UniversitéBlida 1

Institut des Sciences Vétérinaires

Microbiologie Générale – Virologie (2e année) 2020 /2021
Dr AKLOUL K.

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

1. Prélèvements
La qualitédes résultats dépend essentiellement de la qualitédu prélèvement
Principe
réaliser des prélèvements en fonction des syndromes et de ce que l'on recherche (virus,
pathogénie)
au niveau du site de multiplication du virus, quand il est accessible (organe cible, porte
d’entrée du virus, site d’excrétion virale)
rapidement, au début des signes cliniques, pendant la phase aiguë de la maladie quand
l’excrétion virale est maximale.
associer plusieurs prélèvements (maladies généralisées, infections congénitales) ex : CMV
= sang et urine

En cas de diagnostic indirect : penser au délai d’apparition des anticorps par rapport au
contage = fenêtre sérologique (en général quelques semaines), réaliser un second prélèvement
àdistance.

Le prélèvement doit être transportévers le laboratoire le plus rapidement possible. Sinon, il

doit être conservéau froid (de –20 à +4°c) dans un milieu de transport adéquat. L’addition
d’antibiotique évite la pullulation des bactéries.

Pour la détection directe d'antigènes viraux intracellulaires (par immunofluorescence ou

immunopéroxydase), les conditions diffèrent. En effet, le prélèvement doit contenir des
cellules intactes et en grande quantité. Aussi, il sera transportéet stockéàtempérature
ambiante ou à+ 4 °C car la congélation altère les cellules.

2. Diagnostic des maladies virales

Le diagnostic virologique repose sur deux approches, parfois complémentaires :
-le diagnostic direct, décelant dans les produits biologiques la présence du virus ou de ses
composants, antigènes ou génomes viraux,
-le diagnostic indirect, décelant l’apparition dans le sang d’une réponse immunitaire sous
forme d’anticorps spécifiques du virus.

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Le choix de la technique dépendra essentiellement du virus lui-même, du site de l’infection,
du type de l’infection, du cout ainsi que et des caractéristiques intrinsèques du test.

La sensibilité (Se) est la probabilité qu'un test réalisé sur une personne malade se révèle
positif; autrement dit, que le test soit positif sachant que la personne est malade.
La spécificité(Sp) est la probabilitéqu'un test réalisésur une personne saine se révèle négatif;
autrement dit, que le test soit négatif sachant que la personne n'est pas malade.

Autrement dit, la sensibilité d'un test diagnostic est sa capacité à détecter tous les malades
(avoir le moins de faux négatifs), tandis que la spécificité de ce test est sa capacité à ne
détecter que les malades (avoir le moins de faux positifs).

2.1. Diagnostic direct

2.1.1. Microscopie électronique

Elle permet de visualiser les virus (coloration négative,..) et de les quantifier. Les particules
virales ne sont décelables qu’en concentration suffisante dans les prélèvements examinés (106
par ml), seuil rarement atteint en dehors des diarrhées virales ou des liquides de vésicules.
Les applications de la ME au diagnostic ont disparues progressivement avec les progrès de
l’immunologie et de la biologie moléculaire

2.1.2. Cultures cellulaires

Les virus sont des particules qui ne peuvent se développer qu’au sein de cellules hôtes en
raison de leur parasitisme intracellulaire obligatoire (certains virus ne sont pas cultivables).
Il y a aucune culture sur milieu inerte, la culture des virus exige donc des systèmes vivants :
-Animaux de laboratoire (singe, le lapin, la souris, le cobaye…). Recherche de l'apparition
de signes de la maladie voir de son caractère mortel. N’est plus utilisé en pratique.

-Œufs de poules embryonnés Le prélèvement suspect est injectédans la cavitéamniotique

ou allantoïque de l’œuf puis on surveille l’éventuelle apparition de lésions macro ou
microscopiques. Méthode utilisée pour la fabrication du vaccin antigrippal.

-Culture cellulaire (Culture in vitro)

Technique qui amplifie (multiplie) les virus (comme les cultures en bouillon ou sur gélose
amplifient les bactéries). La qualité des milieux de culture est essentielle pour la bonne
multiplication des cellules.
Le laboratoire dispose de 3 types de cellules : (le choix des cultures cellulaires dépend du
virus recherché; certains virus ne sont pas cultivables).

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-Les cellules primaires (ou dites de «primo-explantation ») sont obtenues àpartir d'organes
(reins de singes (ne sont plus utilisées en routine), reins humains …) ou de cellules sanguines
o permettent la croissance de nombreux virus
o durée de vie limitée àquelques passages (3 passages) pour les cellules épithéloides

-Les cellules diploï des de fibroblastes embryonnaires humains proviennent d'organes de

fœtus humains (poumon, rein ...) et conservent la propriété de se multiplier in vitro: La plupart
ont eu pour origine le poumon embryonnaire humain (WI38, MRC5, HEL).
o demi-vie limitée à50 passages (la cellule a besoin d’être remise en culture dans un espace
plus grand, une fois que l’inhibition de contact se produit, pour continuer à se développer)
o Elles sont très utilisées et permissives àde nombreux virus

-Les cellules en lignées continues sont des cellules transformées, immortalisées, obtenues à
partir de tissus cancéreux. Certaines proviennent de carcinome humain de col utérin (HeLa),
du larynx (Hep-2), d'autres sont d'origine simienne (cellules Vero, MK2 qui dérivent de
cellules de rein de singe), canine (MDCK) ou bovine (MDBK)...
o Croissance plus rapide que les diploïdes
o facile à cultiver : Le nombre de passages est illimité et la lignée peut, en théorie, être
entretenue indéfiniment.

Choisir les systèmes cellulaires (une cellule permissive et de préférence sensible), les milieux,
les techniques d’inoculation, la température d’incubation et les méthodes de révélation qui
conviennent le mieux àchaque type de prélèvement.
Les cultures doivent être examinées régulièrement au microscope optique

2.1.3. Détection de la multiplication virale dans les cellules inoculées

2.1.3.1. Effet cytopathique
La multiplication virale se traduit par un Effet Cytopathique ou Cytopathogène ( ECP)
(toutefois, certains virus peuvent se multiplier sans provoquer d'ECP visible).
Ces modifications morphologiques peuvent être observées directement au microscope sans
coloration préalable. Des colorations peuvent être effectuées sur les cultures cellulaires
inoculées afin de révéler des inclusions qui peuvent se développer à l’intérieur des cellules et
qui sont caractéristiques d’un groupe viral.
L’aspect de l’ECP est plus ou moins évocateur d’un virus ou d’une famille virale.

L’ECP dépend du système cellulaire, du support de culture, de la concentration de virus et,

bien sûr, du virus lui-même Son délai d’apparition est également variable selon les virus

Les ECP peuvent comprendre des phénomènes relativement mineurs, comme le gonflement,
ou à l’inverse, le rétrécissement de la cellule; la formation de corps d’inclusion à l’intérieur de
la cellule; ou des effets drastiques comme le détachement des cellules de la surface de la boîte
de culture, la formation de syncytia multinucléés, ou même la mort cellulaire.

En présence de tout ECP, utiliser les techniques d’identification disponibles pour confirmer
son origine virale.

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Il est possible aussi de détecter la présence de certains virus dans la culture cellulaire par une
propriété biologique, comme l’hémagglutination ou l’hémadsorption, par la présence
d’antigènes ou d’acides nucléiques viraux.

2.1.3.2. Détection par Hémagglutination

Elle intéresse les virus porteurs de récepteurs (hémagglutinines) pour les hématies (virus
grippaux, les virus para-influenza…).

Le surnageant de la culture cellulaire est mis en présence d'hématies dans une cupule de
microplaque: une réaction positive se traduit par l’observation d’une sédimentation des
hématies sous forme la formation d'un voile dans la cupule.

2.1.3.3. Détection par hémadsorption

Propriété caractéristique des virus qui sont à la fois hémagglutinants et libérés par
bourgeonnement au niveau de la membrane cytoplasmique : virus grippaux, virus para-
influenza, virus ourlien, virus de la rougeole, virus de la rubéole. ; cela entraîne une
adsorption des hématies de cobayes àla surface des cellules infectées.
L'observation de la culture cellulaire montre la présence de rosettes de globules rouges
adhérant àla surface des cellules infectées dans le cas d’un virus hémadsorbant.

2.1.3.4. Détection par interférence virale

Technique employée pour la détection de virus ne donnant pas d'ECP et n'étant pas
hémadsorbant. Elle utilise la propriétéde certains virus d'inhiber la croissance d'autres virus
qui d'ordinaire sont responsables d'un ECP.

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2.1.4. Détection des antigènes viraux
Ce diagnostic direct pratiqué à l’aide d’anticorps antiviraux (souvent monoclonaux) est très
largement utilisé car c’est une technique rapide, évitant les aléas de la culture cellulaire in
vitro, pouvant s’appliquer à des virus impossibles à cultiver.

2.1.4.1. Immunofluorescence :
Mise en évidence des antigènes viraux intracellulaires par Immunofluorescence Il existe deux
types de fluorescence.
- Immunofluorescence directe
On utilise un anticorps dirigécontre la molécule recherchée, appelée antigène. Cet anticorps
est couplé à un fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation, on peut utiliser un
microscope àépifluorescence.

- Immunofluorescence indirecte
Dans ce cas, on a deux anticorps. L’anticorps primaire est dirigé contre l’antigène recherché.
Ensuite on utilise un deuxième anticorps, marquépar un fluorochrome, et possédant une haute
affinitépour l’anticorps primaire.

Les fluorochromes sont des substances qui, quand elles sont soumises àun rayon lumineux,
deviennent instables et émettent une longueur d’onde différente de la longueur d’onde
absorbée (λ émise > λ absorbée).

2.1.4.2. Technique ELISA

La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) (litérallement : test
d'immunoabsorption enzymatique) est une technique immuno-enzymatique de détection qui
permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce àune réaction colorée produite par
l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée àl'anticorps.

Permet de détecter la présence de certains anticorps ou antigènes dans un produit. Grâce àla
libération de couleur par les anticorps secondaires, le test ELISA permet aussi de quantifier
cette présence (l'intensité de la coloration est analysée à l'aide de spectrophotomètres et
fournit des informations sur la quantitéde protéines dans l'échantillon).

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Il existe 4 variantes du test ELISA

-ELISA direct
Permet de doser les antigènes présents. Cette méthode peut aussi être utilisée dans d'autres
cas, si l'on recherche une molécule allergène dans un aliment par exemple.
L’antigène « coaté» sur une plaque multi-puits est détecté par un anticorps directement
conjuguéàune enzyme.

-ELISA sandwich
C'est en fixant des anticorps dans les puits que l'on espère doser les antigènes présents dans la
solution. Le test est dit en sandwich car l'antigène est pris en sandwich entre deux anticorps
primaires. Puis, comme précédemment, des anticorps secondaires sont ajoutés et révèlent la
présence ou l'absence d'antigènes. Une coloration de plus en plus forte indique des
concentrations d'Antigène croissantes

-ELISA compétition
1- Des Ac primaires (et non marqués) sont incubés dans le sérum à doser. Si les antigènes
ciblés par les anticorps sont présents, il y a formation de couples Ac/Ag. Plus il y a
d'Antigènes, plus il y de couples formés. A l'inverse, si le sérum ne contient aucun antigène,
tous les Anticorps restent libres.
2- Le tout est versé dans un puits tapissé avec les mêmes Antigènes que ceux recherchés.
Dans le cas du sérum infecté, peu d'Anticorps se fixeront aux puits puisqu'ils sont déjàtous en
couple ! Ils seront donc évacués au rinçage, et la coloration qui suivra sera donc très faible. A
l'inverse, si le sérum ne contenait pas d'antigènes, tous les Anticorps ajoutés peuvent se fixer
au fond du puits et dans ce cas la coloration sera très forte.

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Les résultats doivent donc être interprétés à l'inverse de l'Elisa sandwich : plus la
concentration en Antigène est grande dans l'échantillon, plus la coloration est faible.

-ELISA indirect permet de détecter ou doser des anticorps (voir diagnostic indirect).

2.1.4.3. Immunochromatographie
Un test de diagnostic rapide ou test de dépistage rapide (TDR) permet d'établir rapidement
(quelques minutes) le diagnostic d'une maladie, le plus souvent grâce à des réactions
chimiques par immunoprécipitation sur membranes ou immuno-chromatographie sur
bandelettes (Lateral Flow Test) qui font apparaître une coloration particulière permettant
d'interpréter immédiatement le résultat

2.1.4.4. Agglutination de particules sur latex

Une suspension de particules de latex enrobées d’anticorps antiviraux est mélangé à un extrait
liquide de produits biologiques ; les particules de latex vont se trouver agglutinées par
l’intermédiaire de l’antigène viral correspondant, et à l’œil nu, la suspension de particules de
latex, d’homogène et laiteuse, va devenir granuleuse.

Les quantités de virus présents dans les selles sont comprises entre 108 et 1012 particules
virales par gramme de selles. Une recherche directe de rotavirus, d’adénovirus ou d'astrovirus
peut être réalisée àd'un échantillon de selles diarrhéiques par agglutination de particules de
latex sensibilisées

2.1.4.5. Immunodiffusion de double diffusion en gélose ou Test d'Ouchterlony

Méthode d'immuno-précipitation fondée sur la diffusion d’antigènes et d’anticorps en milieu
solide (en général un gel d’agarose) à partir de puits placés en vis-à-vis.

Lorsque les molécules d'anticorps rencontrent les molécules d'antigènes, la liaison antigène-
anticorps conduit àla précipitation des complexes immuns dans la zone de rencontre si
l’anticorps reconnaît l’antigène. Les précipités se présentent sous la forme d’un arc blanchâtre
visible à l’œil nu.

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La vitesse de migration des substances dans la gélose dépend de la température, de la
concentration des substances utilisées.

La méthode d’Ouchterlony peut être utilisée notamment pour détecter la présence

d’anticorps spécifiques dans un sérum, pour mettre en évidence un antigène donnédans un
liquide biologique, pour déterminer la zone d'équivalence ou pour évaluer le degréd'identité
(nul, total ou partiel) entre différents antigènes.

2.1.4.6. Western blot

Les bandes des protéines pour lesquelles on recherche les antigènes sont détectées par dépôt
d'un anticorps spécifique, suivi d'un second anticorps marquépar un isotope, un fluorochrome
ou une enzyme.
Cette technique utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer des protéines,
préalablement dénaturées, selon leur taille. Ces protéines sont ensuite transférées depuis le gel
sur une membrane (typiquement en nitrocellulose), oùelles sont exposées àun anticorps
spécifique de la protéine d'intérêt. On pourra ainsi observer leur position sur le gel.

Il est possible grâce àcette technique de détecter la présence d'une protéine dans un tissu,
d'évaluer sa taille, sa concentration, les variations de cette concentration, etc.

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Le nom du western blot, donné à la technique par W. Neal Burnette, est un jeu de mot à
partir de la technique du Southern blot, technique de détection d'ADN nommée d'après son
inventeur, Edwin Southern. La détection d'ARN est appelée northern blot.
Toutes ces techniques dérivent leur nom de l'étape de transfert sur membrane, comparée àune
empreinte sur buvard (blot = «tache »en anglais).

2.1.5. Détection des génomes viraux

Applicable à tous les virus, notamment à des virus difficiles ou impossibles à isoler. Elle
repose sur l’hybridation par une sonde nucléique spécifique (complémentaires d’un segment
d’acide nucléique viral connu) avec les acides nucléiques du virus correspondant
éventuellement présents dans le produit biologique.
Cette réaction d’hybridation peut se faire directement sur les produits biologiques ou après
amplification in vitro de la séquence nucléique virale, c’est-à-dire par réaction de
polymérisation en chaîne ou PCR.

2.1.5.1. Technique d’amplification génique (PCR)

L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR est
l'abréviation anglaise de polymerase chain reaction), est une méthode de biologie moléculaire
d'amplification génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de
multiplication de l'ordre du milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, àpartir d'une
faible quantité(de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique.
Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN
polymérase àsynthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de matrice.

Ares extraction et urification de l’ADN contenu dans l’echantillon a analyser, le le processus,

est initié par des amorces (ou primer) qui s'hybrident de part et d'autre de la séquence à
amplifier. Cette configuration permet àl'ADN polymérase de répliquer les 2 monobrins dans
le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir àla synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La PCR s'effectue sur 3 étapes:

 La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont
rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme simple brin
dans le milieu.
 Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune
complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation des amorces
sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges
excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
 Extension des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui
allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques complémentaires de la
séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une
température de 72°C.

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La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable (thermocycleur) dans
lequel sont placés les microtubes contenant le mélange réactionnel.
Cet appareil permet d'exposer les tubes àdes températures choisies et pour des durées
déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide, elle ne dure que
quelques heures (2 à3 heures pour une PCR de 30 cycles).

Révélation des produits d'amplification:

Lorsque la quantitéde produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis àune
électrophorèse en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides
nucléiques au travers du gel additionnéde BEt (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui
se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre àla molécule d'ADN une
fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 30 nm)). La vitesse de
migration étant dépendant de la masse de la molécule, donc du nombre de bases de l'ADN
testé, la présence et la taille des amplicons peuvent être facilement vérifiable sur le gel.

2.2. Diagnostic indirect –(Sérodiagnostic)

Détection des marqueurs immunologiques spécifiques produits par l’organisme en réponse à
l’infection virale (Détection des anticorps, signe d’un contact antérieur avec le virus). On ne
détecte pas le virus directement.
On prélève le sang en fonction du but de la recherche (Un seul prélèvement ou 2 à15 jours
d’intervalle).

Le diagnostic sérologique permet :

- d'établir un lien entre des manifestations cliniques et un virus donné au stade aigu de
l'infection en mettant en évidence une séroconversion, une élévation significative du titre des
anticorps et/ou la présence d'Immunoglobulines M spécifiques,

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- de suivre l'évolution d'une infection virale aiguë vers une guérison ou vers une infection
chronique persistante.

(La séroconversion désigne la phase au cours d’une maladie infectieuse où les anticorps
apparaissent suffisamment dans le sang pour qu’on puisse les doser).

Les 2 prélèvements doivent être manipulés en même temps et par la même personne.
On peut avoir 3 cas de figure :
� Résultats négatifs si les anticorps sont absents dans les 2 sérums.
� Résultats positifs et donc soit séroconversion si les anticorps sont présents dans le 2e
sérum et non dans le 1er, soit une augmentation significative des anticorps (S2 = 4xS1 ou
plus).
� On reconnaît la primo-infection par la recherche des IgM. Leur absence signe la
réinfection.

Lors de la première rencontre du virus, on a la réponse primaire avec des IgM et IgG
S’il y a ré-activation ou ré-infection, les IgM peuvent être absentes ou présentes à de très
faibles titres et de façon transitoire et on aura des Ig G.

La recherche d’anticorps se fait par :

2.2.1 Technique ELISA : (ELISA indirect)

Le test ELISA indirect permet de détecter ou doser des anticorps.

Il se réalise en 4 étapes:
La première étape appelée "coating" de l'antigène:
Elle consiste àincuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps
recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les

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plaques sont incubées à4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les
antigènes en excès avec du tampon de lavage.

La deuxième étape consiste àfixer l'anticorps àdoser:

On incube à37°C dans les puits, la solution d'anticorps àdoser pendant environ 30 minutes à
2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés
pour éliminer les anticorps àdoser en excès avec du tampon de lavage.

La troisième étape consiste àfixer l'anticorps de détection:

On incube à37°C dans les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30
minutes à2 heures. Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les anticorps à
doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du
tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés àune enzyme qui en
présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grâce à
l'apparition d'une coloration.

La quatrième étape consiste àrévéler les anticorps fixés:

On incube àtempérature ambiante et àl'obscuritépendant 10 minutes, une solution révélatrice
contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la
présence de l'anticorps àdoser. L'intensitéde celle-ci est proportionnelle àla quantité
d'enzyme présent et donc àla concentration d'anticorps recherché.

L’antigène est détecté en 2 étapes :

 Capture : un anticorps primaire non marqué et spécifique de l’antigène est appliqué
 Détection : un anticorps secondaire coupléàune enzyme est ensuite ajouté

Cette méthode a plusieurs avantages :

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  Meilleure sensibilité: amplification du signal par fixation de plusieurs anticorps
secondaires à l’anticorps primaire
 Réduction des coûts

2.2.2.Fixation du complément (ou déviation du complément)

Rappels sur le complément : protéines qui vont intervenir dans la défense de l'organisme. Ont
la particularitéde se fixer sur le complexe Ag-Ac. Cette fixation peut entraîner une activation
enzymatique qui se traduit par une hémolyse.

Mise en évidence d'un anticorps dans un sérum décomplémentépar la chaleur, et par

adjonction de complément et de l'antigène spécifique. La fixation du complément sur le
complexe antigène-anticorps inhibe le pouvoir hémolytique sur des hématies de mouton.

Son principe repose sur la notion que le complément est «fixé»puis activépar les complexes
antigène-anticorps. Après avoir décomplémentéle sérum àtester (pour éliminer toute source
non contrôlée de complément, en chauffant à56°C pendant 30 minutes), celui-ci est mis en
présence de l'antigène viral étudié et d'une quantité définie de complément de cobaye. La
réaction est révélée par l'addition d'un second couple antigène-anticorps composéde globules
rouges revêtus d'anticorps anti-globules rouges.
Si le sérum ne possède pas d'anticorps spécifiques du virus étudié, le complément reste
disponible pour se fixer sur le second couple, entraînant la lyse des globules rouges ; dans le
cas contraire, le complément est consommé par le premier couple et les globules rouges
restent intacts. Ainsi, une hémolyse signe l'absence d'anticorps.

2.2.3. Séroneutralisation
Le test de séroneutralisation détecte des anticorps neutralisants spécifiques au virus dans
l’échantillon de sérum. Une dilution de raison 2 de l’échantillon et une quantité connue du
virus sont pré-incubées puis ajoutées àdes cellules en culture (sensibles pour la réplication du
virus), pour déterminer la dilution la plus élevée capable de neutraliser l’infection virale et la
présence d’un effet cytopathique

Les Anticorps présents dans le sérum neutralisent l'infectivitédu virus et donc inhibe l'ECP
visible au microscope optique. Ces anticorps, dits neutralisants in vitro, ont souvent une
activitéprotectrice in vivo.

Cette technique ne s'applique qu'aux virus induisant un ECP d'apparition rapide.

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2.2.4. Inhibition de l'hémagglutination virale ou IHA
Technique réservée aux virus capables d'agglutiner naturellement des hématies (virus de la
rubéole, de la grippe, de l’influenza aviaire…). Elle consiste àmettre en présence le virus test,
les globules rouges qu'il peut agglutiner et des dilutions croissantes du sérum à tester. La
présence d'anticorps se traduit par une inhibition du pouvoir hémagglutinant spontanédu virus.
Compte tenu du fait que l'hémagglutine est habituellement indispensable à l'infectiosité du
virus, ces anticorps ont en général un pouvoir protecteur.

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Les Anticorps spécifiques du virus se fixent sur le virus => le virus n'a plus accès àla surface
des hématies => il y a inhibition de l'hémagglutination donc inhibition de la formation d'un
agglutinat visible àl'œil nu
Un titrage sérique peut être utilisé pour déterminer les dilutions auxquelles l’hémagglutination
continue d’être inhibée. La valeur réciproque de la dilution la plus élevée à laquelle une
inhibition de l’agglutination peut encore être observée fournit le titre des anticorps.

2.2.5. L'Immunofluorescence indirect

Le support sensibiliséest constituéde cellules infectées fixées sur une lame.
Le réactif utilisé pour reconnaître les anticorps du patient fixés sur l'antigène est un
immunsérum anti-globulines humaines (totales ou spécifiques de classe) conjugué à un
fluorochrome. La lecture est effectuée en microscopie optique àfluorescence.

2.2.6. Techniques radio- immunologiques (RIA)

Le principe est proche de celui des techniques ELISA, le deuxième anticorps étant coupléici
à un radio-isotope. La détection des immuns complexes marqués est réalisée grâce à un
compteur gamma. Du fait de la difficultéde leur exploitation (radioprotection, autorisations
administratives, instabilitérelative des réactifs), les techniques RIA sont de moins en moins
utilisées dans les laboratoires de virologie.

2.2.7. Agglutination sur lames de particules de latex sensibilisépar un Ag

Elle met en jeu des particules (latex, gélatine, hématies) sensibilisées par l'antigène viral dont
l'interaction avec l'Anticorps (IgG et IgM) du sérum à tester conduit à une agglutination
macroscopique rapide (quelques minutes à2 heures).

3. Dénombrement des particules virales

3.1. Quantification du titre infectieux par plages de lyse

Une plage de lyse est un trou formédans une couche de bactéries, àla suite d'une infection
lytique provoquée par un bactériophage. Les caractères des plages (vitesse de formation,
dimension, aspect, etc.) sont souvent utilisés pour définir et qualifier un type donnéde phage.
Les unités formatrices de plages de lyse, UFP ou unités formant plage, provoquent une lyse et
sont des plages de lyse virales visibles et dénombrées.

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3.2. Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules
La dose infectieuse est la quantitéde virus (on parle aussi de charge virale ou de titre viral)
nécessaire et suffisante, chez un individu moyen, chez une espèce donnée, dans des conditions
données (de laboratoire, ou naturelle, chez le fœtus, l'embryon, l'adulte, l'individu âgé) pour
que la probabilitéqu'un virus inhalé, ingéréou transmis par piqûre se développe et provoque
une maladie donnée.
Elle est généralement mesurée en quantitéde virus par millilitre de fluide (sécrétions, mucus)
ou par gramme de tissus s'il s'agit par exemple de la chair ou d'un organe d'un animal infecté
Les techniques de titrage varient selon les auteurs et les virus modèles. Quelle que soit la
procédure employée, le mode opératoire débute de la même façon : après dilutions
successives de l'échantillon, plusieurs fractions aliquotes de chaque dilution sont mélangées à
la suspension cellulaire, ou plus fréquemment déposées sur les cellules adhérentes en
monocouche confluence. Il existe plusieurs techniques de lecture des résultats et plusieurs
méthodes de calcul pour estimer la concentration virale moyenne de l'échantillon analysé,
notamment :
DICC50 : Dose de virus qui, injectée dans une culture de tissu, peut détruire 50 % des
cellules.

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