CHAPITRE 3 : CONTAMINATION DES CULTURES

Cinq types de contamination possibles : Par des virus, par des bactéries, par des
mycoplasmes, par des champignons et des levures, par des cellules étrangères. Les
contaminations peuvent être exogènes ou endogènes.

1. Origine des contaminations

a. Dans les tissus ou organes d’où proviennent les cellules

Les contaminations peuvent provenir des tissus ou des organes d’où proviennent les
cellules lors de la primo-explantation. Cela est souvent le cas avec les virus pour lesquels on
observe beaucoup de cellules infectées par des contaminations latentes. Le virus est alors
endogène. C’est un phénomène tout à fait commun.
Plusieurs virus peuvent être trouvés dans une même primo-explantation. Des virus ont été
trouvés dans des cultures de cellules humaines, de singe, de lapin, de poulet, de canard, de
souris, de chien, de chat, de hamster, de cheval et de porc.

b. Dans les réactifs biologiques utilisés

Ces contaminants peuvent être aussi apportés par les réactifs biologiques utilisés. Tels que
le sérum (notamment celui effectué par mélange de très nombreux prélèvements) ou le
sang. Donc, la contamination peut se faire au moment du prélèvement.

c. L’expérimentateur

L’expérimentateur peut, lui aussi, être à l’origine des contaminations. Cette contamination
est proportionnelle aux nombres de manipulations et au temps de culture. Cela peut être dû
au non-respect des consignes, au matériel mal stérilisé (de nos jours on utilise de plus en
plus du matériel jetable donc risque moins important) et aussi au bain-marie (il faut penser à
bien laisser le couvercle ouvert sous peine de contamination bactérienne dû à l’humidité sur
le bouchon).

d. L’environnement

L’environnement peut aussi apporter des contaminants. C’est pour cela qu’il est important
de bien choisir l’emplacement de la salle de culture. Il faut éviter les lieux de passages pour
éviter la circulation de l’air. Ainsi la porte mais aussi les fenêtres doivent être fermées
(système automatique de fermeture des portes).

2. Nature des contaminations

a. Les contaminations par les virus

Pour les virus, la contamination peut être endogène ou exogène à la cellule. Il peut exister
sous deux formes.
La première, sous forme latente, non infectieuse. Le génome peut être ainsi intégré ou
épisomique. Il y a alors une relation d’équilibre avec la cellule hôte avec destruction
cellulaire minime (a ce moment la pas de symptome visible). Il y a alors, dans ce cas, une
absence de symptômes. Cela peut être difficile à observer car pas de signe évident
d’infections des cellules.
La deuxième forme, infectieuse permanente, comporte une réplication active du virus où
celui-ci est très productif. Lors de la forme infectieuse permanente, il y a des mécanismes
d’échappement à la réponse immune. L’échappement peut se faire premièrement par la
baisse des MHC (complexes majeurs d’histocompatibilité) dans les cellules infectées. Les
cellules sont alors non reconnues par les cellules T ce qui permet au virus d’être très actif.
L’échappement peut aussi se faire par infection dans des sites immunoprivilégiés comme le
cerveau ou par l’infection avant l’immunocompétence foetale.

Exemple des bovins: les fœtus des bovins ne sont immunocompétents qu’après 90 à 120
jours de gestation (sur 280). Si l’infection a lieu avant cette période de 120 jours alors il y a
une immunotolérance aux virus. Le virus est alors considéré comme faisant partie du “soi”.
Chez les bovins, au moins 17 virus différents sont capables d'infecter le fœtus.
La contamination peut aussi se faire lors de l’allaitement dû à leur haute perméabilité
intestinale.

b. Les contaminations par les bactéries

Bien souvent, les contaminations bactériennes sont dues à des bacilles Gram négatifs qui
sont résistants aux antibiotiques ajoutés à la culture. Le milieu se trouble rapidement donc,
contrairement au virus, cela est facilement visible. Dans ce cas, les cellules meurent, il faut
jeter les boîtes.

c. Les contaminations par les mycoplasmes

i. Introduction

Les Mycoplasmes sont des bactéries particulières mises en évidence en 1956 par Robinson
et son équipe. Elles ont comme particularité de se multiplier dans le cytosol des cellules
infectées. De plus, elles sont plus petites que les bactéries classiques (environ 1/10ème de
leurs tailles). Elles ne produisent pas de turbidité car se multipliant à l’intérieur des cellules.
Aussi, elles sont résistantes à de nombreux antibiotiques. Et, elles sont souples (car elles
n’ont pas de paroi) et passent à travers les filtres 0,22 µm. L’infection à ces bactéries est
plus “sournoise” car elle ne se voit pas.

ii. Étendue de l’infection des cultures cellulaires par les mycoplasmes

L'incidence des Mycoplasmes sur les cultures est de 15 à 35 % pour les cultures en continu
et de 1 % pour les cultures primaires.
Parmi les Mycoplasmes principalement retrouvés, 98 % des souches contaminantes
appartiennent à ces 5 espèces :Mycoplasma orale, Acholeplasma laidlawii, M. hyorhinis, M.
arginini et M. salivarium.

iii. Effets de l’infection par les mycoplasmes

Les effets généraux des Mycoplasmes sur les cultures cellulaires sont principalement:
- l’altération des niveaux de protéines avec des effets sur la synthèse de l’ARN et
l’ADN
 - l’altération du métabolisme cellulaire
- l’induction d'aberrations chromosomiques
- le changement de la composition de la membrane cellulaire (au niveaux des
antigènes, de l’expression des récepteurs)
- l’activation ou l’inhibiton des lymphocytes
- l’induction et l’inhibition de cytokines
- l’augmentation ou la diminution de la propagation virale s’il y a co-infection avec un
virus
- etc..

Sources: Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection,

elimination, prevention, Hans G. Drexler∗ & Cord C. Uphoff Cytotechnology 39: 75–90, 2002

iv. Méthodes de détection des mycoplasmes en culture cellulaire

Il existe de nombreuses méthodes utilisées pour détecter les Mycoplasmes

en culture. Souvent, 2 méthodes différentes sont utilisées pour augmenter la
valeur diagnostique du test.
La méthode la plus facile (classiquement réalisée en TP) est la recherche
d’ADN extra-nucléaire. Pour ce faire, on utilise des marqueurs fluorescents
de l’ADN (en TP on utilise par exemple le Hoechst 33.258). La méthode n’est
pas spécifique au Mycoplasmes et peut détecter d’autres parasites
intracellulaires. (Figure 1: cellules infectées Figure 2: cellules saines : aucun
marquage extranucléaire)

On peut utiliser des cellules indicatrices. L’efficacité diagnostique du test

monte alors à 98%. Les cellules indicatrices sont des cellules très sensibles à
la présence des Mycoplasmes.
Protocole :
Inoculer 15 000 cellules indicatrices 3T6 dans une BP 60 mm (avec une
lamelle de verre au fond) dans 5 ml de milieu. L'échantillon inconnu (0,1 ml) est inoculé 24h
(les cellules vont incubers et se multipliers) plus tard et incubé pour une période
supplémentaire de 4 jours. Puis on effectue une détection par la coloration de l’ADN
extranucléaire avec par exemple du DAPI ou HOECHST. On prend une lamelle de verre car
au bout de 4 jours on peut la sortir et l’observer bcp plus facilement au microscope que la
boite de pétri 60mm.

Une autre méthode consiste à utiliser le 6-méthylpurine désoxyriboside (6MPDR). C’est un

agent non toxique qui en présence de Mycoplasmes (et notamment de l’adénosine
phosphorylase) transforme le 6MPDR en un métabolite toxique qui tue les cellules. Il
possède une efficacité de détection de 96,6%. Il y a aussi possibilité d’utiliser les 3T6
comme cellules indicatrices.

Il existe aussi des kits ELISA, nombreux dans le commerce. Avec des anticorps contre les
principaux membres des genres Mycoplasma et Acholeplasma (M. arginini, M. hyorhinis, M.
orale, A. laidlawii) avec une bonne sensibilité (104 à 107 CFU/ml). On peut aussi utiliser la
PCR.
Classiquement, lorsqu’une lignée de cellules arrive au laboratoire, il y a en premier lieu une
mise en quarantaine de celle-ci pour éviter une contamination par les Mycoplasmes d’autres
incubateurs. On effectue ensuite un premier test pour détecter les Mycoplasmes. Si c’est
négatif, c’est une culture stérile qu’on peut utiliser comme les autres. Si positif, on l’élimine.

Pour des cultures en continu, elles sont présumés stériles mais, néanmoins, il faut de temps
en temps rechercher des Mycoplasmes

d. Les contaminations par les champignons

Les cellules peuvent aussi être contaminées par des champignons (des levures ou
moisissures). Si on aperçoit la contamination à un stade précoce (et les cellules sont encore
vivantes), on peut rincer et traiter par antifongiques. Les spores sont amenées en général
par l’air ambiant, germent dans l’eau tiède des bacs des incubateurs (ici les cellules sont
mortes)

e. Les contaminations par des cellules étrangères

La contamination par des cellules étrangères peut avoir lieu s’il y a utilisation d’un même
milieu pour différentes lignées cellulaires.