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Les connectivites : la place des anticorps antinucl~aires

DI PISTAGE DES ANTICORPS DIRIGt S

CONTRE LES ANTIGI NES NUCLI AIRES SOLUBLES
Alain Chevailler a,*, Celine Beauvillain a, Franoois Carr@re b

R@sum(~
1. Introduction
I~tape de deuxieme intention pour caracteriser la specificite d'anti-
L e depistage d'anticorps diriges contre les ant/genes nucleaires
corps antinucleaires detectes par immunofluorescence indirecte, la
solubles (ANS) est I'etape qui suit la mise en evidence d'anticorps
recherche d'anticorps diriges contre les ant/genes nucleaires solubles antinucleaires (AAN) par immunofluorescence indirecte (IFI). Dans le
repose sur differentes methodes dont les principes, les avantages et contexte d'un patient souffrant de rhumatisme inflammatoire chronique,
les inconvenients respectifs sont exposes dans cet article. Difficiles la caracterisation des cibles autoantigeniques peut avoir une valeur
& standardiser et automatiser, les techniques d'immunoprecipitation diagnostique, pronostique ou therapeutique. Ceci necessite donc
restent cependant celles de reference. Pour rendre un resultat une prescription raisonnee, argumentee, permettant de derouler un
algorithme sans faire d'impasse par meconnaissance d'un parametre
pertinent, le biologiste se dolt d'une part de parfaitement connaffre
clinique ou biologique.
les l/mites des methodes quoit emploie, d'autre part de replacer ce
resultat dans son contexte clinique en dialoguant avec le prescripteur. En dehors de circonstances particulieres et exceptionnelles (certains
ant/corps anti-SS-A notamment), la probabilite pre-test d'avoir des anti-
La valeur ajoutee d'une telle demarche est seule & m@mede conferer
corps anti-ANS alors que la recherche d'AAN est negative par immu-
un inter@t diagnostique ou pronostique & ces autoanticorps. nofluorescence indirecte (IFI) est quasi nulle [10]. La bonne pratique
Anticorps antifluch~aires - antig~nes nucl(~aires solubles -
est donc de ne pas les prescrire d'emblee et de reconsiderer la
recherche d'AAN en cas de modification clinique [13].
immunodiffusion double - ~lectrosyn@rese - Elisa -
immunodot - multiplexage.
Compte tenu des proprietes immunologiques des auto-anticorps (/so-
type, affinite) et des parametres methodologiques des differents tests
(nature de I'antigene, de son support, de I'anti-immunoglobuline) un m@me
Summary : Measurement of antibodies against auto-ant/corps peut se comporter differemment dans differents tests. Le
extractable nuclear antigens rSle du biologiste est d'expliquer au clinicien prescripteur les apparentes
Identification of the specificity of antibodies against extractable nuclear contradictions, et de ne pas transmettre des resultats bruts [33].
antigens is the second step after the screening by indirect immuno- Cet article est le fruit de I'experience d'un laboratoire d'immunologie
fluorescence in the detection of ant/nuclear antibodies. Different de CHU qui a commence le depistage de ces ant/corps clans les
methods are available, which are described in this paper with their annees 1970 par les techniques d'immunodiffusion qui restent le ,, gold
standard ,, de sa pratique quotidienne [28].
advantages and drawbacks. Immunoassay based on immunodiffusion
are still the gold standard, in spite of the difficulties to standardize and
to automate them. To give a pertinent result, the biologist should on 2. Aspect historique
the one hand know exactly the limits of the used methods, on the
other hand confront this result with the clinical data.
et donnees generales
Antinuclear antibodies - extractable nuclear antigens - Le terme d'ANS a et6 initialement utilise pour designer les proteines
double immunodiffusion - counterimmunoelectrophoresis et nucleoproteines du noyau cellulaire, solubles en tampon salin de
molarite physiologique, par opposition & I'acide desoxyribonucleique
- Elisa - immunodot - multiplexed immunoassay.
(ADN) qui precipite.
La recherche des ant/corps antinucleaires, et plus specifiquement celle
des ant/corps diriges contre les ANS, tient une place importante dans
la demarche diagnostique devant un rhumatisme inflammatoire chro-
nique & condition d'en connaftre les limites [13].
aLaboratoire d'immunologie et d'allergologie
Centre hospitalier universitaire - H6pital Larrey La premiere description des ant/corps anti-ANS date de 1959 par
49933 Angers cedex 9 Holman et coll. qui utilisaient une reaction d'immunoprecipitaion entre
des serums de patients lupiques et un extrait antigenique de thymus
b Laboratoire de biologie medicale
Centre hospitalier de veau [43].
20, av. de Saint-Sordelin & Vaux-sur-Mer- B.P. 217
17205 Royan cedex ADNn : ABR~iATIONS
AAN : ant/corpsantinucl@aires IDD imrnunodiffusiondouble
* Correspondance acide d@soxyribonucl@iquenatif IFI immunofluorescence indirecte
AIChevailler@chu-angers.fr ANS : antigbnesnucleairessolubles LES lupus@ryth@mateux
CIEP : contre-immuno@tectrophor~se systemique
article re~:u et accept6 le 21 avril 2006. (@lectrosyn@r~se) RNP ribonucl@oprot@ine
ECT : extraitcellulairethymique VPN valeurpredictivenegative
9 Elsevier SAS. I ENA : extractablenuclearantigen VPP valeurpr@dictivepositiw;

RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-aos 2006, N~384 59

Les connectivites : la place des anticorps antinucldaires

Enfin, une faible proportion de serums negatifs en IFI peuvent nean-

moins contenir des anti-ANS detectables seulement par d'autres
methodes (immunodiffusion) : c'est le cas de certains anti-SS-A [10].
Ceci est surtout vrai si les cellules HEp-2 utilisees sent fixees au metha-
Antigbne Maladie Fr6quence nol ; la prudence doit donc etre la regle dans I'interpretation d'un resul-
tat negatif en IFI et positif pour un anti-ANS[25]
Sm LES 15-25 % Les cliniciens ne sont pas le plus souvent au courant des modes de
(tres specifique) realisation des tests, donc de leur performance et par consequent de
Ul snRNP CM 90-100 % ce qu'ils sont en droit d'en attendre. Face & un patient avec un tableau
LES 20-30 % de rhumatisme inflammatoire, le but de la prescription repond &
rRNP : ribosomes LES 20-30 % differentes situations [25, 33] :
(neurolupus ?) - conforter un diagnostic devant une clinique evocatrice (tableau I),
SSA Lupus discd(de 5-20 % - eliminer un diagnostic devant une clinique peu specifique,
Lupus subaigu cutan6 40-70 % - suivre I'activite d'une maladie diagnostiquee,
LES 35-70 % - identifier des sous-groupes de patients.
Lupus neonatal 80-90 %
SGS 70- I O0 % Le choix du test doit tenir compte de differents parametres : la pro-
SSB Lupus discdl'de 5-10% babilite pretest d'avoir la maladie compte tenu de la clinique et de la
Lupus subaigu cutane 40-60 % prevalence de la maladie dans la population : si la clinique est peu evo-
LES 45 % catrice, il faut utiliser un test sensible, avec une valeur de prediction
SGS 40-90 % negative (VPN) elevee pour exclure avec la certitude la plus forte la
Scl-70 SS 50-70 % maladie. Aucun test & lui seul ne peut pretendre couvrir tous ces objec-
(tres specifique) tifs, car accroftre la sensibilite diminue la specificite [33]
SS diffuse 77 %
SS acrosclereuse 44 %
PM-1 scleromyosite 67 %
PM-Scl scleromyosite 70-90 %
(tres specifique)
Ku Scleromyosite 55 %
LED 100/0
SGS 0-5 % Historiquement les premieres methodes utilisees ont ete la fixation du
Mi-t DM/PM 5-10 % complement et I'hemagglutination [27].
LES 10 %
Mi-2 DM 20 % Tres rapidement, I'immunoprecipitation s'est imposee comme ta
(tres specifique) methode de reference [17]. La description initiale avec ces techniques
PM 0-5 % de reference (immunodiffusion double ou IDD, contre-immunoelec-
Jo-1 PM 20-30 % trophorese ou CIEP) a abouti pour le LES & I'inclusion de certains
PM avec fibrose auto-anticorps comme criteres de classification (anti-ADNn pour ADN
pulmonaire 60-70 % natif, anti-Sm).
DM 5-10% Vingt ans apres des difficultes de deux ordres apparaissent.
LES 0-5 %
Les premieres etudes qui ont valide historiquement les performances
LES : lupuserythemateuxdissemin~; CM : connectivitemixte; SGS : syndromede
Gougerot-Siegren; DM : dermatomyosite; PM po ymyoste ; SS : sclerodermie. des tests presentaient pour certaines des biais de selection inherents
& des etudes initiales : heterogeneite des cohortes (differences de
L'hegemonie anglo-saxonne explique I'usage de I'acronyme ENA (extrac- traitement, d'activite). De plus, tres rapidement, trois anticorps ont ete
table nuclear antigen). Les extraits nucleaires habituellement utilises pour retenus comme criteres de classification, donc de selection du LES ;
rechercher ces auto-anticorps sont le plus souvent des extraits thymiques ces anticorps sont devenus juges et parties [25].
de lapin (d'oQ le nom d'ECT pour ,, extrait cellulaire thymique *) et de rate Deuxiemement, les methodes actuelles plus sensibles (Elisa) modifient
de primates (le thymus de lapin etant deficitaire en antigenes SS-A qui I'interpretation ; on retrouve ainsi des anticorps anti-Sm en dehors du
le plus souvent fait defaut dans la poudre acetonique de thymus de lapin). LES [24]. On se doit de garder present & I'esprit la difference entre
Ces preparations grossieres sont le plus souvent contaminees par des la sensibilite d'un test (capacite du test & detecter un anticorps quand
constituants cytoplasmiques, expliquant que sous le terme d'ANS on il est present) et la sensibilite du marqueur (pourcentage de patients
regroupe des proteines nucleaires peu solubles (antigene Scl-70), des pro- d'une maladie donnee avec I'anticorps) [17]. Pour le marqueur, Fob-
teines de Iocalisation nucleaires non exclusives (antigene SS-A), ou meme jectif est d'augmenter la sensibilite sans diminuer la specificite, ce qui
des proteines cytoplasmiques (antigene Jo-1 ) [34]. se fait en ameliorant la sensibilite du test.
L'aspect de fluorescence des noyaux peut permettre une premiere En pratique de routine, on utilise le plus souvent des techniques de
orientation : on oppose classiquement les aspects mouchetes (orien- precipitation en milieu gelifie : immunodiffusion double selon la
tant vers des anti-ANS), aux aspects homogenes plus evocateurs d'an- methode d'Ouchterlony, ou electrosynerese (encore appele contre-
ticorps anti-ADN natif ou denature. Cependant, la technique d'lFI avoue immunoelectrophorese) en gel d'agarose. Cette procedure explique
certaines limites. En effet, I'aspect mouchete de la fluorescence n'est une ancienne denomination de certains antigenes, PL pour
pas toujours absolu : certains anti-ANS peuvent donner des aspects precipiting line [11 ]. L'identification des anti-ANS est basee sur la
nucleolaires, nucleaires, homogenes, voire meme cytoplasmiques (voir notion de continuite entre I'arc de precipitation du serum & etudier
articles specifiques de ce numero). et les arcs donn6s par des serums de reference de specificites
De plus, dans le lupus erythemateux dissemine (LES), les anti-ANS connues. Les tests en phase solide (Elisa, immunoempreintes, immu-
peuvent etre associes aux anti-ADN. La fluorescence homogene de nodot), dont certains sent commercialises, ne se pratiquent qu'en
ces derniers peut masquer I'aspect mouchete des anti-ANS. deuxieme intention.

60 RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-ao~t2006, N~384


Les connectivites : la place des anticorps antinucl~aires
La proliferation des tests a un coot economique. Cliniciens et biolo-
gistes sont convaincus de la necessite de standardiser la demarche
en proposant pour ce faire des algorithmes decisionnels elabores au
cours de conference de consensus et formalises dans des guides de
bonne pratique de prescription, constamment reactualises [4, 40, 41 ].
La methode ideale, sensible, specifique, & fortes valeur predictive
positive (VPP) et negative (VPN), precise, reproductible, facile & mettre
en oeuvre, rapidement disponible, ne necessitant pas un trop Iourd
appareillage, peu chronophage, et & faible coQt n'existe malheureu-
sement pas ['7, 40].
De plus, les exigences d'un laboratoire de biologie medicale
polyvalente, qu'il soit public ou liberal, ne sont pas les memes que
celle d'un laboratoire d'immunologie de CHU referent dans le domaine
de I'auto-immunite.
3.1. P r e c i p i t a t i o n e~ milieu gc~lifie
Les methodes de precipitation en milieu gentle permettent soit I'ana-
lyse qualitative d'un melange d'antigenes, soit le dosage immmuno-
chimique d'un antigene donne. Cela suppose que I'on ait des anticorps,
le plus souvent de nature polyclonale, qui soient precipitants, ce qui
est te plus souvent le cas des anti-ANS contenus dans le serum des
patients.
3.1.1. Immunodiffusion double d'Ouchterlony
Cette reaction mise au point par Ouchterlony consiste & deposer des
preparations d'antigenes et des anticorps (serums de patients) dans
des puits creuses en regard dans un gel d'agarose. Les molecules dif-
fusent uniquement en fonction de leur poids moleculaire et il se forme
des lignes de precipitation pour chaque systeme antigene-anticorps
aux zones d'equivalence respectives.
Cette methode permet, en disposant alternativement les serums
temoins et ceux & analyser au sein d'une rosace de six puits peri-
pheriques disposes autour d'un puits central contenant la solution anti-
genique, d'etudier les identites entre les differents constituants recon-
nus (figure 1).
Dans un gel d'agarose coule dans une bofte de Petri, I'extrait antigenique
(thymus de lapin) est depose dans le godet central du bas. Le serum du patient
(SP) est encadr6par deuxserumstemoins (un possedantun anticorpsanti-RNP
et un possedantun anti-Sm).I 'identit6completeavec le premieret I'eperonavec
le second arnr & la conclusionque ce patient possede un anticorps anti-RNP.
Lorsque deux serums deposes dans des puits adjacents reconnais-
sent le meme antigone de fa?on identique par les anticorps des
patients, les arcs de precipitation sont continus, car on a affaire & un
seul et meme systeme antigene-anticorps - on parle de reaction d'identite
RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-ao~t2006, N~384
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antigenique. Au contraire, Iorsque deux antigenes differents sont reconnus
par les anticorps de deux serums differents, on obtient I'image typique
de non-identite :les deux systemes antigene-anticorps sont totalement
distincts et donc les deux arcs de precipitation se developpent chacun
pour son propre compte et vont se croiser. Enfin, si la reconnaissance
n'est partagee que pour certains des epitopes, la situation est inter-
mediaire et il y aura formation d'un arc continu agremente d'un eperon
surajoute traduisant la presence dans le serum correspondant d'anticorps
reconnaissant d'autres epitopes supplementaires du meme systeme anti-
genique ; il s'agit alors d'une reaction d'identite partietle.
Cette methode est particulierement employee au laboratoire d'im-
munologie pour analyser les specificites anticorps de certains auto-
anticorps antinucleaires. Ses deux principaux avantages sont sa faci-
lite de mise en oeuvre et son faible coot. Elle a pour priincipaux
inconvenients de ne mettre en evidence que des anticorps precipitants,
de ne pas etre quantitative, de manquer de sensibilite et de necessi-
ter un delai de reponse long (48 & 72 heures). Avec cette technique,
seuls 8-40 % des LES ont des anticorps anti-Sm., mais seuls les lupus
en ont : methode historique, elle explique que I'anticorps anti-Sm soit
un des criteres de I'ACR [17].
Les deux parametres essentiels sont la qualite de la preparation
antigenique et celle des serums temoins utilises. La faible teneur en
antigene SS-A des extraits thymiques commerciaux impose d'utiliser
une deuxieme source antigenique, la rate de primate. Son inter-
pretation repose sur la parfaite identification des serums temoins
utilises (soit internationaux, disponibles aupres de ; Center for
Diseases Control, Atlanta, GA, 30333, I~tats-Unis, et Centre de
transfusion de la Croix Rouge hollandaise, Amsterdam, Pays-Bas,
soit commerciaux, soit internes). Pour les temoins internes, calibres
directement au debut, puis indirectement par la suite, vis-a-vis des
temoins internationaux, la regle de bonne pratique est d'utiliser un
serum clairement date, et non pas indifferemment n'importe quel
serum d'un patient, la serologie auto-immune de ce dernier risquant
de fluctuer avec le temps dans sa specificit&
De nombreux autres parametres influencent cette technique [34] :
- I'agarose dont la qualit6 et la concentration doivent etre testees
& chaque changement de lot ou de fournisseur. La sensibilite
peut en etre amelioree par I'addition de 2,5 % de PEG 6000
(polyethylene glycol) ;
- l e s conditions de diffusion : temps (24 & 48 heures), temperature
(ambiante), en chambre humide ;
- facteurs lies au serum :les precipitations non specifiques peuvent
etre eliminees par un bain en solution de citrate & 5 %.
Classiquement, on utilisait les proprietes de resistance therrnique et
enzymatique des antigenes pour identifier la specificite des anlicorps :
Iors d'un second test, le serum etait mis en presence d'un extrait
antigenique traite soit par la RNase, soit par la trypsine, soit par la
chaleur. En fonction de la persistance ou de ta disparition de I'arc apres
ces differents traitements, on parvenait a distinguer les trois principaux
types d'anti-ANS (tableau II) [15].
Tout arc detecte doit etre identifie, justifiant I'usage de techniques de
seconde intention.
61
Les connectivites : la place des anticorps antinucl6aires

3.1.2. L 'dlectrosyndr~se
L'electrosynerese, encore appelee contre-immunoelectrophorese
(CIEP), est une variante de I'immunodiffusion double dans laquelle
la migration de I'antigene vers I'anticorps est acceleree dans un champ
electrique, apres choix udicieux du pH de I'agarose ; ceci permet une
migration I'un vers I'autre de I'antig~ne, charge negativement, et de
I'anticorps charge positivement. D'apres les etudes de consensus des
experts europeens [4], elle est la plus sensible des techniques
d'immunodiffusion.
Cette technique est 10 & 20 fois plus sensible et beaucoup plus rapide
(delai de reponse en une journee) que I'immunodiffusion double [17].
L'anticorps migre vers la cathode (p61e negatif) en raison du courant
d'electro-endosmose, alors que le pHest choisi deliberement, & mi che-
min des pl respectifs, de telle sorte que I'antigene migre vers l'anode
(p61e positif) : il rencontre donc I'anticorps et forme un arc de preci-
pitation au niveau de la zone d'equivalence (figure 2). Cependant pour
certains antigenes moins negativement charges (Scl-70 par exemple),
les migrations de I'anticorps et de I'antigene peuvent se faire dans le
meme sens, et donc ne pas donner de ligne de precipitation. De meme,
certains anticorps anti-SS-B, qui ne reconnaissent que des epitopes
lineaires, peuvent manquer leur cible sur la proteine native [25].
Cette technique demande un materiel specifique (generateur, cuve)
et davantage de temps technicien. Dans une optique de tragabilite
(GBEA), la plaque de gelose peut etre deshydratee, fixee et coloree
afin d'etre conservee.

A B
C D
| |
HSE --

0
$t

T. bo~A o S - B

0
Dans cette technique d'immunoprecipitation en milieu gelifie, la migration de I'anticorps vers I'antigene est forcee et acceleree par un champ electrique. Dans la premiere
(~tape de depistage (2A et 2B), serums et sources antigeniques sont deposes dans des godets. Pour etre certain d'avoir tous les ANS d'interet, deux sources antigeniques
sont utilisees : thymus de lapin (RTE pour rabbit thymus extract) et rate humaine (HSE pour human spleen extract), avec chacune un serum temoin positif par serie (anti-
SS-B pour le thymus de lapin et anti-SS-A pour la rate humaine). Tout serum qui donne un arc subit alors I'r d'identification pour laquelle les extraits antigeniques sont
deposes dans une rigole en regard des godets recevant les serums (2C et 2D). Le dep6t de chaque serum est repete de telle fagon qu'il soit encadr~ par chacun des quatre
serums temoins (anti-Sm, anti-RN P, anti-SS-A et anti-SS-B) pour pouvoir conclure sur son identit&

62 Revue Francophene des Laboratoires, juiilet-ao~t 2006, N~ 384

Les connecfivites : la place des anticorps antinucleaires
Selon la matrice utilisee pour faire le schema de distribution, on peut
realiser une electrosynerese de depistage ou d'identification (figure 2).
Dans la premiere, les sources antigeniques (extrait thymique de lapin
et rate humaine) sont deposees dans des puits en regard des serums
& tester. Tout serum donnant un arc de precipitation, de quelque cete
que se soit, subit alors une electrosynerese d'identification darts laquelle
les mr extraits antigeniques sont disposes dans deux rigoles ver-
ticales auxquelles font face des puits dans lesquels on distribue les
serums & identifier soigneusement encadres par des serums temoins
de specificite connue. L'analyse repose la encore sur la continuite et
la non-continuite des arcs observes entre les serums temoins et les
serums inconnus. Dans cette technique, outre la qualite des prepara-
tions antigeniques, celle des serums temoins est bien entendu un para-
metre fondamental.
Contrairement a I'IDD et la CIEP qui reposent sur rimmunoprecipitation
en mileu gelifiee, rElisa est un test en phase solide qui ne necessite
pas que les autoanticorps & detecter soient precipitants. Detectant des
anticorps de faible affinite [24], il augmente la sensibilit6 [17]. Plus sen-
sible, il a comme inconvenient de diminuer la specificite des marqueurs
detectes et de dependre pour la pertinence des resultats de la qua-
lite de l'antigene utilise (perte des epitopes conformationnels possible)
[17],
Progressivement, les tests Elisa commerciaux ont supplante les tests
artisanaux pour des raisons de gain de temps, de facilite d'usage, d'as-
surance qualite et de coet. Seuls une quinzaine d'industriels ont fait
le choix d'investir la <<niche ,, de I'auto-immunite [8].
L'antigene connu est directement fixe au fond d'une plaque de 96 puits.
L'exces d'antigene libre est elimine par lavage et les sites de liaison resi-
duels du support non occupes par l'antigene sont bloques par un exces
de proteine etrangere et inerte pour prevenir toute fixation non speci-
fique ulterieure des immunoglobulines du serum. Cette derniere est mal-
gre tout mieux appreciee si on prend le soin de ne coupler I'antigene
qu'une colonne sur deux, ce qui permet de soustraire la DO lue dans
le puits non couple de celle du puits couple. Ceci est important car cer-
rains serums, avec une hypergammaglobulinemie polyclonale, une cryo-
globuline ou des facteurs rhumatdides, sont susceptibles de s'adsor-
ber sur le plastique malgre F'agent bloquant. Malheureusement peu ou
pas de plaques commerciales, proposent une telle configuration.
Apres incubation avec le serum & dilution adequate suivie de lavages,
I'antiglobuline couplee & une enzyme est ajoutee. Elle se fixe aux auto-
anticorps et est alors revelee par I'addition du substrat chromogenique
specifique de I'enzyme. Le substrat, incolore, est clive et donne un pro-
duit colore qui peut ~tre mesure par colorimetrie. La coloration est pro-
portionnelle & la quantite d'anticorps fixes, mais aussi & leur affinite.
Pour repondre aux deux inconvenients lids a la difficulte de disposer
d'antig@nes purs & 1 O0 % avec des epitopes conformationnels pre-
serves, on a developpe des Elisa de capture. Un anticorps, le plus sou-
vent monoclonal, dirige contre I'auto-antigene d'inter@t, est fixe au fond
du puits. La preparation antigenique, contenant I'auto-antigene avec
un degre de purete pas necessairement absolu, est incubee clans un
deuxieme temps. Seul I'auto-antigene est en principe retenu, et pourra
fixer les auto-anticorps Iors de I'incubation avec le serum du patient
& la seule condition que ces derniers ne soient pas exclusivement diri-
ges contre le seul epitope reconnu par I'anticorps de capture. La reve-
lation par un anti-serum anti-immunoglobulines humaines marque par
une enzyme puis I'action du substrat sont ensuite identiques, avec
comme precaution supplementaire I'adsorption du conjugue sur des
immunoglobulines de I'espece pourvoyeuse de I'anticorps de capture.
Un industriel propose une variante qui met & profit la tres forte avidite
du systeme avidine/biotine. La streptavidine remplace I'anticorps de
capture et I'antigene est biotinyle.
RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-aoQt2006, N~384
Article
L'utilisation de proteines recombinantes, ou de peptides synthetiques,
arme efficace contre les impuretes des antigenes purifies sources de
faux positifs, a comme inconvenient une possible perte d'epitopes
conformationnels secondaire aux modifications post-traductionnelles
defectueuses (glycosylation par exemple), sources cette fois de faux
negatifs [17].
Le choix du support et du mode d'immobilisation de I'antigene est ega-
lement un parametre & prendre en consideration tout comme la qua-
lite de la saturation des sites libres si on veut #viter une fixation non
specifique de proteines plasmatiques non concernees (facteurs rhu-
matdfdes, immunoglobulines monoclonales) [25].
Cette methode a cependant quelques avantages. Elle est facile
mettre en oeuvre. Elle permet I'analyse simultanee de grandes series
d'echantillon et est automatisable. Mais & I'inverse, elle n'est pas
adaptee aux demandes trop ponctuelles. Elle permet de quantifier
les anticorps avec une grande precision [17], ce qui peut avoir un
interr dans le suivi des patients [37]. Elle rend les resultats en
UI/mL s'il existe un serum de reference (uniquement pour les anti-
ADNn) ou en unites arbitraires dans le cas contraire. En fonction
de la nature du conjugue, elle peut differencier les isotypes des
auto-anticorps au sein d'une reponse polyclonale. Cependant, eu
egard aux nombreux parametres influengant la reaction, il est impe-
ratif de toujours incorporer une gamme d'etalonnage dans chaque
serie, et de ne comparer des resultats de serums successifs que
s'ils ont ete obtenus dans les memes conditions, c'est-&-dire dans
la m~me serie.
Pour pouvoir 6tre certain de la specificite des auto-anticorps detec-
tes, I'antigene couple dolt presenter une purete et une homogeneite
parfaite et son immunoreactivite doit ~tre preservee. Autrement dit, les
epitopes conformationnels, seulement exposes sur la proteine native
telle qu'on la trouve dans les tissus et qu'elle y est detectable par IFI,
doivent etre preserves par les methodes de purification ou apparaftre
sur la proteine recombinante si I'obtention de I'antigene a recours au
genie genetique.
Une etude comparative de differents Elisa monospecifiques en 1999
[36] retrouvait un defaut de sensibilite global pour la detection des anti-
corps anti-Sm et anti-ADNn quel que soit le fabricant. II etait egale-
merit fait mention de faux positifs lids a une IgG monoclonale & acti-
rite cryoprecipitante.
II reste encore des efforts & faire par les industriets pour ameliorer la
reproductibilite d'un lot & I'autre. Les grandes series comparatiw.~s mon-
trent bien que les tests Elisa commerciaux ne sont pas encore inter-
changeables en terme d'exactitude, de reproductibilite, de sensibilite
et de specificite [8, 13, 36]. La bonne pratique reste ainsi de passer
les serums historiques pour comparaison avec le serum du jour [37].
II Nest donc pas recommande d'utiliser en premiere intention des tests
Elisa, que I'antigene soit un extrait brut de cellules HEp-2 ou un
melange d'antigenes [t 3]. II est meme prouve qu'une telle approche
peut ignorer des anticorps a. haute valeur diagnostique facilement iden-
tifiables par IFI, comme les anticorps anti-centromeres, et 6tre han-
dicapee par des niveaux de sensibilite differents pour les anl:igenes
regroupes dans la cupule [16].
Pour ce qui est de la determination de la specificite des anticorlos anti-
ANS, deux types de strategie sont proposees par les firmes com-
merciales : des plaques dediees & une seule specificite ou des plaques
permettant pour un seul serum de rechercher les 4 ~. 6 specificites les
plus courantes. Cette plaque de type ,, profil >,est mieux adaptee au
caractere ponctuel des demandes. Une barette de huit cupules peut
suffire par malade, ce d'autant plus qu'il n'est pas necessaire de faire
une gamme d'etalonnage, mais seulement deux temoins, positif et
negatif : en effet en matiere d'anti-ANS seul un resultat qualitatif
importe. Des Elisa de detection sont aussi proposes qui couplent au
fond du puits un melange des six specificites.
63
Les connectivites : la place des anticorps antinucl6aires

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12 34

Le principe de la technique est decrit dans le texte. Uinterpretation des profils de bandes se fait par rapport & une gamme de proteines de poids
moleculaires connus (&&). 8B : specificite anti-Sm, & droite profil anti-Sm schematise, & gauche, profil de serums pathologiques anti-Sm ; 1 & 4, serums
revelant fortement le doublet BB' (28, 29 kD) et la bande D (16 kD), et plus faiblement la bande E (13 kD) de fa?on inconstante ; 5, serum humain
normal ; 8C : specificite anti-RNP, & droite profil anti-RNP schematise, & gauche, profil de serums pathologiques anti-RNP ; 1, serum humain
normal ; 2 et 3, serums revelant la bande 68 kD ; 4 et 5 serums revelant la bande 68 kD et faiblement le doublet lAB' (28, 29 kD), le serum 4
rev&le une bande suppl~mentaire & 17,5 kD dont la signification est inconnue. 3D : specificite anti-SS-B, & droite profil anti-SS-B schematis~,
& gauche, profil de serums pathologiques anti-SS-B ; 1, serum humain normal ; 2 & 8, serums revelant les bandes 50 et 43 kD ; serum 9 bis-
pecifique SSB + Sm revelant les bandes 50 et 43 kD, le doublet BB' (28, 29 kD) et la bande D (16 kD). ;31: : specificite anti-Scl-70, & droite
profil anti-Scl-70 schematise, & gauche, profil de serums pathologiques anti-Scl-?O ; 1, serum humain normal ; 2, melange de serums de reference
anti-Sm, anti-SS-B et anti-Scl-?O utilise comme etalon interne Iors de chaque revelation, permettant la construction de la droite d'etalonnage ; 3 &
6, serums revelant les trois bandes 90, 82 et ?0 kD, parfois dedoubles. Certains de ces serums revelent en outre des bandes diverses non iden-
tifiees ; ;31= : specificite anti-PCNA (proliferating cell nuclear antigen) et anti-Jo-1, & droite profil anti-PCNA et anti-Jo-1 schematise, & gauche,
orefil de serums pathologiques anti-PCNA et anti-Jo-1 ; 1, serum humain normal ; 2, anti-PCNA revelant les bandes 90, 87 et 35 kD ; 3 et 4,
!
serums anti-Jo-1 revelant les bandes ,52 et 39 Kd.

64 Revue Francophone des Laboratoires, juillet-ao0t 2006, N~ 384


Les connectivites : la place des anticorps antinucl#aires
Le western blot consiste & separer dans un premier temps des pro-
teines en solution selon leur poids moleculaire par une methode
appelee SDS-PAGE (pour sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
gel electrophoresis). Pour ce faire, on les soumet & une migration
en gel de polyacrylamide apres les avoir traitees par du sodium dode-
cyl sulfate qui a pour but de les charger toutes negativement, de telle
sorte que le seul parametre qui va influencer leur migration dans les
mailles du gel de polyacrylamide va etre leur taille. En faisant varier
le degre de reticulation du gel (exprime en pourcentage de poly-
acrylamide), on fait varier les gammes de poids moleculaires etudies.
Les proteines apparaissent sous forme de bandes horizontales, dont
la distance de migration, par rapport au bord superieur du gel oO
s'effectue le depet de I'echantillon, est proportionnelle au poids
moleculaire, que I'on peut alors determiner par comparaison avec une
gamme etalon (figure 3).
Apres transfert des proteines du gel vers une feuille de nitrocellulose,
on va pouvoir visualiser ces bandes par une reaction d'immunomar-
quage directe (revelation par un anticorps marque par une enzyme)
ou indirecte (incubation prealable avec le serum du patient, puis avec
un antiserum anti-immunoglobulines humaines marque).
Cette methode tres sensible est couramment utilisee, dans sa version
indirecte, pour identifier dans le serum des patients, des anticorps diri-
ges contre des antigenes dont on connak le poids moleculaire. Darts
sa variete ,, artisanale >,, elle reste du domaine du laboratoire specia-
lise. Les extraits antigeniques sont le plus souvent prepares & partir de
thymus d'animaux (veau ou lapin), de rate humaine, ou pour certains
laboratoires d'extraits nucleaires ou cytoplasmiques de cellules humaines
cultivees in vitro (cellules HeLa, par exemple).
Deux difficultes oberent la diffusion de cette technique [41] :
- la difficulte d'interpretation quand existe une multiplicite de bandes
de poids moleculaires proches : elle requiere une grande experience
de lecture (ex autour de 100 kD pour Sc1-70) ;
- la perte d'antigenicite par denaturation liee au SDS : les etapes de
denaturation necessaire font perdre la reactivite vis-a-vis des epitopes
conformationnels (SS-A) [41].
Un faible nombre de societe commercialise de veritables immu-
noempreintes. La plupart se contente d'immunodot (figure 4), dans
lesquels des antigenes purifies sont deposes & egale distance sur des
bandes de nitrocellulose, sous forme de t&ches (dot) ou de bandes"
I'information sur la presence d'anti-ANS de specificite inconnue
(profil de bandes inhabituel) est par construction perdue.
~q
~.i)-
ii:i~i!'?? ~,tN1<,.'-&
t L'avantage de cette technologie est de pouvoir analyser simultane-
! ment un grand nombre de parametres sur un meme echantillon.
SS S ~
ii 9 ; ~ i; 9 ! :I,~ ~,
Le principe est decrit dans le texte Exempled'immunodotcommercial(Innolia|
distribue par InGen| permettantla detection des anti-ANS en se ref~rant& une
bandelettecontrele presentee& droite avec Ies treize specificit~s d6tectables.
RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-ao0t2006, N~384
Article
L'immunodot, comme toute methode immunoenzymologique, neces-
site du biologiste une parfaite connaissance de tousles parametres
du test commercial utilise [30] : ceux-ci devraient donc etre affiches
clairement dans les notices d'accompagnement, que ce soient :
- la nature de I'antigene : natif purifie par methode physico-chimique
ou par immunoaffinite, recombinant ou synthetique ;
- la nature du conjugu& II est illusoire de rechercher un auto-anticorps
monoclonal de classe IgM a activite antinucleaire, evenement pas si
exceptionnel que cela [29], avec la plupart des tests commerciaux
dont le conjugue est un anti-serum anti-chafne y. De meme, par
construction les rares tests qui utilisent de la proteine A comme mar-
queur des immunoglobulines humaines ignorent la reponse autoim-
mune d'isotype IgG3 [30].
La bonne connaissance de tous ces parametres permet au biologiste
d'elucider des resultats en apparence contradictoires, comme par exemple
la mise en evidence d'anticorps anti-ribosomes non-P avec un aspect
typique de fluorescence de type anti-ribosomes alors que le dot (sur lequel
ne sont deposees que des proteines ribosomes P) est negatif
Cette technique est particuli~rement adaptee aux situations d'urgence
(qui relevent plus des vascularites avec anticorps anti-cytoplasme des
polynucleaires neutrophiles ou anti-membrane basale glomerulaire) et
aux demandes ponctuelles : pour beaucoup de laboratoires clui n'ont
pas le debit suffisant, il est impensable d'investir dans une plaque Elisa
anti-Jolde 96 puits.
3.4. La t e c h n o l o g i e du m u l t i p l e x a g e ( L u m i n e x ':~:)
L'inflation des autoanticorps d'interet, conjuguee & la reduction legale
du temps de travail, est I'argument rnajeur qui plaide pour I'implan-
tation de techniques automatisees pour la serologie auto-immune.
A cete de I'Elisa classique qui peut etre automatise integralement
ou sous forme modulaire (dilution, distribution, incubation, lavage,
lecture), est apparue ces demieres annees la technologie du mul-
tiplexage, developpee par la firme Luminex r & partir du principe de
la cytometrie en flux.
Ce systeme analytique repose sur trois elements [22] : des microbilles
de polystyrene, des marqueurs fluorescents et un fluorim~tre en flux.
La combinaison de dix niveaux de concentration d'un fluorochrome
orange et d'un fluorochrome rouge genere 100 types de billes de cou-
leurs differentes. Sur ces billes des fonctions carboxyliques permet-
tent de coupler de maniere covalente des molecules d'interet porteuses
de groupement amine. En serologie autoimmune, un autoantigene dif-
ferent est couple par type de bille, permettant ta capture d'autant d'au-
toanticorps qui seront reveles par un antiserum anti-immunoglobulines
humaines couple a un troisieme fluorochrorne different des deux uti-
lises pour marquer les billes. Le fluorimetre est equipe de deux lasers
de Iongueurs d'onde differentes dont les faisceaux frappent la veine
liquide dans laquelle circule le flux unitaire des billes. II s'agit du prin-
cipe de la cytometrie en flux o~ des billes remplacent les cellules. Le
laser rouge identifie les billes (donc l'auto-antigene), le laser vert mesure
la quantite de conjugue, donc la quantite d'autoanticorps fixes.
En matiere de detection des anticorps anti-ANS, les quatre firmes
presentes sur le marche frangais (par ordre alphabetique : BioRad |
avec le BioplexTM2200, BMD | avec FidisTM, Inova| distribue par
Menarini | avec le QuantaPlexTM et Zeus | distribue par InGen | avec
le systeme AtheNA Multi-lyteTM) proposent un ou plusieurs panels
de detection [23].
Le gain de temps se retrouve que ce soit vis-a-vis de I'immunodiffusion
(contraction des deux etapes de depistage et d'identification en une
seule) et de I'Elisa (pas d'etape de chromogenese). Les prerequis sur
la qualite de I'antigene couple restent cependant les memes que pour
65
 Les connectivites : la place des anticorps antinucl#aires

Lineaire Forte specificit6 Faible sensibilite

Analyse simultanee de plusieurs antigenes Interpretation subjective
Identification de nouveaux antigenes Volume de serum important
Serums temoins fiables
CIEP ou electrosynerese Conformationnel Ben marche Faible sensibilite
Lineaire Forte specificit6 Interpretation subjective
Analyse simultanee de plusieurs antigenes Volume de serum assez important
Delai moins long que IDD Serums temoins fiables
Identification de nouveaux antigenes
Elisa Conformationnel (& voir) Automatise Faux positifs possibles
Lineaire Moins operateur dependant Co0teux
Quantification possible Ignore les antigenes inconnus
Delai rapide de reponse
Forte sensibilite Moindre specificite
Determination possible des isotypes
Immunoempreintes Lineaire Perte des epitopes conformationels (SSA)
Bonne specificite Faible sensibilite
Identification de nouveaux antigenes Chronophage
Multiplexage Conformationnel (& voir) Automatise Ignore les antigenes inconnus
Lineaire Delai rapide de reponse
Analyse simultanee de plusieurs antigenes
Quantification possible
IDD : immunodiffusiondouble ; CIEP : contreimmunoelectrophorese; Elisa : enzymelinked immunosorbentassay.

I'Elisa et I'immunodot. Toutes ces techniques en phase solide ne peu-
vent repondre qu'& ]a <<question posee ,, (tableau 11I) : un autoanticorps
diriges centre un autoantigene autre que ceux couples & une bille sera
ignore, ce qui n'est pas le cas avec I'IFI et I'immunodiffusion [30].
Contrairement & I'IDD ou les immunoempreintes qui identifient le couple
antigene-anticorps soit par comparaison avec des temoins de speci-
ficite connue, soit par le poids moleculaire, I'immunodot et le multi-
plexage sent dans I'incapacite de faire la part des choses entre anti-
gene et impurete [6].
- une association & une maladie (SS-A, SS-B),
- l e s premieres lettres du hem du patient dans le serum duquel il a
ete isole la premiere lois (Sm, Re, La, Jo, Ki...).
La complexite vient de la possibilite de designation d'un meme anticorps
par plusieurs acronymes (anti-SS-A et anti-Re, anti-SS-B et anti-La).
Le tableau IV regroupe les principaux antigenes cibles. En pratique
courante, six d'entre eux sent recherches : Sm, RNP, SS-A, SS-B, Jo-
1 et Scl-70 [44].

4. Les specificites antigeniques

des ANS
Une des difficultes dans le domaine des anticorps antinucleaires, et plus CIEP 29 99 - 64
particulierement des anti-ANS, provient de leur nomenclature avec la mul- Elisa 61 80-93 75-91
tiplication possible de designations pour un meme anticorps. Outre la pres- Anti-SSB/La IDD 15 99 90
cription generique qui peut se faire, nous I'avons dej& vu, sous les vocables CIEP 14 99 81
anti-ANS (version fran?aise), anti-ENA (version anglo-saxonne, et abso- Elisa 27-35 88-9.7 73-90
lument pas dirigee centre notre haute administration) ou anti-ECT (ver- Anti-Sm IDD 17-35 99-100 89-100
sion methodologique & proscrire desormais), la definition de chaque anti- CIEP i 1-56 98-t00 90-100
Elisa 34-45 88-100 73-100
corps peut renvoyer & differents parametres [32] qui sent:
Anti-U1-RNP IDD t7-30 8?-99 31-90
- I'aspect de fluorescence (homogene, mouchete),
C IEP 8-35 83-99 37-57
- la Iocalisation cellulaire (centromeres, nucleolaire), Elisa 39-64 84~97 70-95
- un organite (UlsnRNP, ribosomes), IDD : immunodiffusiondouble ; CIEP : contreimmunoelectropher~se; Elisa ; enzyme
- une proteine partiellement identifiee (Scl-70), linked immunosorbentassay ; RNP : ribonucleoproteine; VPP :valeur prediGtive
- une cible moleculaire identifiee (ADNn, topoisomerase 1), )ositive.

66 RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-aoQt2006, N~384

Les connecfivites : la place des anticorps antinucl~aires
Les antigenes Sm et RNP sont des proteines constitutives des com-
plexes ribenuoleoproteiques [2]. Elles font partie des snRNP (pour small
nuclear ribonucleoprotein). Ces proteines sont au nombre d'une dizaine,
inegalement reparties dans les differents UsnRN R Ces snRN Pont un
rele dans I'epissage des ARN premessagers (excision des introns) et
dans le transport des ARN messagers. Elles sont constituees de petits
ARN nucleaires riches en uridine, appeles UsnRNP (U1, U2, U4, U5 et
U6) associes a un ensemble de proteines. Dans les snRNP ce sont les
proteines qui sont les cibles des auto-anticorps, et non I'ARN.
4.1.1. L 'antigdne Sm et les anticorps anti-Sm
L'antigene Sm (pour Smith, nom de la malade initiale de Hardin chez
lequel I'antigene a ete decouvert par Tan et Kunkel en 1966 [43])
reconnaft les snRNP U1, U2, U4, U5 et U6, possedant en commun
les proteines BB', D, E, F et G. Le doublet BB' (28 et 29 kD) et la
bande D (16 kD) sont les plus caracteristiques (figure 3t2). Mais B/B'
seul n'est pas synonyme de Sm (car retrouve aussi dans RNP), & la
difference de D seul [41].
L'anticorps anti-Sm est quasi pathognomonique du LES mais sa fie-
quence est variable selon les populations de lupiques etudiees
- 30 % aux I~tats-Unis, car plus frequents chez les Noirs [17],
- 5-15 % chez les Caucasdl'des europeens,
- la presence de I'anticorps anti-Sm est associ~e & la nephrite lupique,
les atteintes pulmonaires et du systeme nerveux central, la pericardite,
et les alleles HLA-DR2 et-DQw6 [43].
Son absence n'exclut donc pas le diagnostic [13].
L'anti-Sm est rarement isole, le plus souvent associe & I'anticorps anti-
RNP [7]
4.1.2. L'antig~ne RNP et les anticorps anti-RNP
Decrit par Mattioli et Reichlin en 1971 [43], I'antigene RNP a ete ini-
tialement caracterise par sa thermostabilite et sa sensibilite & la ribo-
nuclease (cf supra). II existe deux types d'anticorps anti-RNP [43].
9 Les anticorps anti-snRNP
Les etudes par immunoempreintes d~finissent la specificite RN P des
anti-snRNP par la reconnaissance de proteines de 68, 33 (A) et 28
(C) kD (figure 3c). Celles-ci ne sont presentes que sur les U1 sn RNP,
et donc contrairement aux anticorps anti-Sm, les anti-RN P ne reagis-
sent qu'avec les U1 sn RNR
Environ une vingtaine de snRN P sont decrites, qui participent & I'epis-
sage du precurseur du mARN [43].
Selon les proteines reconnues, deux types d'anti-snRNP sont indivi-
dualises :
- des anticorps dits ,, complets ,, qui reagissent avec les trois pro-
teines suscitees, et faiblement le doublet BB' ;
- des anticorps dits ,, incomplets ,>qui reagissent seulement avec une
ou deux des trois proteines caracteristiques, et eventuellement le dou-
blet BB'.
Les auto-anticorps anti-RN P complets representent un marqueur spe-
cifique de la connectivite mixte, ou syndrome de Sharp, puisque fai-
sant partie des criteres de diagnostic.
Sous leur forme incomplete, on les retrouve plus volontiers dans
d'autres connectivites (LES, sclerodermie systemique, syndrome de
Gougerot-Sjegren), mais avec une frequence faible et souvent asso-
cies & d'autres anticorps anti-ANS.
9 Les anticorps anti-rRNP
Les anti-rRNP sont & la frontiere des ANS. Appeles anti-ribosomes,
ils sont diriges contre des phosphoproteines (PO, P1 et P2 de 38, 19
RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-aotit2006, N~384
Article
et 18 kD), dont I'association preferentielle aux formes neurolosychia-
triques de lupus fait I'objet de debats [12]. Leur caracterisation repose
sur un aspect de fluorescence typique (voir article de Gilles Renier).
IIs sont egalement precipitants et peuvent donner des arcs de pre-
cipitation en IDD et CIEP.
4 2. Le.:, a:",tig,-mos S S A ~t S L i t
4.2.1. L 'antig~ne SS-A et les anticorps anti-SS-A
I 'anticorps anti-SS-A a 6te initialement decrit par Clark en 1969, sous
le nom d'anti-Ro d'apres les initiales du premier malade, puis - rede-
couvert ,, en 1926 par Alspaugh et Madison sous le nom d'anti-SS-A,
faisant reference & la pathologie associee (antigene A du syndrome sec)
: I'identite de ces deux anticorps a ete affirmee en 1979 [43].
Les anticorps anti-SS-A sont bien detectes par ClEP, a condition de
prendre de la rate comme source antigenique [41 ]. Le taux moyen de
detection est de 45 % [4]
II ne faut pas ne pas hesiter & rechercher specifiquement les anticorps
anti-SS-A, car environ 9 % d'entre eux sont negatifs en IFI et positifs
en IDD. Ceci etait d'autant plus le casque I'lFI utilisait comme sub-
strat des tissus de rongeur dans lesquels I'antigene SS-A est peu
represent&
C'est le plus frequent des anticorps anti-ANS, mais c'est aussi le plus
difficile & mettre en evidence, pour les raisons evoquees precedem-
ment. Pour pallier aux difficultes de I'IFI, une societe propose des lames
de cellules HEp-2 transfectees par le gene du SS-A de 60kr) [6].
L'antigene Ro a ~te initialement isole d'extrait de rate humaine et carac-
terise par reaction de precipitation en gel par des anticorps de :serums
lupiques. Parce que les autoanticorps reconnaissent des epitopes
conformationnels, I'immunoempreinte est souvent prise en defaut pour
les detecter [3, 4]
L'antigene SS-A fait partie, comme les antigenes Sm et RNP, de com-
plexes ribonucleoproteiques II est constitue de deux proteines de
60 et 52 kD sans reactivite croisee, complexees & de petits ARN appe-
les hY ARN (Y1, Y2, Y3, Y4 et Y5) (hY pour human cytoplasmic). II
existe une courte sequence d'homologie entre une proteine d'enve-
Ioppe de la nucleocapside du virus de la stomatite vesiculeuse et I'an-
tigene SS-A 60 kD. La question de la pertinence clinique des anticorps
anti-SSNRo52 isoles fait debat [9], en dehors de leur association avec
les anticorps anti-Jo-1 (cf infra). Ces YARN appartiennent & une vaste
famille d'ARN denommes scRNP (pour small cytoplasmic ribonu-
cleoproteins). Le rele biologique de ces complexes n'est pas claire-
ment defini mais il semblerait intervenir dans la regulation de la tra-
duction de I'ARN messager. De meme que les antigenes RNP et Sm,
les determinants reconnus par les anticorps anti-SS-A se situent sur
les proteines et non sur les ARN. L'antigene SS-A est de Iocalisation
nucleaire et cytoplasmique, dans des proportions variant avec le cycle
cellulaire, mais aussi avec I'espece animale (peu represente en dehors
des primates). L'antigene SS-A est peu abondant dans les cellules.
On estime que sa quantite represente environ le dixieme de la quan-
tite des antigenes Sm et SS-B.
Du fait de cette faible abondance, de la variabilite d'expression en fonc-
tion de I'espece, et de I'importance du mode de fixation des cellules,
la recherche d'anticorps anti-SS-A par IFI peut etre faussement nega-
tive. II est preferable d'utiliser des lames fixees par I'acetone et non
par le methanol [13]. L'information sur le mode fixation doit etre four-
nie par I'industriel
Les anticorps anti-SS-A sont retrouves dans le syndrome de Gougerot-
Sjegren primitif avecla plus grande frequence : 60 a 95 %, selon les
auteurs et la methode utilisee. L'association aux anticorps anti-SS-B
est alors tres frequente.
67
Les connectivites : la place des anticorps antinucleaires
Dans le LES, la frequence des anticorps anti-SS-A varie de 15 & 35 %.
IIs sont dans cette circonstance, frequemment associes aux anticorps
anti-SS-B. Les patients lupiques atteints de lupus porteurs d'anticorps
anti-SS-A presenteraient plus souvent une photosensibilisation, une
anemie hemolytique, des facteurs rhumatdl'des, des atteintes pulmo-
naires et renales et un syndrome de Gougerot-Sjegren. La photo-
sensibilisation s'expliquerait par I'exposition membranaire sur les kera-
tinocytes de I'antigene SS-A induite par les ultra-violets [43].
En dehors du LES et du syndrome de Gougerot-Sjegren, les anticorps
anti-SS-A sent retrouves avec une frequence eleve dans plusieurs
entite cliniques :
- le lupus cutane subaigu (70 %) : ils se fixeraient sur les cellules
basales epidermiques et pourraient jouer un rele dans la pathogenie
de la maladie;
- le lupus neo-natal : it est observe en moyenne une fois sur vingt gros-
sesses lupiques, chez des patientes porteuses d'anticorps anti-SS-A.
Cette forme de lupus est Nee au passage transplacentaire des IgG
maternelles anti-SS-A. Elle peut entrainer chez I'enfant un bloc auriculo-
ventriculaire complet, accompagne d'un rash cutan& Cette anomalie
peut se voir chez des nouveau-nes de meres atteintes d'une autre
connectivite, voire cliniquement normale, mais avec anticorps anti-
SS-A. Le tissu de conduction cardiaque serait fiche en un antigene
proche ou identique a. I'antig~ne SS-A sur lequel se fixent les anticorps
anti-SS-A maternels [43]. II faut faire la recherche conjointe des anti-
corps anti-SS-A et anti-SS-B chez la mere et I'enfant [?].
D'autres syndromes cliniques peuvent etre associes aux anticorps
anti-SS-A : syndromes lupiques des deficits en fractions 0 2 et C4 du
complement, cirrhose biliaire primitive et hepatite chronique active.
L'anticorps anti-SS-A se retrouve plus fr~quemment chez les sujets
porteurs des alleles HLA DQ1/DQ2.
4.2.2. L 'antig~ne SS-B et les anticorps anti-SS-B
Decrit initialement par Mattioli et Reichlin en 1974 sous le nom de La
(nom du premier patient), puis en 1976 par Alspaugh et Madison
sous le nom de SS-B faisant reference & la pathologie associee (anti-
gene B du syndrome sec), son identite a ete affirmee en 1979 [43].
L'anticorps anti-SS-B seul est tres rare ; il est presque toujours asso-
cie & I'anticorps anti-SS-A et les deux antigenes sont associes aux
memes hyRNA [7].
L'antigr La ou SS-B est une proteine phosphorylee de 45 & 50 kD,
intervenant dans la maturation des ARN transcrits par I'ARN poly-
merase III, c'est-a.-dire I'ARN ribosomal, les ARN de transfert et les Y
ARN. L'antigene SS-B existe sous deux formes : un complexe forme
de la proteine La associee & des ARN, ou un complexe avec la pro-
teine Ro et les hY ARN [14]. Sa Iocalisation est essentiellement
nucleaire. Les anticorps reconnaissent en immunoempreintes la pro-
teine native de 50 kD.
Moins frequent que I'anticorps anti-SS-A, I'anticorps anti-SS-B ne se
rencontre que dans deux pathologies : le syndrome de Gougerot-
Sj0gren et le LES. II apparait plus specifique du syndrome de
Gougerot-SjSgren primitif o0 il est retrouve chez 50 % des patients.
Dans le LES, les anticorps anti-SS-B sont presents dans 5 & 15 %
des cas, souvent associes aux anticorps anti-SS-A. Cette association
est liee & I'allr HLA-DR3, alors que la presence isolee d'anti-SS-A
est plutet associee & I'allele HLA-DR2 [44].
4 3. ~/a.~q:M~'; 3:;; ; (': :;: } ; ? , : t c o r p s ~nti-.Sc 170
II a ete decrit initialement par Douvas en 1979 [43]. Les anticorps anti-
Scl-?0 ne sont pas detectes en CIEP par 50 % des participants dans
une etude europeenne [41] : une des raisons en est la fragilite de I'an-
tigene & - 2 0 ~
88
L'antigene Scl-70 a ete defini par precipitation d'extrait cellulaire
thymique & l'aide de serum de patients atteints de sclerodermie. Les
etudes initiales par electrophorese en gel de polyacrylamide lui attri-
buaient un poids moleculaire de 70 kD. On sait desormais qu'il s'agit
de la topoisomerase I, proteine de 100 kD, intervenant dans la relaxa-
tion de la forme condense de I'ADN. Cette proteine est sensible & I'ac-
tion de proteases qui la scindent en fragments de 70 et 86 kD [42].
Les anticorps anti-Scl-70 sont specifiques de la sclerodermie syste-
mique. Leur frequence varie de 20 & 80 % en fonction des ethnies et
des methodes de detection.
Classiquement la presence d'anticorps anti-Scl-70 exclut celle des
anticorps anti-centrom~res, retrouves clans une forme Iocalisee de scle-
rodermie, le syndrome CREST (voir article de Danielle Degenne).
L'association est cependant possible, quoique tr6s rare.
4 4 , Les anti~:o~ps assm< ( s .s.c;x ~ }Lr
in.lan m a t o i r e s [18, 21, 26, 38, 39]
Les autoanticorps associes aux myosites correspondent aux autoan-
ticorps du syndrome des anti-synthetases (Jo-1, PL-?, PL-12, EJ, O J)
et aux autoanticorps anti-Mi-2, anti-SRP (voir article de Gilles Renier),
anti-PM-Scl et anti-Ku.
Leurs cibles sont nucleaires ou cytoplasmiques. Les autoanticorps ne
sont jamais associes, definissant le plus souvent un sous-groupe de
maladie. Globalement 90 % des myosites s'accompagnent d'un
autoanticorps.
Ces myopathies inflammatoires sont rares (2,18 & 7,? cas pour 106)
avee une plus forte prevalence chez la femme (sex ratio de 2 pour 1)
et les sujets noirs. On observe deux pics de frequence a 35-44 ans
et 55-64 ans. Le diagnostic repose sur la biopsie.
4.4.1. L 'antig~ne Jo-1 et les anticorps anti-Jo-1 [18]
L'antigene Jo-1 (d'apres les initiales du prenom (John) du patient chez
lequel I'anticorps a ete initialement decrit par Nishikai et Reichlin [43]
sous le nom de PL-1 est de Iocalisation cytoplasmique. II est consti-
tue par I'histidyl transferase, enzyme de 50 kD permettant sous forme
dimere la fixation de I'histidine sur son ARN de transfert Bien que spe-
cifiques des polymyosites (PM) et des dermatomyosites (DM), les anti-
corps anti-Jo-1 sont peu frequents : on ne les retrouve que dans 20-
30 % des PM, 60 % des PM avec flbrose pulmonaire, 5-10 % des
DM, (figure 5).
Anticorps anti-Jo-1
Le syndromedes anti-synth~tasesne representeque 30 o/0des myosites,ce qui
expliquela faible frequence de I'anticorps anti-Jo-l.
RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-ao6t2006, N~384

Les connectivites : la place des anticorps antinucl&aires
IIs semblent s'associer avec une frequence significative A une com-
plication severe des polymyosites, la fibrose pulmonaire interstitielle
diffuse. C'est un marqueur de plutSt mauvais pronostic [18].
D'autres tARN-synthetases cibles ont ete decrites qui font parler de
syndrome des anti-synthetases (threonine pour I'anticorps anti-PL-7,
alanine pour I'anticorps anti-PL-12, glycine pour I'anticorps EJ, iso-
leucine pour I'anticorps OJ ). Comme pour I'anticorps anti-Jo-1 I'epi-
tope reconnu est conformationnel. Les signes cliniques sont un syn-
drome de Raynaud, des mains de mecanicien, une fibrose pulmonaire
[39].
Suspecte sur I'aspect en fluorescence, le diagnostic est desormais
confirme par un immunodot specifique, qui Iorsqu'il est multiple
retrouve frequemment des anticorps anti-SS-A/Ro 52 avec les anti-
corps anti-Jo-l.
4.4.2. AntigOne Mi-2 et anticorps anti-Mi-2 [38]
Initialement decrit en 1976 par Reichlin et Mattioli par fixation du com-
plement, et nomme avec les lettres initiales du nom du donneur, cet
antigene a vite ete subdivise en deux entites :
- Mi-1 : proteine nucleaire basique non histone de 150 kD. Les anti-
corps anti-Mi-1 sont presents chez 5-10 % des PM ou DM, mais aussi
chez les patients lupiques (9 %) ;
- Mi-2 : complexe proteique de la famille des helicases (proteine
CHD : chromodomain helicase DNA binding protein impliquee dans
la reparation, la recombinaison et la transcription de I'ADN), dont le
gene est sur le chromosome 12. L'IFI est nucleaire finement mouchetee
et la confirmation se fait par immunodot. On le trouve dans 6 & 33 %
des DM, qui n'ont pas les signes cliniques du syndrome des anti-
synthetases. C'est un marqueur de plut6t bon pronostic, quoique des
syndromes paraneoplasiques soient possibles [38]. L'anticorps anti-
Mi-2 est un marqueur specifique de la dermatomyosite, peu sensible :
20 o/0 des DM, 5 % des myosites. ,~, I'inverse, 950/o des patients avec
un anti-Mi-2 ont une DM. [43]
4.4.3. L'antigdne PM-Scl et les anticorps anti-PM-Scl [21 ]
La description de I'anficorps sous le nom d'anti-PM1 remonte ~ 1977
par Wolfe dans des syndromes de chevauchement polymysite/scle-
rodermie, puis sous celui de PM-Scl en 1984 par Reichlin.
C'est un antigene multiproteique nucleaire resistant aux acides et &
la chaleur, sensible & la trypsine [43]. II est constitue de 11 & 16 pro-
teines de 20 & 110 kD qui interviendraient dans la maturation et le
transport des ribosomes.
L'aspect en I FI est caracteristique (voir article specifique) et la confir-
mation peut se faire par IDD et I~lisa.
La presence de cet anticorps est associee & HLA-DR3, une fatigue
musculaire, une sclerodactylie, un phenomene de Raynaud. C'est un
marqueur de plutet bon pronostic
4.4.4. L'antigdne Ku et les anticorps anti-Ku [26]
Decrits separement en 1981 par deux auteurs japonais, Mimori et Tojo,
qui nommerent leur anticorps & partir du nom du patient (Ku et Ki res-
pectivement), I'usage a retenu le nom cl'anti-Ku.
L'antigene est une proteine kinase DNAdependante, dimere de 70 et
80 kD, qui participe A la phosphorylation de facteur de transcription
(RNApolymerase Iet II), & I'initiation de la transcritpion, mais aussi &
la reparation, replication de I'ADN, & la proliferation cellulaire.
En I FI, I'aspect est nucleaire A renforcement nucleolaire :la technique
de reference pour sa caracterisation est l'immunoprecipitation.
L'anticorps est associe au syndrome de chevauchement PM/sclero-
dermie (55 o/0), au LES (10 o/0), au syndrome de Gougerot-Sjegren
[43].
RevueFrancophonedes Laboratoires,juillet-aoClt2006, N~384
Article
Leur detection a une importance diagnostique car certains sont des
marqueurs de maladie : anti-UlsnRNP/Sharp, anti-Sm/LES, anti-
PMScl/scleromyosite, anti-Mi2/dermatomyosite
Un autre interet des anticorps anti-ANS est leur caractere predictif [19]
pour les formes paucisymptomatiques de maladie, voire limitees & une
seule atteinte d'organe : un syndrome de Raynaud isole sans anticorps
anti-ANS a une forte probabiNte de rester isole; avec un anticoi'ps anti-
Sc1-70 il faut craindre I'evolution vers une sclerodermie [27]. C:ela pre-
suppose que les anticorps precedent les manifestations clinques, ce
qui est souvent le cas [1].
6. Strategie de depistage
La fiabilite, I'exactitude, la reproductibilite des resultats dans le champ
de la serologie autoimmune, et plus particulierement des anti-ANS
repose sur une politique d'assurance qualite qui s'appuie sur la main-
tenance des outils diagnostiques, la regularite des contreles qualitY,
I'entrainement, l'expertise technique et I'apprentissage des nouveaux
marqueurs [4].
La principale difficulte rencontree dans leur utilisation vient de la dispo-
nibilite de methodes de sensibilites differentes [43]. La reponse anti-ANS
est une reponse polyclonale : elle sera differemment mise en evidence
par les differents types de tests ( IFI, IDD, lelisa) (tableau III) [5, 13].
Compte tenu de sa sensibilite tres elevee, I'IFI reste la methode de
premiere intention, meme si certains voudraient s'en passer ['.20]. Un
resultat negatif rend le diagnostic de LES peu probable, alors qu'un
resultat positif impose un complement d'investigation pour la
recherche d'anticorps anti-ANS [33].
En pratique quotidienne, on ne dolt rechercher des anticorps anti-ANS
chez des patients sans AAN en IFI, que si il existe signes cliniques evo-
cateurs [40], et ne rechercher que les specificites utiles & la classifi-
cation du patient (U1 snRNP, Sm, SS-A, SS-B, Jol, Scl70,CENP-B,
ribosomeP, nucleosome) sans depasser une determination cle spe-
cificite par an sauf modification clinique [32].
Des etudes comparatives comme celle de Rondeel et coil [31] confir-
ment que la strategie de detection des AAN dolt etre faite en cascade
en commen?ant par une technique sensible (I'IFI) suivie d'une deuxieme
methode specifique pour determiner la nature de la cible auto-anti-
genique. Dans leurs mains, la VPP de I'IDD s'est revelee superieure
& celle de I'Elisa qui par ailleurs etait la plus onereuse. Paradoxalement,
alors que les cliniciens continuent & prescrire la recherche d'AAN, ces
auteurs font etat du peu de casque ce r(~sultat avait dans leur stra-
tegie diagnostique, ce qui peut s'expliquer par le faible apport de ce
dosage quand la probabilite pre-test est faible.
Plusieurs etudes europeennes multicentriques de consensus [4, 8, 25]
ont montre une progression des performances diagnostiques des labo-
ratoires enreles alors qu'au fil des campagnes (4), le nombre de ces
derniers et celui des auto-anticorps testes augmentaient. Ces experts
s'accordent sur la necessite des standards de reference, et I'utilisa-
tion d'au moins deux techniques [3, 41].
La strategie de detection adoptee au laboratoire est la suivante : depis-
tage par IFI suivi en premiere intention par une electrosynerese, puis
par un immunodot si necessaire. Le declenchement de la recherche
des anticorps anti-ANS et anti-ADNn se fait si les AAN sont cle titre
superieur & 1/500 ou si il existe une motivation clinique. Elle est proche
de celle presentee par Tampoia [35] ; seul diffr le titre seuil (1/160
pour lui), ce qui conduit & une diminution des prescriptions de premiere
intention des anticorps anti-ADNn de 21,4 % et de 19 % pour les anti-
corps anti-ANS.
69
Les connecfivites : la place des anticorps antinucl&aires
p lus que partout en immunologie, il est important pour la qualite du
rendu des r6sultats de la recherche des anticorps anti-ANS de tra-
vaJller en etroite collaboration avec les cliniciens [24], et de bien conna~'tre
les limites des techniques employees [7]. La bonne connaissance des
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tests utilises est indispensable & une interpretation pertinente des resul-
tats obtenus, si I'on ne veut pas aboutir ~. des erreurs diagnostiques, ~.
des therapeutiques inappropriees et au final ~t des depenses de sante
indues [13]. Plus le clinicien est biologiquement instruit, meilleure est la
pertinence diagnostique du test [8]. La complexite generee par la mul-
tiplication des auto-anticorps justifie I'existence d'algorithmes decision-
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