui se reproduisent à partir du matériel génétique de la cellule parasitée.

Le diagnostic virologique s'est longtemps limité à l'inoculation à l'animal, à l'œuf de

poule embryonné et aux techniques sérologiques classiques avant Avènement de la
biologie moléculaire.

Diversité des méthodes => Démocratisation , Rapidité, Diagnostic élargi.

Diversité des méthodes => Perplexité du choix de la technique appropriée.

 Plan

I- Introduction

II- Rappels

III- Circonstances du diagnostic

IV- Indications du diagnostic virologique

V- Conclusion
 Rappels

1. Historique:
Uniquement par des caractères négatifs: Invisibles au microscope, non cultivables, et filtrant à travers les filtres
bactériologiques.

Martinus Willem Beijerinck définit la nature originale de cet agent transmissible à la fois « vivant » et « fluide »,
écartant formellement sa nature bactérienne. Il le nomma contagium vivum fluidum en fin du XIX° siècle .

1898 => le virus de la fièvre aphteuse fut le 1er virus filtrant décrit chez l’animal.

1901=> le virus de la fièvre jaune fut le 1er décrit chez l'être humain.

1939 => mise en évidence des virus par microscopie électronique par Gustav Kausche.

1949 => perfectionnement des techniques de culture cellulaire par John Enders et ses collaborateurs.
 II-Rappels

2. Techniques de diagnostic indirect:

Mise en evidence d’anticorps spécifiques.

Regroupés sous le terme serologies virales.

Basés sur la réaction antigène-anticorps

Deux categories :
Techniques sans marquage.

Techniques avec marquage.

 TECHNIQUES SANS MARQUAGE:
Séroneutralisation: mise en evidence de la neutralisation du pouvoir infectieux du virus en empêchant
son adsorption aux récepteurs cellulaires.

Inhibition de l’hémagglutination: Dans le cas des virus possédant une hémagglutinine (rougeole, rubéole
, inflenzavirus…)

Agglutination passive: reaction avec des antigènes adsorbés sur des particules de latex (MNI test).

Immunoprécipitation en milieu gel: formation d’arcs de précipitation.

 TECHNIQUES AVEC MARQUAGE:
Possibilité de détection de plusieurs isotypes (IgG, IgM, IgA).

Techniques utilisant la reaction antigène-anticorps.

Manuelles ou automatisées.

Unitaires ou microplaques.

Automate ouvert ou fermé.

Essentiellement ELISA, Chimiluminescence et techniques apparentés.

TDR.

Utilisation d’anticorps anti-anticorps marqués.

 ELISA, CHMILUMINESCENCE ET IFI

Réaction chimique qui émet de l’énergie sous forme de signal.

Le signal émis traduit la quantité d’analyte.

Techniques ELISA Indirecte, en sandwich ou competition .

Avantages: Grande sensibilité et automatisation.

 TECHNIQUES D’IMMUNOEMPREINTE

WESTERN BLOT et IMMUNOBLOT

Permettent de détecter les anticorps spécifiques une une cible dans un

melange d’anticorps

Deux étapes: électrophorèse sur gel puis transfert (blotting) sur

membrane de nitrocellulose.

Mise en contact avec le serum du patient et addition d’anti-ac marqués

Resultat sous forme de bande.

Très spécifiques +++

 II-Rappels

3. Techniques de diagnostic direct:

Beaucoup moins répandues.

Tres dépendants de la qualité des prélèvements.

Large palette de prelevements: selles, prélèvements respiratoires , prélèvements cutanés et

muqueux, serum…

Temps de rendu de résultats souvent long.

Mise en oeuvre nécessitant un haut niveau d’expertise et un équipement spécifique.

 MISE EN CULTURE VIRALE
Inoculation à l’animal de laboratoire ou à l’œuf de poule embryonnée.

Exceptionnellement en virologie clinique.

Surtout dans un but de recherche => complexité de mise en oeuvre (Coûts, équipement…).

La culture cellulaire est le procédé le plus souvent utilisé pour l'isolement des virus.

Respect des règles de sécurité vis-à-vis du risque infectieux.

 DETECTION DES ANTIGENES VIRAUX
Techniques immunologiques.

Plus simple et rapide à mettre en œuvre par rapport a la culture.

ne nécessite pas de maintenir de l'infeciosité du virus.

Utile quand un diagnostic rapide est nécessaire.

Manque relatif de sensibilité.

Agglutination, IFD, ELISA, Chimiluminescence, Tests immunochromatigraphiques.

 BIOLOGIE
MOLECULAIRE

Technique de reference.

Permet de detecter tous les virus.

Plusieurs techniques: PCR en temps réel, en point

terminal, hybridation simple…

Très spécifique, possibilité de rechercher

simultanément plusieurs virus sur le même
échantillon.

Temps de rendu de résultat+++

Inconvenants: Coût, risque infectieux, nécessité

d’une certaine experience, laboratoire dédié.
Extraction du génome viral:
Isoler le génome viral.

Etape de purification.

Techniques utilisant des solvants remplacés par des techniques basées sur la propriété des acides nucléiques a se fixer sur les billes en silice.

Obtention d’extrait contenant tous les acides nucléiques presents dans le prélèvement initial.
Melange réactionnel:
Amorces sens et anti-sens.

Sondes marquées.

Polymerase Taq

Nucléeotides.

Tampon contenant un cation divalent Mg2+.

Amplification:
Thermocycleur

Variation des temperatures

Fusion, Hybridation puis élongation.

Détection a chaque fin de cycle.

Utilisation de systèmes de révélation des produits de PCR.

 III- Circonstances du diagnostic

1. En fonction des moyens du laboratoire:

Plusieurs niveaux de laboratoires=> missions et attributions différentes.

1.1. Laboratoires de Ville, CHP et CHR:

Généralement une activité d’immuno-analyse.

Parfois Immunofluorescence si possible.

Rubeole, CMV, Herpes, Hepatites B et C, VIH.

 1.2. Laboratoires des CHU:

Travaille avec des services prenant en charge des pathologies lourdes.

Laboratoire de sécurité biologique de niveau 3.

Large palette technique.

Immuno-analyse.

Biologie moléculaire.

Séquençage.

Culture cellulaire.
 1.3. Laboratoires de recherche:

Équipement à la pointe de la technologie.

Poste de sécurité biologique de niveau 4.

Intervention en cas de nouvelle espèce virale.

Virus hautement pathogène.

En appui des laboratoires précédemment décrits en cas de grande épidémies ou pandémies.

CNR
III-Circonstances du diagnostic
2. En fonction de l’âge:
2.1. Chez le nouveau-né/premiers mois de vie:

Système immunitaire immature.

Problème des IgG maternels.

Favoriser le diagnostic direct.

Parfois la recherche d’IgM.

 2.2. Chez les nourrissons et les jeûnes enfants:

Grande vulnérabilité aux infections.

Role protecteur de l’allaitement maternel.

Interet de la vaccination ( rougeole, rubéole…)

Exposition massive dans les crèches/écoles.

Épidémies saisonnières.

Essentiellement des viroses respiratoires et digestives bénignes.

Diagnostic peu demandé.

2.3. Chez les adolescents et les adultes:

Amélioration des conditions d'hygiène et la vaccination => régression de certaines pathologies:

Rougeole, Rubéole , Oreillons, MNI, Hépatite A.

Apparition d’infections tardives avec des atteintes plus graves que chez l’enfant (Varicelle, Rougeole…).
3. En fonction du contexte:
III-Circonstances du diagnostic 3.1. A visée diagnostique:

En fonction du tableau clinique.

Soit une recherche précise en cas de symptômes caractéristiques.

En cas de symptomatologie non spécifique, la recherche sera guidée par les examens complémentaires: Panel contenant les
virus les plus probables selon le contexte.
3.2. Suivi des patients:

Infections chroniques.

En association aux bilans biochimiques.

Evolution de l’infection: Guérison, Persistance de la replication, reactivation.

Evaluation de la réponse au traitement.

3.3. Dépistage:

Dans le cadre d’un bilan général, de grossesse, pré-thérapeutique ou don de sang.

Généralement par techniques immunologiques.

 IV-Indications du diagnostic virologique

1. Diagnostic d’une infection aigue:

Confirmation étiologique d’une symptomatologie évocatrice non spécifique (hépatite).

Différentiation des souches pour une symptomatologie caractéristique (HSV1 et HSV2).

Généralement par techniques immunologiques.

PCR.

Culture cellulaire = peu d’intérêt.

2. Diagnostic d’une infection persistante:

Les infections chroniques s’accompagnent de la presence d’anticorps dans le sang malgré la réplication virale.

Nécessité de rechercher les marqueurs de réplication.

3. Certification de guerison:
IV-Indications du diagnostic
Difficile a confirmer cliniquement ou sérologiquement.
virologique
Intérêt de la biologie moléculaire.

Guérison effective ou apparente.

4. Bilan pré-thérapeutique:
Recherche d’infections associées notamment en cas de VIH.

Détermination de la charge virale afin d’évaluer l'efficacité ultérieure du traitement.

5. Suivi d’un patient non traité:

Determination des marques de réplication si aucun traitement n’est indiqué.

Recherche d’une séroconversion.

Guérison ou mutation pré-core.

6. Détermination de la résistance aux antiviraux:
IV-Indications du diagnostic virologique
Multiplication des traitements anti-viraux.

Eliminer une mauvaise observance.

Determination de la charge virale, séquençage …

7. Recherche d’une immunité naturelle ou post-vaccinale:

Anticorps protecteurs.

S’assurer de l'efficacité vaccinale.

Préconiser une vaccination chez les personnes à risque.

8. Diagnostic pré-natal:
Dépistage systématique.

Signes d’appel d’embryofoetopathies.

Liquide amniotique ou sang du cordon.

9.Recherche d’une infection occulte chez un donneur:
IV-Indications du diagnostic virologique
Don de sang, tissus, sperme.

Avant PMA.

Tests immunologiques+++

10.En post mortem:

Situation exceptionelle.

Don du corps à la science.

Expertise médico-légal.

Problème: les techniques commercialisés ne sont pas validées.

11. Etudes épidémiologiques et veille sanitaire:

Prevalence des anticorps dans la population.

Suivi des épidémies saisonnières.

Monitorage des nouvelles épidémies.

V-Choix de la technique
 V-Conclusion

Le laboratoire de virologie doit s’adapter au développement perpétuel des

techniques diagnostiques virologiques et intégrer les méthodes les plus récentes.

Le choix de la technique est dicté par les indications et ressources disponibles.

Diminuer le temps de rendu de résultats et les coûts.

 Take home messages

Amelioration continue de la sensibilité et la rapidité des technique =

démocratisation du diagnostic virologique.

La culture à de moins en moins de place dans le diagnostic virologique .

La biologie moléculaire est le présent et le futur.

La sérologie reste la Pierre angulaire du diagnostic .

Toujours contextualiser avant d’opter pour une technique.