Ann Pathol 2007 ; 27 : 16-26

Mise au point Les contrôles nécessaires

en immunohistochimie : de la recherche
au diagnostic
Comment valider un anticorps ?

Homa Adle-Biassette (1, 2), Jacques Grassi (3), Catherine Verney (2), Francine Walker (1),
Laurence Choudat (1), Dominique Hénin (1)

(1) Laboratoire d’Anatomie et de Cytologie Pathologiques, Hôpital Bichat-Claude Bernard, 46 rue Henry Huchard,
75877 Paris.
(2) Inserm, U676, Hôpital Robert-Debré, 75019 Paris.
(3) Programme transversal « Technologies pour la santé », Bâtiment 136, point courrier N° 18, CEA/Saclay,
91191 Gif sur Yvette cedex.

Adle-Biassette H, Grassi J, Verney C, Walker F, Choudat L, Hénin D. Les contrôles nécessaires en immuno-
histochimie : du diagnostic à la recherche. Comment valider un anticorps ? Ann Pathol 2007 ; 27 : 16-26.

Summary the primary antibody is responsible for generation of

The importance of controls in
immunohistochemistry: how to
validate an antibody, from research to
diagnosis
The specificity of an immunohistochemical reaction
is guaranteed by two sets of controls. Positive con-
trols verify the specificity of the primary antibody and
demonstrate that it binds only to the protein which
was used as an immunogen. Negative controls
ensure that the labelling technique is specific and that
the immunostaining. In fact, the production of a
labelling may also be related to cross reactivity or to
non-specific physical or chemical interactions. This
paper reviews the characteristics of various epitopes
and antibodies, describes different strategies which
prove the specificity of the immunohistochemical
reaction in research or diagnostic pathology and
point towards the essential information which should
be reported in a paper. ✦
Key words: immunohistochemistry, controls, quality,
antibodies.

Résumé anticorps sur des épitopes croisés ou des

La spécificité d’une réaction immunohisto-
chimique est vérifiée par deux types de
contrôles. Les contrôles positifs attestent
la spécificité de l’anticorps, c’est-à-dire
démontrent que l’anticorps reconnaît la
même protéine que celle utilisée comme
immunogène. Les contrôles négatifs
garantissent la spécificité de la technique
de détection en vérifiant que le marquage
identifie bien l’anticorps primaire fixé au
tissu. En effet, l’obtention d’une réaction
« colorée » peut être liée à la fixation des
réactions non spécifiques physiques ou
chimiques. Après un rappel sur les diffé-
rents types d’épitopes, les caractéristiques
et la fabrication des anticorps, cet article
développe les différentes stratégies per-
mettant de démontrer la spécificité de
l’immunohistochimie dans le cadre du diag-
nostic ou de la recherche et précise les
données indispensables à la publication et
l’analyse d’un article. ✦
Mots-clés : Immunohistochimie, contrôles, qualité, anti-
corps.

Accepté pour publication

le 3 mars 2007.

Tirés à part :
H. Adle-Biassette, Introduction essentiels qui permettent de préciser
voir adresse les évènements moléculaires à
en début d’article. l’échelle cellulaire et tissulaire. Le
e-mail : L’immunohistochimie (IHC) et domaine d’application de l’IHC s’est
homa.adle@bch.aphp.fr l’hybridation in situ sont des outils aujourd’hui considérablement élargi.

16 © 2007. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

 Les contrôles nécessaires en immunohistochimie : du diagnostic à la recherche. Comment valider un anticorps ?
Il existe en effet de nombreux anticorps
disponibles. La technique est devenue, au
moins en apparence, facile et standardisée.
Elle reste néanmoins semée d’embûches et
les pathologistes savent bien que l’obten-
tion d’une réaction colorée n’est pas suffi-
sante pour prouver la spécificité d’un
marquage. Cependant de nombreux arti-
cles sont publiés avec des résultats discu-
tables ou erronés. Il faut donc s’assurer de
la qualité des techniques et revenir sur les
contrôles nécessaires pour valider les
résultats, qu’ils soient à visé diagnostic ou
expérimentaux. La spécificité de l’IHC est
vérifiée par des contrôles négatifs qui
garantissent que la technique de mar-
quage identifie bien l’anticorps fixé au
tissu et des contrôles positifs qui attestent
que l’anticorps est fixé à la molécule
appropriée. Le but de cet article, à la suite
d’éditoriaux récents, est d’éveiller la vigi-
lance des anatomopathologistes, des cher-
cheurs, des lecteurs et des reviewers dans
l’interprétation et la fiabilité des résultats
obtenus en IHC pour la recherche ou pour
le diagnostic [1-3].
Rappels sur les caractéristiques
des anticorps
La plupart des anticorps (IgG, IgD, IgA et
IgE) possèdent deux sites de fixation aux
antigènes identiques qui peuvent être dis-
sociés et isolés (fragments Fab, Fab’) par
voie biochimique ou génétique. Le site de
reconnaissance de l’antigène par un anti-
corps est constitué par l’assemblage des
domaines variables des chaînes lourdes
(VH) et légères (VL). Seules les macromolé-
cules (protéines, polysaccharides, lipides,
acides nucléiques de PM > 5 000 Da) ont la
capacité de déclencher une réponse immu-
nitaire aboutissant à la sélection d’anticorps
capables de reconnaître spécifiquement
« l’antigène » immunisant. Cependant, on
sait depuis longtemps produire des anti-
corps contre des petites molécules (haptè-
nes) en immunisant des animaux avec des
préparations « d’immunogènes » contenant
l’haptène couplé chimiquement à une
macromolécule porteuse. Les macromolé-
cules comportent plusieurs « détermi-
nants » ou « épitopes » qui sont les
éléments structuraux présents à la surface
des antigènes directement impliqués dans
l’interaction avec le site de liaison de l’anti-
corps. Contrairement aux récepteurs des
lymphocytes T qui reconnaissent unique-
ment des séquences linéaires de petits pep-
tides (on parle aussi d’épitopes continus),
les anticorps reconnaissent souvent des
épitopes arrangés selon une certaine
conformation spatiale impliquant des aci-
des aminés distants dans la séquence de la
protéine (on parle d’épitopes discontinus).
Les techniques de fixation, d’inclusion et de
démasquage antigénique [4, 5] utilisées en
immunohistochimie peuvent modifier la
conformation spatiale des chaînes polypep-
tidiques, pouvant entraîner une dénatura-
tion des épitopes, en révéler d’autres
masqués ou créer des néo antigènes
(figure 1).
Deux sortes d’anticorps sont utilisés dans le
domaine de l’IHC. Il y a, d’une part, les anti-
corps polyclonaux qui sont un mélange d’anti-
corps produits par un grand nombre de
clones lymphocytaires B reconnaissant diffé-
rents épitopes d’une molécule et d’autre
part, les anticorps monoclonaux qui provien-
nent d’un unique clone lymphocytaire B.
• Les anticorps polyclonaux proviennent
du sérum d’un animal immunisé avec un
antigène. Dans ce milieu très complexe
composé d’un très grand nombre de pro-
téines différentes, les anticorps dirigés
contre l’antigène d’intérêt reconnaissent
plusieurs épitopes de l’antigène, ce qui
augmente potentiellement la sensibilité de
l’immunomarquage. Cependant, le pro-
blème majeur est la présence dans le sérum
de l’animal d’autres anticorps produits en
réponse aux stimulations immunologiques
naturelles, pouvant reconnaître différen-
tes structures dans un tissu (par exemple,
le sérum de lapins et de chèvres non immu-
nisés avec la cytokératine peut contenir
des anticorps anti-cytokératines [6]). Pour
cette raison, les anticorps polyclonaux sont
souvent « purifiés » par chromatographie
sur des colonnes d’affinité : l’antigène est
fixé sur un support solide qui retient les
anticorps « spécifiques » lors du passage
du sérum. Les anticorps spécifiques rete-
nus sont par la suite élués (en général par
un choc acide). À cette étape, ceux qui sont
liés avec une trop forte affinité risquent de
rester fixés au support solide ou peuvent
être dénaturés par le traitement employé
pour les éluer (la purification d’anticorps
polyclonaux par chromatographie d’affi-
nité se fait souvent avec un mauvais ren-
dement).
• Les anticorps monoclonaux sont générale-
ment fabriqués selon la technique des hybri-
domes mise au point par Georges Köhler et
Cesar Milstein en 1975 [7], bien que de nou-
velles techniques soient en cours d’étude [8].
La technique des hybridomes est basée sur le
principe que chaque lymphocyte B ne fabri-
que qu’un clone d’anticorps dirigé par défini-
17
 Homa Adle-Biassette et al.
Epitope
« conformationnel »
dénaturation
Épitope perdu
par dénaturation
Néo-épitope créé par protéolyse
FIG. 1. — Différents types d’épitopes. Modifié à partir des figures 3-9, Cellular and molecular immunology. 5 e édition, 2005, Abbas et Licht-
man Eds. Elsevier Saunders.
FIG. 1. — Different types of epitopes. As modified from figures 3-9, Cellular and molecular immunology 5e édition, 2005, Abbas et Licht-
man Eds. Elsevier Saunders.
tion contre un épitope unique. La souris est
immunisée avec l’antigène à une ou plusieurs
reprises. Lorsque le titre d’anticorps est suffi-
samment élevé dans le sérum, l’animal est
euthanasié et la rate est recueillie. Les lympho-
cytes sont fusionnés avec des cellules de myé-
lome pour les immortaliser. Les anticorps
provenant de chaque clone sont criblés pour
sélectionner ceux qui reconnaissent spécifi-
quement l’antigène d’intérêt. Dans la produc-
tion des anticorps monoclonaux à grande
échelle, deux systèmes différents sont possibles
pour le moment, offrant chacun des avantages
et des inconvénients [9]. Les hybridomes peu-
vent être implantés chez un animal syngéni-
que pour obtenir une tumeur péritonéale
dont l’ascite contient des concentrations très
importantes (généralement > mg/ml) de l’anti-
corps monoclonal. Là aussi, des difficultés
peuvent survenir : l’ascite peut être contaminé
par diverses immunoglobulines de l’animal
[10] sauf si l’animal est immunodéficient
18
Ann Pathol 2007 ; 27 : 16-26
Epitope linéaire
dénaturation
Épitope devenant Épitope reste
accessible accessible
après dénaturation après dénaturation
(SCID severe combined immunodeficiency
immunodeficiency), ce qui est coûteux. Les
hybridomes peuvent aussi être cultivés in vitro
(techniques peu rentables et coûteuses pour
l’instant) et les anticorps monoclonaux
recueillis à partir du milieu de culture. Cepen-
dant, la croissance optimale des hybridomes
peut nécessiter l’utilisation de quantité varia-
ble de sérum (tel que le sérum de veau fœtal)
dont les immunoglobulines peuvent aussi
« contaminer » le milieu contenant les anti-
corps monoclonaux. Les anticorps peuvent
être utilisés tels quels, depuis le milieu de
culture in vitro ou de l’ascite, ou être « puri-
fiés » ou concentrés (ce qui peut entraîner une
dénaturation et une baisse de leur affinité).
Ceci implique que les meilleurs anticorps
monoclonaux nécessitent comme les polyclo-
naux, un contrôle de leur spécificité en immu-
nohistochimie. Les techniques de production
des anticorps monoclonaux sont appelées à
évoluer rapidement : des anticorps mono-
 Les contrôles nécessaires en immunohistochimie : du diagnostic à la recherche. Comment valider un anticorps ?
clonaux très prometteurs sont actuellement
fabriqués chez d’autres espèces que la souris
ou le rat, et notamment chez le lapin.
Pour la publication d’un article
ou la validation d’une technique,
obtenir et fournir
des informations complètes
sur l’anticorps
• Lire attentivement la fiche technique et les
articles de références cités. Les renseigne-
ments n’y figurant pas devraient être récla-
més auprès du fournisseur. Nous en
donnerons un exemple personnel ; Pour un
travail étudiant la migration et la colonisa-
tion de la lignée microgliale/macrophagique
du cerveau fœtal humain [11], après accep-
tation de l’article, le rédacteur en chef du
journal [3, 12] nous a demandé des rensei-
gnements précis sur les anticorps ; les con-
trôles demandés ne figuraient pas sur les
fiches techniques et ont dû être demandés
aux fabricants. De plus, l’éditeur a réclamé
par la suite et, à plusieurs reprises, des
modifications concernant la description de
ces anticorps. Pourtant, nous avions eu
recours à des anticorps bien connus, qui
sont utilisés en routine dans le cadre diag-
nostic, tel que le CD68, le CD34 ou le Ki67 !
• Décrire en détail la technique d’immunohis-
tochimie : préparation des prélèvements, fixa-
tion, coupe, démasquage, méthode d’IHC…
• Préciser l’identité de l’anticorps : source
commerciale, numéro du catalogue et du
lot. Si l’anticorps est un don d’un autre labo-
ratoire, citer le nom du laboratoire ; s’il s’agit
d’un anticorps monoclonal, donner l’identi-
fiant précis du clone ; si c’est un anticorps
polyclonal, donner le code de l’antisérum et
l’identifiant de la saignée.
Box 1 : comment citer un anticorps dans un article
(pour un exemple concret, voir Monier et al [11])
• Cet antisérum de lapin (compagnie, catalogue,
lot) a été préparé contre un peptide synthétique
représentant la séquence en acides aminés x de la
protéine Z.
• Cet anticorps monoclonal, généreusement offert
par docteur x université de $, a été synthétisé en utili-
sant la protéine £.
• Si le Western Blot n’est pas réalisé sur le tissu étudié
au cours de la recherche, il faut indiquer que « l’antisé-
rum marque une bande unique de x kd sur le Western
Blot » ou « cet antisérum marque la bande de x kD
et non pas les bandes de $ ou * kD de la molécule sur
le Western Blot » (informations fournies par la fiche
technique).
• Préciser le mode de préparation de l’anti-
corps : donner la structure exacte de l’anti-
gène utilisé pour l’immunisation, l’espèce
chez laquelle l’immunisation a été réalisée, la
nature polyclonale ou monoclonale de l’anti-
corps et son isotype. Certains fournisseurs
refusent de communiquer ces informations
qu’ils considèrent comme confidentielles.
Cependant, compte tenu de la variabilité qua-
litative et quantitative des résultats obtenus en
immunohistochimie, il est indispensable de
fournir ces données, afin que les résultats
soient fiables et reproductibles. Les anticorps
pour lesquels la structure du peptide immuni-
sant n’est pas fournie n’ont pas de valeur
scientifique, il ne faut pas les acheter et les tra-
vaux scientifiques présentés peuvent refusés
pour publication dans certains journaux [12].
Spécifité des anticorps
L’immunohistochimie peut poser un certain
nombre de problèmes techniques.
• Un résultat faussement négatif est défini
par l’absence de détection du marqueur
alors qu’il est présent dans le tissu. Plusieurs
explications sont possibles : l’anticorps ne
reconnaît pas sa cible car l’antigène est inac-
cessible (il faut alors effectuer un démas-
quage) ou qu’il a été modifié ou détruit au
cours des prétraitements.
• Un résultat faussement positif est défini
par la présence d’un marquage dans un tissu
qui est dépourvu de l’antigène étudié. Ceci
implique qu’il faut démontrer la spécifité de
l’anticorps en immunohistochimie et ne pas
faire confiance aveuglement à ce qui est
prétendu par la fiche technique.
Les anticorps sont spécifiques c’est-à-dire
qu’ils sont capables de ségréger des différen-
ces subtiles entre 2 épitopes. Cependant,
• certains anticorps sont capables de se fixer
sur des épitopes différents qui partagent un
ou plusieurs acides aminés ne modifiant pas
la conformation spatiale du déterminant
Box 2 : exemple d’un anticorps reconnaissant
une protéine dans différentes espèces
Exemple : l’anticorps monoclonal 6H4 (IgG1) de Prio-
nics reconnaît la séquence DYEDRYYRE de la protéine
prion (position 144-152 de la protéine PrPc humaine).
Cette séquence est conservée parmi de nombreuses
espèces (homme, mouton, lapin, primates…), mais
chez le hamster et le rat, la tyrosine en position 145
est remplacée par un tryptophane. Cependant, 6H4
reconnaît en Western Blot les protéines prion du rat
et du hamster, quelques travaux ont aussi été réalisés
en immunohistochimie chez le rat.
19
 Homa Adle-Biassette et al.
Protéines membres d’une même famille X
X1 X2
FIG. 2. — Épitopes croisés.
FIG. 2. — Cross-reactive epitopes.
• certains anticorps peuvent se fixer sur un
épitope qui est exprimé par les produits
d’une même famille de gène donc structu-
rellement apparentés : il s’agit d’une « réac-
tion croisée » (figure 2, box 3)
Box 3 : un exemple de réaction croisée entre protéines
apparentées
L’immunodétection de l’antigène carcino-embryonnaire
(ACE) en utilisant l’anticorps monoclonal T84.66 [13]
se traduit par un marquage du pôle apical des cellules
intestinales ; l’utilisation de l’anticorps polyclonal de
DAKOCytomation A0115 aboutit au contraire à un
marquage diffus des cellules épithéliales et révèle en
outre les polynucléaires neutrophiles. Il s’agit proba-
blement d’une réaction croisée non spécifique avec
une protéine apparentée à l’ACE, appartenant à une
famille connue sous le nom de «non specific cross-
reacting antigen» (NCA) [14-19]. En effet, cet anticorps
polyclonal est connu pour réagir de façon croisée
avec les protéines NCA1 et NCA2 et la glycoprotéine
biliaire, tous membres de la famille ACE [20].
• Des réactions croisées entre des protéi-
nes structurellement non apparentées peu-
vent aussi se produire [21-23].
Ces réactions croisées non spécifiques peu-
vent être identifiées et la spécificité prouvée
en utilisant des anticorps différents dirigés
contre différents épitopes d’un même anti-
gène.
Box 4 : un autre exemple de réaction croisée
CagA est une protéine d’Helicobacter pylori : un anti-
corps polyclonal de souris dirigé contre CagA et
actuellement disponible reconnaît aussi les cellules
musculaires lisses et les cellules endothéliales des
plaques d’athérome [21].
20
Ann Pathol 2007 ; 27 : 16-26
Épitopes spécifiques
Épitope commun
Contrôles nécessaires
pour l’immunomarquage,
caractérisation de la spécificité
de l’anticorps
Anticorps primaire
Plusieurs types de contrôles peuvent être
réalisés et au mieux être associés. Ils sont
cités ici par ordre d’importance.
Le contrôle le plus fiable est l’absence de
marquage par l’anticorps (monoclonal ou
polyclonal) dans un tissu qui est dépourvu
de l’antigène ; le meilleur contrôle est
alors un animal chez lequel le gène a été
invalidé (exemple : souris dite knock out
où le gène a été invalidé par recombinai-
son homologue). La disparition du marquage
sur un tissu qui normalement exprime forte-
ment cet antigène prouve que l’épitope
appartient à la protéine qui est absente
chez la souris. De plus, l’absence de marquage
dans les autres tissus prouve que l’anti-
corps ne reconnaît aucun épitope croisé
ni de néo-épitope. Il est donc considéré
comme spécifique contre le(s) épitope(s)
annoncé(s) par le fabriquant. Il est cepen-
dant évident que ce contrôle n’est pas
toujours disponible. De plus, il n’est le plus
souvent applicable que dans des situations
expérimentales : il est en effet rare qu’une
protéine humaine soit suffisamment homolo-
gue d’une protéine murine pour pouvoir
être reconnue par les mêmes anticorps.
Si l’antisérum est dirigé contre un peptide
de taille suffisante pour être détectable en
Western Blot, il faut vérifier les caractéristi-
 Les contrôles nécessaires en immunohistochimie : du diagnostic à la recherche. Comment valider un anticorps ?
Box 5 : immunoempreinte (Western Blot)
et immunoprécipitation
L’immunoempreinte, ou Western Blot (WB) permet de
détecter une protéine donnée au sein d’un mélange
protéique, de déterminer son poids moléculaire et
d’évaluer son abondance de façon semi quantitative.
Le principe est de purifier les protéines d’un tissu ou
de cellules, puis de les faire migrer en électrophorèse
sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) pour les séparer
en fonction de leur poids moléculaire (PM) (des mar-
queurs de PM sont ajoutés pour servir de repère). Une
membrane de nitrocellulose est ensuite posée sur le
gel pour réaliser le « Blot » (l’empreinte), c’est à dire de
transférer la réplique du gel sur la membrane (les pro-
téines qui sont dénaturées dans le gel peuvent réac-
quérir leur plicature). Les protéines recherchées sont
détectées en utilisant un anticorps spécifique marqué,
ce qui permet aussi de déterminer leur poids molé-
culaire par comparaison aux marqueurs de PM stan-
dards ajoutés initialement. La dénaturation protéique
au cours du Western Blot explique en partie pourquoi
certains anticorps réagiraient mieux en WB qu’en IHC.
Si le test d’immunoempreinte n’est pas possible,
l’immunoprécipitation peut être utilisée pour fixer la
protéine d’intérêt ayant le poids moléculaire adéquat
(figure 4). Ces deux techniques fournissent ici des ren-
seignements équivalents, mais certains anticorps fonc-
tionnent mieux avec l’une ou l’autre des techniques.
Box 6 : des exemples personnel de contrôles
(figure 3)
Nous avons soumis un travail décrivant les anomalies
de migration neuronales par déprivation en glucose
dans le cerveau de souris au cours du développement
[24]. Parmi les données, nous avions décrit et quanti-
fié la gliose par une technique immunohistochimique
utilisant un anticorps anti-GFAP en fournissant des
belles figures convaincantes. La gliose est une réac-
tion « banale » d’hypertrophie et d’hyperplasie astro-
cytaire. L’un des lecteurs nous a réclamé un Western
Blot pour prouver l’existence d’une gliose (ce qui
revient à demander un Western Blot pour prouver
que la vimentine est augmentée dans un bourgeon
charnu). Nous avons été obligés de refaire des modè-
les animaux et un Western Blot pour montrer que la
bande de GFAP était plus intense chez les souris mala-
des que chez les contrôles !
ques de la bande obtenue à partir du tissu
de l’espèce utilisé pour immunomarquage.
Idéalement, un anticorps doit détecter une
seule bande de la taille moléculaire donnée
(ou plusieurs bandes si différents isoformes
de la molécule sont présents dans le tissu,
les isoformes sont des formes de poids
moléculaires différents, liées aux modifica-
tions traductionnelle ou post traduction-
nelle, pouvant être par exemple des formes
tronquées et/ou glycosylées).
• Un contrôle utile, et souvent demandé, mais
qui est surtout indiqué pour les anticorps diri-
gés contre des peptides synthétiques est le
test d’inhibition ou de compétition de l’anti-
corps avec l’antigène (en anglais : absorption)
[25, 26]. La qualité de ce test dépend de la
pureté du peptide utilisé. La disparition du
marquage démontre au moins que l’anti-
sérum est dirigé contre l’antigène recherché.
Cependant, ce test détermine seulement la
spécificité de l’anticorps pour la protéine ou
le peptide avec lequel il a été incubé mais pas
sa spécificité pour la protéine au sein du tissu
[1] (figures 1, 2, box 2-4). En effet, un anticorps
peut se lier à n’importe quel autre épitope qui
a la séquence et la conformation correspon-
dante, donc non seulement à la protéine utili-
sée pour l’immunisation mais aussi à d’autres
protéines ayant des épitopes communs, don-
nant soit une réaction croisée, soit une réac-
tion avec des néo-épitopes. Cette stratégie
s’applique aussi pour les anticorps mono-
clonaux qui forment a priori toujours des
complexes avec l’antigène recherché mais qui
peuvent aussi s’accrocher de façon non spéci-
fiques à un tissu (par leur fragment Fc par
exemple, qui leur permet de se lier aux cellu-
les ayant des récepteurs spécifiques, telles
que les cellules immunes ; ces fixations sont
d’autant plus importantes que les prélève-
ments sont non fixés). Dans ce cas, l’absence
de suppression du marquage permettra
d’identifier le problème. Au cours d’un test de
compétition de l’anticorps avec l’antigène,
l’inhibition complète de fixation de l’anticorps
au tissu est difficile car le complexe anticorps-
peptide peut se dissocier pendant l’incubation
sur le tissu ; même un très faible taux de dis-
sociation suffit à permettre un marquage spé-
cifique. La préincubation du tissu avec le
peptide diminue la fixation de l’anticorps aux
protéines tissulaires [26]. La persistance d’un
marquage pose le problème de la spécificité
de l’anticorps mais aussi le problème des mar-
quages «non spécifiques», largement débattu
dans les manuels de fabricants d’anticorps
(Dako, Chemicon…). Les causes des marqua-
ges non spécifiques sont très variables : inter-
actions électrostatiques ou ioniques, activités
enzymatiques endogènes, biotine endogène,
diffusion d’antigènes, réactions croisées, pré-
sence de récepteurs Fc, fixation médiée par le
complément, etc. Il faut souligner que, pour
certains anticorps, le peptide immunisant
n’est pas disponible : l’insistance des lecteurs
des éditeurs pour réaliser le test est alors inap-
propriée… et vaine.
• Si l’antigène, ou le peptide immunisant,
n’est pas disponible, des stratégies alternati-
ves peuvent être utilisées pour établir la spé-
cificité d’un anticorps. Si le profil d’expression
de l’antigène de l’antigène est bien connu
(c’est le cas pour de nombreuses protéines), il
est raisonnable de montrer que les tissus
d’intérêt de l’espèce étudiée présentent un
21
 Homa Adle-Biassette et al. Ann Pathol 2007 ; 27 : 16-26

FIG. 3. — Western Blot. Dans un précédent travail [27] nous avions étudié l’expression de la protéine prion cellulaire PrPc (isoforme nor-
male de la protéine prion amyloïde des maladies à prion) dans le cerveau fœtal en utilisant 5 anticorps monoclonaux dirigés contre différents
isoformes de la PrPc. Nous avons observé un marquage des fibres mais aussi des cellules qui ce sont révélées être de façon surprenante non
pas des neurones mais des cellules microgliales jeunes. La qualité du marquage variait en fonction des anticorps, de plus, certains anticorps
(3F4 et KG9) donnaient un marquage nucléaire intense selon notre technique (artéfacts nucléaire ou marquage réél ?). La localisation de la
PrPc dans différents compartiments cellulaires n’est pas totalement élucidée. Nous avons donc mis à disposition les lames virtuelles des cou-
pes montrées ici à migestation sur: http://teleslide.crihan.fr/forum/pu_subjects.php?forumid=114). Le WB réalisé par docteur Katell Peoch
a confirmé nos résultats en mettant en évidence ici à 16 semaine post ovulatoire la présence principalement d’une bande de 35 kD (mise en
évidence par l’anticorps SAF70) représentant l’isoforme diglycosylée de la protéine dans les cortex frontal et occipital, tandis que la protéine
n’était pas détectable dans le thymus.
FIG. 3. — Western Blot. In earlier work [27], we studied expression of cellular prion protein PrPc (normal isoform of th amyloid prion
protein in prion diseases) in the fetal brain using five monoclonal antibodies directed against different isoforms of PrPc. We observed labeling
of fibers and also cells which surprisingly were not neurons but young microglial cells. The quality of the labeling varied with the antibody
and in addition certain antibodies (3F4 and KG9) exhibited intense nuclear uptake with our technique (nuclear artifact or real labeling?).
The localization of PrPc in different cell compartments is not totally elucidated. We thus have put the mid-gestation slides presented here on:
http://teleslide.crihan.fr/forum/pu_subjects.php?forumid=114). The Western Blot performed by Katell Peoch confirmed our results by
demonstrating (here at 16 weeks post ovulation) the presence of a principal band of 35 kD (antibodies SAF70) representing the diglycosylated
isoform of the protein in the frontal and occipital cortex while the protein was not yet detectable in the thymus.

profil de marquage avec l’anticorps utilisé manière, la spécificité d’un immunomarquage

identique à celui connu pour l’antigène cor-
respondant préalablement. Il est aussi possi-
ble de vérifier si l’anticorps à valider donne le
même profil de marquage qu’un autre antisé-
rum bien déterminé qui a réussi le test de
compétition de l’anticorps avec l’antigène.
Différents anticorps, dirigés contre différents
épitopes d’une molécule produisant un
patron de marquage comparable, sont des
arguments de poids pour déterminer la spéci-
ficité de l’anticorps (figure 3). De la même
est mieux établie si celui-ci est observé au sein
des cellules qui expriment le messager en
hybridation in situ.
• Enfin, démontrer que le marquage
observé est spécifiquement lié à l’anticorps
primaire, celui-ci peut être remplacé par du
sérum non immun (sérum normal dilué), ou
par les fractions immunoglobulines (IgG) du
sérum de l’animal de même espèce et iso-
type que l’anticorps primaire ; il peut aussi
être remplacé par un anticorps primaire du

22
 Les contrôles nécessaires en immunohistochimie : du diagnostic à la recherche. Comment valider un anticorps ?

Y Y
Western
Y Blot
(1) (2) (3)
Y Y
Y
Y Y YY
FIG. 4. — Immunoprécipitation. Le principe de l’immunoprécipitation est de purifier un antigène particulier à partir d’une solution compor-
tant des protéines variées en utilisant l’anticorps spécifique de l’antigène. Après extraction protéique, l’anticorps spécifique de l’antigène est
immobilisé par fixation sur un support solide (billes magnétiques, gels, latex) et ajouté à la solution (1). Les complexes antigène-anticorps for-
més sont précipités (2), lavés pour les débarrasser des autres protéines. Puis les antigènes spécifiques sont élués de leur anticorps. Ces protéines
peuvent être analysées de différentes façons, par exemple par Western Blot.
FIG. 4. — Immunoprecipitaiton. The basis of immunoprecipitation is to purify a specific antigen using a solution containing various pro-
teins and using an antigen-specific antibody. After protein extraction, the antigen-specific antibody is immobilized by uptake on a solid sup-
port (magnetic beads, gels, latex) and added to the solution (1). The antigen-antibody complexes which form precipitate (2) then are washed
to remove other proteins. The specific antigens are then eluated off their antibodies. These proteins can be analyzed with various techniques,
for example Western Blot.

même isotype mais non réactif sur le tissu Anticorps secondaire

étudié (un exemple est l’anticorps monoclo-
nal anti-IgG2a de souris immunisé avec le
KLH, protéine de mollusque servant de
« porteur »). Ces contrôles « négatifs » sont
les contrôles les mieux connus, les plus cou-
rants et les plus facile à mettre en œuvre, qui
confirment la spécificité de la réaction de
« détection » immunohistochimique c’est-
à-dire de la réaction colorée, mais qui ne
permettent pas d’attester la spécificité de
l’anticorps primaire.
Box 7 : exemples de contrôles
Un anticorps polyclonal de chèvre, dirigé contre un
peptide HGF humain recombinant (H-0652 ; Sigma, St.
Louis, MO) marquait l’épithélium du col. Le marquage
a été inhibé au cours du test de compétition de l’anti-
corps avec l’antigène avec le peptide. La disparition
du marquage prouve que l’anticorps est dirigé contre
des épitopes de HGF [25].
Dans la suite de nos travaux sur l’expression de la pro-
téine prion normale [27], nous avons récemment testé
un anticorps polyclonal anti-prion humain développé
contre un peptide synthétique pour pouvoir réaliser
des doubles marquages associant des anticorps
monoclonaux (les doubles marquages utilisant 2 anti-
corps monoclonaux que nous avions réalisés étaient
beaux, mais coûteux et devaient être adaptés à cha-
que modification du lot d’anticorps !). Le marquage
observé avec cet anticorps polyclonal était magnifi-
que : la technique marquait beaucoup plus de cellules
que les monoclonaux dont nous disposons. Le Doc-
teur Moleres qui l’avait utilisé dans une publication
[28] nous a « re »confirmé que le test de compétition
de l’anticorps avec l’antigène était parfait et que le
marquage avait totalement disparu. Cependant, nous
devrions réaliser le test sur nos tissus humains avec le
lot d’anticorps à notre disposition pour vérifier si le
marquage disparaît.
L’omission de l’anticorps primaire, presque
constamment effectuée en recherche comme
en pratique diagnostique, ne doit pas donner
lieu à un contre-sens : ce n’est pas un contrôle
de la spécificité de l’anticorps primaire mais
de celle de l’anticorps secondaire (contrôle
négatif) et doit être inclus à chaque fois que la
technique est réalisée. En effet, l’absence de
marquage prouve que l’anticorps secondaire
est pur et bien dirigé contre un antigène qui
n’est pas présent dans le tissu et que les
sérums et les techniques d’inhibition des acti-
vités endogènes ont été utilisés à bonne dose.
Pour résumer
Différentes stratégies sont disponibles pour
démontrer la spécificité d’un anticorps.
Nous les avons résumées dans la figure 5,
dans le contexte d’un article hypothétique
soumis à un lecteur ou un éditeur. Nous
avons aussi résumé un article [26] très élé-
gant qui démontre l’apparition d’un épitope
(ou néo-épitope) par la fixation (figure 6).
Conclusion
La spécificité de l’IHC est validée par des
contrôles négatifs et positifs. Il faut toujours
fournir le plus grand nombre de contrôles
possibles. En effet, des éditeurs signalent le
retrait de travaux de recherche, par exemple
quand les tests d’inhibition ou de compétition

23
 Homa Adle-Biassette et al. Ann Pathol 2007 ; 27 : 16-26

Si modè
modèle knock out ACE existe, si l’
l’anticorps reconnaî
reconnaît la proté
protéine murine

Pas de marquage Anticorps reconnaît

. épithélial de l’intestin
Réclamer un marquage ni du foie
de plusieurs tissus Marquage des
neutrophiles dans
différents tissus
l’épitope sur la molécule
prétendue
Réaction croisée

Réclamer un western blot ou une immunopré

immunoprécipitation
1 2
Molécule de la même
Profil 1: Bande verte seule => taille que ACE
anticorps reconnaît ACE
Molécule de taille
Profil 2: Bande verte et rouge: différente d’ACE
l’anticorps ne reconnaît pas seulement
ACE, mais aussi une molécule inconnue

Test de compé
compétition anticorps-antigè
anticorps-antigène si le peptide est disponible
le marquage épithélial intestinal et des polynucléaires neutrophiles disparaît => anticorps
dirigé contre le peptide immunisant (mais qui est croisée).

Réclamer un marquage avec d’

d’autre(s) anticorps anti-ACE
notamment un anticorps monoclonal bien caractérisé. Il n’y aura pas de marquage des
polynucléaires neutrophiles, donc l’anticorps ne reconnaît pas seulement l’ACE.

FIG. 5. — Démarche hypothétique d’un lecteur dans l’analyse et la critique d’un article. Imaginons que nous soyons reviewer d’un article qui
prétend que les polynuclaires neutrophiles expriment l’ACE en utilisant l’anticorps polyclonal ACE de DAKOcytomation cité plus haut, et
que ceci fournirait un outil diagnostic infaillible pour le diagnostic de certaines maladies myélodysplasiques. Différentes stratégies peuvent
être réclamées, qui sont présentées de la plus spécifique à la plus simple.
Ici le test de compétition de l’anticorps avec l’antigène n’aurait pas prouvé la spécificité de l’anticorps pour l’ACE. L’anticorps polyclonal
n’est pas spécifique de l’ACE, donc les neutrophiles n’expriment pas l’ACE, mais il est utile pour évaluer les syndromes myélodysplasiques :
à vous de voir !
FIG. 5. — Hypothetical critical review of a submitted paper. Imagine you were to review an article that states that polymorphonuclearl neu-
trophils express ACE using the polyclonal ACE antibody from DAKOcytomation mentioned above and that this provides a fail-proof dia-
gnostic test for certain myelodysplasic diseases. Different strategies can be claimed, presented here from the most specific to the simplest.
Here the antigen-antibody competition test would not prove the antibody specificity for ACE. The polyclonal antibody is not specific for
ACE, thus neutrophils do not express ACE. But you will have to determine whether it is good to evaluate myelodysplasic syndromes!

de l’anticorps avec l’antigène ont été initiale-
ment concluants mais que, par la suite, des
marquages ont été observés chez les animaux
où le gène correspondant a été invalidé par
recombinaison homologue. Il faut garder un
aliquot du lot d’anticorps utilisé pour les éven-
tuels tests demandés ultérieurement et four-
nir le plus de renseignements possible afin
que les résultats puissent être reproduits par
d’autres. Bien évidement, quelques soient les
moyens utilisés, simples ou complexes, au
final, c’est le lecteur qu’il faut convaincre !
Petite remarque pour conclure. Ces stratégies
peuvent aussi s’appliquer à notre exercice de
routine et doivent être employées pour vali-
der un anticorps nouveau ou chaque fois que
surgit un problème d’interprétation. Nous
sommes tous confrontés à ces difficultés.
Nous savons par expérience bien identifier de
simples « bruits de fond », mais le problème
devient beaucoup plus délicat lorsque le mar-
quage observé paraît authentique. Ce type de
difficultés est bien illustré par un exemple per-
sonnel. Nous avons découvert qu’un anti-
corps anti-EMA monoclonal marque aussi les
astrocytes réactionnels (et certains de nos
collègues neuropathologistes nous l’ont
confirmé). Il est évident qu’il s’agit dans le
cerveau normal d’une réaction croisée. Le
problème se pose devant une tumeur céré-
brale peu différenciée : dans ce cas, comment
interpréter l’immunomarquage avec cet anti-
corps anti-EMA, notamment lorsqu’il existe
une insertion méningée et que la tumeur
paraît agressive ? Est-ce un méningiome
atypique, une métastase de carcinome ou
une tumeur astrocytaire? Pour l’instant, nous
avons exclu cet anticorps de notre gamme
dans ce type d’indication ; le fabricant a été
prévenu. Comment avancer sur la base des

24
 Les contrôles nécessaires en immunohistochimie : du diagnostic à la recherche. Comment valider un anticorps ?

Box 8 : résumé de l’article de Josenphsen et al [29]

(figure 6)
La figure 6 illustre démarche de l’article de Josephsen et
al [26]. Ce travail très élégant démontre que la fixation
des tissus par la glutaraldéhyde entraîne l’apparition
d’un épitope de l’amelogénine (protéine de l’émail den-
taire) qui devient détectable par un anticorps monoclo-
nal anti-vimentine. À l’origine, le but était d’étudier les
odontoblastes de l’incisive du rat et l’invagination de
leurs prolongements dans l’améloblaste. Les auteurs ont
utilisé plusieurs anticorps anti-vimentine monoclonaux
et polyclonaux pour visualiser les prolongements fins
des odontoblastes en immunoélectronique selon la
technique de post-embedding. L’immunomarquage
anti-vimentine s’est révélé décevant mais un des anti-
corps monoclonaux anti-vimentine (V9-S) a curieuse-
ment marqué le compartiment cellulaire de l’émail
(comportant la protéine AMEL) dépourvu de vimentine.
Ils ont donc utilisé le Western Blot pour faire migrer
3 extraits protéiques : de la vimentine purifiée (V), des
extraits de fibroblastes (F) et des extraits protéiques de
l’émail (E). L’anticorps V9-S a naturellement reconnu les
bandes correspondantes à la vimentine et aux fibroblas-
tes (bandes non reconnues par l’anticorps anti-AMEL). FIG. 6. — Immunoblot avec la sonde V9-S et anticorps AMEL. A
De façon intéressante, l’anticorps V9-S a aussi reconnu gauche, une gamme de protéines standards à poids moléculaires
sur les extraits de l’émail, des bandes identiques à celles croissants : coloration au rouge Ponceau. Chaque panel contient de
la vimetine (V) purifiée, du lysat de fibroblastes humains (F) et de
de l’AMEL mais seulement quand les membranes étaient
l’extrait d’émail (E) au stade sécrétoire. Après le transfert des pro-
fixées à la glutaraldéhyde, confirmant la présence d’un téines, des membranes de nitrocellulose sont fixées au glutaraldé-
même épitope dans deux protéines structurellement hyde à 1 p.100 avant l’incubation avec les anticorps. Les protéines
différentes apparu au cours de la fixation. Il ne s’agissait d’émail au sein des blocs ne sont pas reconnues par la sonde V9-S.
pas d’une réaction croisée car l’épitope n’apparaissait Mais les protéines de moins de 31 kD sont révélées par la fixation.
pas sur la protéine de l’émail native non fixée et qu’il n’y La coloration des échantillons de vimetine et des extraits de fibro-
avait pas d’homologie connue entre les 2 protéines blastes n’a pas eu d’effet sur la fixation. Notez l’absence de réac-
AMEL et vimentine. Le test de compétition de l’anticorps tion avec l’AMEL des deux échantillons. La fixation a aboli la
avec l’antigène n’est pas indiqué ici car l’épitope appraît coloration de certaines bandes à haute poids moléculaire mais n’a
pas eu d’effet sur les protéines d’émail à faibles poids moléculaires
après fixation.
inférieurs à 31 kD.
FIG. 6. — Immunoblots probed with V9-S and AMEL antibodies.
The column at left shows standard broad-range molecular weight
marker proteins (MW) stained with Ponceau. Each panel contains
conseils donnés dans cette mise au point ? purified vimentin (V), human fibroblast lysate (F), and bulk protein
Une stratégie infaillible s’impose : (i) glisser extract from secretary stage enamel (E). After protein transfer,
insidieusement « encore une de ces épuisan- some nitrocellulose membranes were fixed with 1% glutaraldehyde
tes fameuses tumeurs » qu’on peine à dicter before incubation with antibodies. Enamel proteins in the unfixed
blots are not recognized by V9-S. However, proteins below 31 KD
au milieu des plateaux du patron, (ii) changer are revealed after fixation. Staining of vimentin and fibroblast
d’anticorps anti-EMA. Mais pour donner extract samples was not significantly affected by fixation. Note also
l’exemple de la rigueur digne d’un label Assu- that both samples were not stained by AMEL whereas weak stai-
ning of some higher molecular weight bands with AMEL was abo-
rance Qualité, suivons le plan de la figure 5 : lished by fixation, staining of many enamel proteins below 31 KD
(i) allons broyer un cerveau atteint de gliose was surprisingly intensified.
au fond du laboratoire d’Anatomie et Cytolo-
gie Pathologiques pour faire le Western Blot :
avec un peu de chance, il doit y avoir des pré-
lèvements congelés cérébraux dans notre
banque — ou plutôt dans notre collection
de tissus déclarés et répondant aux critères Références
d’assurance qualité et la loi bioéthique (y
compris les autorisations ou les non opposi-
tions des patients ou des tuteurs) —, un kit [1] Willingham MC. Conditional epitopes. is your anti-
d’extraction et le matériel de Western Blot body always specific? J Histochem Cytochem 1999 ;
prêts sur une paillasse puis (ii) attaquons le 47 : 1233-6.
Medline pour trouver une espèce où le gène [2] Ward JM. Controls for immunohistochemistry: is
codant pour EMA a été invalidé et où la “brown” good enough? Toxicol Pathol 2004 ; 32 :
protéine correspondante est suffisamment 273-4.
homologue de la protéine humaine pour réa- [3] Saper CB. An open letter to our readers on the use
gir avec l’anticorps à problème. Finalement, of antibodies. J Comp Neurol 2005 ; 493 : 477-8.
c’est très simple ! Résultat dans un prochain [4] Shi SR, Liu C, Balgley BM, Lee C, Taylor CR. Protein
numéro des Annales de Pathologie… ■ extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tis-

25
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