CHAPITRE 3 : CONTAMINATION DES CULTURES

Chimiques ou biologiques

1- Sources générales des contaminations.

2- Nature des contaminations.
21- Les contaminations par des protozoaires et invertébrés.
22- Les contaminations par les bactéries.
23- Les contaminations par les bactéries.
24- Les contaminations par les mycoplasmes.
25- Les contaminations par les champignons.
26- Les contaminations par des cellules étrangères.

Contaminations chimiques, biologiques.

Cinq types de contamination possibles : Par des virus, par des bactéries, par des
mycoplasmes, par des champignons et des levures, par des cellules étrangères. Les
contaminations peuvent être exogènes ou endogènes.

Contaminations chimiques :
• Produits non vivants ayant un effet indésirable sur la culture cellulaire.
• Ions métalliques, endotoxines, et autres impuretés du milieu, du sérum ou de l’eau.
• Qualité du plastique jetable (pétris, tubes, bouteilles).
• Radicaux libres et peroxyde d’hydrogène présents dans le milieu causé par la phto-
activation du tryptophane, la riboflavine ou l’herpès par exposition à la lumière.
L’ammoniaque dans le cas de la dégradation de la L-glutamine.
• Résidu de germicides ou pesticides utilisés lorsqu’on désinfecte les incubateurs,
comptoirs ou autres instruments.
• Impureté de CO2 de l’incubateur.

Contaminations biologiques :
• Par des protozoaires ou des invertébrés
• Par des virus
• Par des bactéries
• Par des mycoplasmes
• Par des champignons
• Par des cellules étrangères

Endogène : le contaminant est déjà présent

Exogène : on introduit le contaminant

1. Sources générales des contaminations

a. Dans les tissus ou organes d’où proviennent les cellules

Les contaminations peuvent provenir des tissus ou des organes d’où proviennent les cellules
lors de la primo-explantation. Cela est souvent le cas avec les virus pour lesquels on observe
beaucoup de cellules infectées par des contaminations latentes (endogènes). Le virus est
alors endogène. C’est un phénomène tout à fait commun.
Plusieurs virus peuvent être trouvés dans une même primo-explantation. Des virus ont été
trouvés dans des cultures de cellules humaines, de singe, de lapin, de poulet, de canard, de
souris, de chien, de chat, de hamster, de cheval et de porc.

b. Dans les réactifs biologiques utilisés

Ces contaminants peuvent être aussi apportés par les réactifs biologiques utilisés. Tels que
le sérum (notamment celui effectué par mélange de très nombreux prélèvements) ou le sang.
Donc, la contamination peut se faire au moment du prélèvement (matières fécales, matériels
ou autres).
Contamination par mélange à la fabrication.

c. L’expérimentateur

L’expérimentateur peut, lui aussi, être à l’origine des contaminations. Cette contamination
est proportionnelle aux nombres de manipulations et au temps de culture. Cela peut être dû
au non-respect des consignes (ports de souliers, vêtements, cheveux, maladie, ne pas
passer au-dessus des flacons ouverts), au matériel mal stérilisé (de nos jours on utilise de
plus en plus du matériel jetable donc risque moins important) et aussi au bain-marie (il faut
penser à bien laisser le couvercle ouvert sous peine de contamination bactérienne dû à
l’humidité sur le bouchon).
Il est donc important de tenir le labo le plus propre possible : microscope, hotte, incubateurs,
bain-marie.

d. L’environnement

L’environnement peut aussi apporter des contaminants. C’est pour cela qu’il est important
de bien choisir l’emplacement de la salle de culture. Il faut éviter les lieux de passages pour
éviter la circulation de l’air dans les bâtiments (poussières, saletés). Ainsi la porte mais aussi
les fenêtres doivent être fermées (système automatique de fermeture des portes).

e. Précautions à prendre contre les contaminations en général

̵ Manipuler sous une hotte stérile (filtre)
̵ Lavage des mains et des avant-bras
̵ Pas de bijoux
̵ Porter des gants
̵ Ne pas préparer de grandes quantités de milieu, garder une réserve
̵ Ne pas pipeter à la bouche
̵ Alcool 70% avant et après utilisation, UV après utilisation
̵ Ne pas ouvrir les fenêtres
̵ Pas de robinets dans la pièce car les siphons sont des nids à microbes
̵ Nettoyage régulier, désinfection.

2. Les contaminants biologiques

a. Les protozoaires
La plupart sont unicellulaires, tel que les amibes, d’autre peuvent former des spores.
Certains ont un effet cytopathique (cellules détruites en moins de 10 jours).
Les sources sont de contamination par les protozoaires sont : poussière, saleté, air,
occasionnellement des tissus (tissu de gorge).

b. Les invertébrés

Sont des araignées ou des insectes (mites).

Source : boîtes de cartons, pieds, chariot.

c. Les contaminations par les virus

Pour les virus, la contamination peut être endogène ou exogène à la cellule. Il peut exister
sous deux formes.
La première, sous forme latente, non infectieuse. Le génome peut être ainsi intégré ou
épisomique. Il y a alors une relation d’équilibre avec la cellule hôte avec destruction cellulaire
minime (a ce moment la pas de symptome visible). Il y a alors, dans ce cas, une absence de
symptômes. Cela peut être difficile à observer car pas de signe évident d’infections des
cellules.
La deuxième forme, infectieuse permanente, comporte une réplication active du virus où celui-
ci est très productif. Lors de la forme infectieuse permanente, il y a des mécanismes
d’échappement à la réponse immune. L’échappement peut se faire premièrement par la
baisse des MHC (complexes majeurs d’histocompatibilité) dans les cellules infectées. Les
cellules sont alors non reconnues par les cellules T ce qui permet au virus d’être très actif.
L’échappement peut aussi se faire par infection dans des sites immunoprivilégiés comme le
cerveau ou par l’infection avant l’immunocompétence foetale.

Exemple des bovins: les fœtus des bovins ne sont immunocompétents qu’après 90 à 120
jours de gestation (sur 280). Si l’infection a lieu avant cette période de 120 jours alors il y a
une immunotolérance aux virus. Le virus est alors considéré comme faisant partie du “soi”.
Chez les bovins, au moins 17 virus différents sont capables d'infecter le fœtus.
La contamination peut aussi se faire lors de l’allaitement dû à leur haute perméabilité
intestinale.

d. Les contaminations par les bactéries

Bien souvent, les contaminations bactériennes sont dues à des bacilles Gram négatifs qui
sont résistants aux antibiotiques ajoutés à la culture. Le milieu se trouble rapidement donc,
contrairement au virus, cela est facilement visible. Dans ce cas, les cellules meurent, il faut
jeter les boîtes.
Les signes d’une contamination bactérienne : sont mobiles, aux formes définies, poussent
rapidement, baisse du pH du milieu, augmentation de la turbidité.
Les bactéries anaérobies poussent bcp plus lentement.

e. Les contaminations par les mycoplasmes

i. Introduction
Les Mycoplasmes sont des bactéries particulières mises en évidence en 1956 par Robinson
et son équipe. Se sont des procaryotes de 0.15 à 0.8 micromètre de diamètre. Elles ont
comme particularité de se multiplier dans le cytosol des cellules infectées. De plus, elles sont
plus petites que les bactéries classiques (environ 1/10ème de leurs tailles). Elles ne
produisent pas de turbidité car se répliquant à l’intérieur des cellules de façon indépendante.
Aussi, elles sont résistantes à de nombreux antibiotiques. Et, elles sont souples car elles n’ont
pas de paroi cellulaire et passent à travers les filtres 0,22 µm. L’infection à ces bactéries est
plus “sournoise” car elle ne se voit pas.
Leur ADN est circulaire et riche en adénine et en thymidine.
Elles poussent à forte densité 10^7 à 10^9 colony forming units/ml.
Enfin elles sont résistantes à plusieurs ATB et à la congélation/décongélation.

ii. Sources de contaminations par les mycoplasmes

Les sources principales sont la flore orale humaine, les bactéries en supsension dans l’air,
aérosol soit sous la hotte ou par les incubateurs, le sérum animal, le milieu et les diverses
solutions.

La contamination se propage aussi par des nouvelles cultures cellulaires provenant des
fournisseurs : DA (food and drug administration) 15%, Bionique Testing Laboratories 11%,
Microbiological Associates 13%, ATCC 14%.
Toutes les expériences faites avec des cellules contaminées peuvent être caduques ou
biaisées par ces contaminations.

iii. Étendue de l’infection des cultures cellulaires par les mycoplasmes

L'incidence des Mycoplasmes sur les cultures est de 15 à 35 % pour les cultures en continu
et de 1 % pour les cultures primaires.
Parmi les Mycoplasmes principalement retrouvés, 98 % des souches contaminantes
appartiennent à ces 5 espèces : Mycoplasma orale, Acholeplasma laidlawii, M. hyorhinis, M.
arginini et M. salivarium.

De plus 80% des mycoplasmes sont résistants à la gentamicine, 15% à la ciprofloxacine, 28%
à la lincomycine, 21% à la Tyrosine.

iv. Effets de l’infection par les mycoplasmes

Les effets généraux des Mycoplasmes sur les cultures cellulaires sont principalement:
- l’altération des niveaux de protéines avec des effets sur la synthèse de l’ARN et l’ADN
- l’altération du métabolisme cellulaire
- l’induction d'aberrations chromosomiques
- le changement de la composition de la membrane cellulaire (au niveaux des antigènes,
de l’expression des récepteurs)
- l’activation ou l’inhibiton des lymphocytes
- l’induction et l’inhibition de cytokines
- l’augmentation ou la diminution de la propagation virale s’il y a co-infection avec un
virus
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v. Méthodes de détection des mycoplasmes en culture cellulaire

Il existe de nombreuses méthodes utilisées pour détecter les Mycoplasmes en

culture. Souvent, 2 méthodes différentes sont utilisées pour augmenter la
valeur diagnostique du test.
La méthode la plus facile (classiquement réalisée en TP) est la recherche
d’ADN extra-nucléaire. Pour ce faire, on utilise des marqueurs fluorescents
de l’ADN (en TP on utilise par exemple le Hoechst 33.258). La méthode n’est
pas spécifique au Mycoplasmes et peut détecter d’autres parasites
intracellulaires. (Figure 1: cellules infectées Figure 2: cellules saines : aucun
marquage extranucléaire)

Hoechst = colorant perméables

Si on a de l’ADN en dehors du noyau = contamination (image du haut)

Cellules indicatrices = parfaites hôtes.

On peut utiliser des cellules indicatrices. L’efficacité diagnostique du test monte alors à
98%. Les cellules indicatrices sont des cellules très sensibles à la présence des
Mycoplasmes.
Protocole :
Inoculer 15 000 cellules indicatrices 3T6 dans une BP 60 mm (avec une lamelle de verre au
fond) dans 5 ml de milieu. L'échantillon inconnu (0,1 ml) est inoculé 24h (les cellules vont
incubers et se multipliers) plus tard et incubé pour une période supplémentaire de 4 jours.
Puis on effectue une détection par la coloration de l’ADN extranucléaire avec par exemple
du DAPI ou HOECHST ou acridine orange. On prend une lamelle de verre car au bout de 4
jours on peut la sortir et l’observer bcp plus facilement au microscope que la boite de pétri
60mm.

Une autre méthode consiste à utiliser le 6-méthylpurine désoxyriboside (6MPDR). C’est un

agent non toxique qui en présence de Mycoplasmes (et notamment de l’adénosine
phosphorylase) transforme le 6MPDR en un métabolite toxique qui tue les cellules. Il
possède une efficacité de détection de 96,6%. Il y a aussi possibilité d’utiliser les 3T6
comme cellules indicatrices.

Il existe aussi des kits ELISA, nombreux dans le commerce. Avec des anticorps contre les
principaux membres des genres Mycoplasma et Acholeplasma (M. arginini, M. hyorhinis, M.
orale, A. laidlawii) avec une bonne sensibilité (104 à 107 CFU/ml). On peut aussi utiliser la
PCR.

Il existe aussi de nombreux kits disponibles dans le commerce, par PCR. Très sensible,
spécifique et rapide.
Classiquement, lorsqu’une lignée de cellules arrive au laboratoire, il y a en premier lieu une
mise en quarantaine de celle-ci pour éviter une contamination par les Mycoplasmes d’autres
incubateurs. On effectue ensuite un premier test pour détecter les Mycoplasmes. Si c’est
négatif, c’est une culture stérile qu’on peut utiliser comme les autres. Si positif, on l’élimine.

Pour des cultures en continu, elles sont présumés stériles mais, néanmoins, il faut de temps
en temps rechercher des Mycoplasmes

vi. Traitements

Plusieurs compagnies développent des produits d’élimination :

• Plasmocin (InvivoGen) 25ug/ml pendant 2 semaines
• Mynox (Minerva Biolab) • Ciprofloxacin : 10 jours à 10ug/ml (Bayer)
• Clean Cell
• Mycoplasma-Ex et Biomyc-3 (Promokine)

Attention aux traitements :

Risque de les retrouvés dans les cultures.
Plus il y a d’utilisateurs et de lignées différentes, plus le risque de contamination est
important.

f. Les contaminations par les champignons

Les cellules peuvent aussi être contaminées par des champignons (des levures ou
moisissures). Si on aperçoit la contamination à un stade précoce (et les cellules sont encore
vivantes), on peut rincer et traiter par antifongiques. Les spores sont amenées en général
par l’air ambiant, germent dans l’eau tiède des bacs des incubateurs (ici les cellules sont
mortes)

g. Les contaminations par des cellules étrangères

La contamination par des cellules étrangères peut avoir lieu s’il y a utilisation d’un même
milieu pour différentes lignées cellulaires.

Des chercheurs ont démontré qu’environ 25% des cellules humaines sont contaminées par
les cellules de types HeLa.

Prévention :
- N’utiliser qu’une bouteille de milieu par lignée cellulaire Même chose pour la trypsine,
PBS...
- Bien désinfecter la hotte entre chaque type cellulaire
- Idéalement, on suggère d’attendre 20 minutes entre chaque type cellulaire
- Utilisez des filtres sur le pipette-aid